血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
析的分离效果起关键作用。 流动相只在层析过程中推动固定相上待分离的物质朝着一
定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱 剂。它也是层析中的重要影响因素之一。
并使各组分以不同速度移动，从而的到分离。
实验原理
层析法的特点：
➢具有极高的分辨效力 ➢具有极高的分析效率 ➢具有极高的灵敏度
➢应用广泛
影响凝胶柱层析的主要原因有？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应 均匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液， 目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于 待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变 性的缓冲液都可用于凝胶层析。
③加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分 级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分 离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%-25%.
④ 凝 胶 再 生 ： 葡 聚 糖 凝 胶 再 生 使 用 NaOH （ 0.2M ） 和 NaCl(0.5M)混合液处理。
2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用 毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层析分离效果。固定好 层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。 将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的 聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高即关闭出水口。
30kD)
●蛋白质纯化过程中的除盐
常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25
●蛋白质分子量的测定
●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否
实验原理
按动相形式不同：液相层析和气相层析。
按操作形式不同：柱层析（凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析），平面层析（纸层析，
薄层层析，薄膜层析）。
柱层析是目前最常用的层析类型
实验原理
hadexG交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用 英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为 每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200为每克干胶吸水20克。交联葡聚 糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分布范围。
样品浓度
▲目的蛋白的浓度最好低于10mg/ml
▲目的蛋白在样品中的含量如果不高， 可以数倍或数十倍的样品量上样 （ 以不超过柱结合蛋白的饱和水平为界限）
实验目的
掌握要点 （1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本原理 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
试剂
一、葡聚糖凝胶Sephadex G-25
Cl- +
+ Cl-
+ ClCl- +
高盐
等电点（pI,isoelectric point）
等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子 的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液 的pH称为该氨基酸的等电点。
两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正 负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。
当外界溶液的pH大于两性离子的pl值，两性离子释放质子带 负电。
当外界溶液的pH小于两性离子的pl值，两性离子质子化带正 电。
离子交换层析装置
亲和层析（ affinity chromatography）
是蛋白质分离纯化的最有效方法之一 有时一步纯化即可完成纯化工作
基本原理
亲和层析是利用一些生物分子和其配基之间有特 殊的 亲合力，如抗原和抗体、酶蛋白和辅酶等，它 们在一定条件下能结合为复合物。如果能将复合物 中的一方固定在固相载体上，就可从溶液中纯化另 一方
分离依据：蛋白质所带电荷
阴离子交换分离示意图1
蛋 白
样
品
If pH mobile phase =7.2
Then charge of the proteins:
(-) (-) (+) (+)
合样
的品 情与 况阴
离 子 交 换 剂 结
+
+
+
+ +
-+
+
-
--
-
++
-
+
+ +
缓冲液洗脱
蛋
阴离子交换分离示意图2
血红蛋白与核黄素的 凝胶层析分离
——Sephadex G-25凝胶层析
主讲人： 曹子昂 小组成员：努尔麦麦提 蔡青照
祖力皮卡尔
讲解流程
一
背景及意义
二 实验原理及目的
三
试剂和仪器
四
操作步骤
五
讨论
背景
色谱法(层析法)（chromatography）是由俄国化学 家茨维特于1903年创建的。他将含有叶绿素的石油 醚提取液通过装有氯化钙的柱子，发现叶绿素被分 为不同颜色的区带，故将此法称为色谱法 （chromatography） Chromatography这个词字面意思是“color writing”
实验原理
一、层析技术
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是
利层用混析合法物是中近各代组生分物的物化理学化最学常性用质的的分差别析，方使法各之组一分，以不 同程运度用分这布种在方两法个相可中以：分离性质极相似，而用一般化
固学定方相法由难层以析分介离质的组成各，种可化以合是物固，体如或液各体种。氨这基些酸物、质能 与核待分苷离酸的糖化、合蛋物白进质行可等逆。的吸附、溶解与交换作用，对层
实验原理
凝胶层析原理
优点
分离条件温和 回收率高 重复性好 设备简单
缺点 对样品的稀释大 上样量小 流速慢 操作费时
凝胶过滤层析的介质
葡聚糖凝胶:以葡聚糖为基本骨架，含大量羟基，亲水性高
交联丙烯基葡聚糖凝胶:刚性极强，流速高,不溶于所有的溶剂
凝胶过滤层析的用途
●分离分子量相差较大的蛋白质(至少差20-
实验原理
凝胶层析又称凝胶排阻、分子筛等
(一）原理：分子筛作用 （二）凝胶层析介质：交联葡聚糖、交联琼脂糖凝胶、 丙稀酰胺琼脂等。 （三）特点：(1)、操作条件温和，不会引起生物大分 子的变性失活；(2)凝胶层析柱可反复使用，每次洗脱 过程即是凝胶的再生过程；(3)、实验具有高度的重复 性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备， 亦可用于小样品的分析。 （四）应用：(1)脱盐；(2)高分子溶液的浓缩；(3)蛋 白质分子量的测定；(4)生物大分子的分离提纯。 （五）缺点：上样体积较小，仅占柱床体积的2~5%。 样品浓度会发生数倍稀释。
白 样
品
If pH mobile phase =7.2
+
Then charge of the proteins:
(-) (-) (+) (+)
-+
+
+
-
-
+
Cl- + +Cl-
+ Cl- + +
+
+ --
- Na+ Na+ +
-
Na+ Na+
Na+
-
Na+
Na+
Na+
氯化钠梯度洗Na+脱
低盐
Cl- + + Cl-
柱层析
柱的形状对分离的影响
装柱
柱体垂直固定，关闭柱的出口，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液 ↓
沿柱一侧将离子交换剂搅拌均匀，缓慢并连续地注入柱内
↓
静置至交换剂全部沉下，柱上部的液体变清
平衡柱与上样量 平衡 用至少10个柱体积的缓冲液洗柱
上样量 上样量与目的蛋白的浓度及其与 交换剂的结和能力有关。
凝胶颗粒粗细对流速的影响
试剂
二、血红蛋白与核黄素
红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一 种蛋白质(缩写为HB或HGB)。是使血液 呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成， 两条α链和两条β链，每一条链有一个包 含一个铁原子的环状血红素。氧气结合 在铁原子上，被血液运输。血红蛋白的 特性是：在氧含量高的地方，容易与氧 结合；在氧含量低的地方，又容易与氧 分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞 具有运输氧的功能。
马丁（Martin
辛格（Synge）
）1941年 色谱塔板理论， 液-液分配色谱
1952年 诺贝尔化学奖
意义
色谱法的应用
◆分离各种生物大分子（蛋白质、核酸、多糖、多肽）
◆分离生物的初级代谢产物（如氨基酸、核苷酸、有 机酸、脂肪酸）和次级代谢产物（如糖苷、色素、 生物碱、萜类）等
色谱法是基因工程下游工作中最主要的纯化方法
5、加样与洗脱
打开平衡好的层析柱底部出口，使柱内溶液流至与床表 面相切时关闭出口。将吸有0.5ml样品的加样滴管在床表 面上1cm处沿管内壁轻轻转动加样。加完后，打开底端出 口使样品流至床表面。关闭出口，用少量洗脱液同样小心 清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面。然后将洗脱液加 至距床表面2~3cm高，接上高位槽并调好流速即开始洗脱。 注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入液体，防止冲坏床表 面，影响分辨率。
利用大换层析法
分样离品原中的理蛋白质借所带的电荷与离子交换剂
的反电荷结合，在高离子强度的盐（氯化钠）洗 脱时，离子交换剂上结合的蛋白质可与洗脱液中 的Na+或Cl-离子发生交换而被洗脱到溶液中。由 于不同的蛋白质所带的电荷不同，它们与离子交 换剂的结合能力的强弱也不同，故被洗脱到溶液 中的顺序也不同，从而可被分离开来
色谱发展简史
背景
茨维特（Tswett）
1901年 色谱法
柱中有颜色的色带叫做 色谱（chromatogram）
背景
1912年 纸色谱 Nobel Prize in 1915
创导研究生物化学的第一个人
威尔斯泰特
（Willstätter）
背景
1938年 薄层色谱法
伊兹麦洛瓦 （Izmailov）
背景
3、装柱
将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的溶液搅拌成悬浮液， 自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm 左右时，缓缓打开底端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬 液直至凝胶沉积至25cm高度为止。操作中注意防止气泡与 节痕产生。
4、平衡
装好后，使层析床稳定5~10分钟，然后接上高位槽， 打开出口活塞，调节高位槽的高度，控制流速为 1ml/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析 床稳定。 操作过程中应特别注意：(1)在平衡与洗脱时要将高 位槽至层析柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速； (2)恒压高位槽内玻璃管底端口与柱底端口之差不能大于 40cm，以免压力过大，导致凝胶颗粒变形；(3)平衡过程 中务必防止流速过大导致层析床液体流干。防止层析床 液体流干的最简单方法是使连接高位槽与层析柱之间的 导管成U型，U型管底部低于层析柱的出口；(4)如果需要 温度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水。
局限性：
➢在定量分析中需要纯制的标准物质 ➢不能精确地解决物质的化学结构问题
实验原理
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法
凝胶层析法 亲和层析法
常用的层析方法(按层析原理分类)：
分离原理 组分与吸附剂吸附力不 同 各组分在流动相与固定 相的分配系数不同 不同离子化合物所带电 荷不同 和离子交换剂作用强弱 不同 各组分分子大小不同
维生素B2，又称核黄素，维他命B2。 分子式C17H20N4O6。它是人体必需 的13种维生素之一，作为维生素B族 的成员之一，微溶于水，可溶于氯化 钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。 维生素B2是机体中许多酶系统的重要 辅基的组成成分，参与物质和能量代 谢。
核黄素
血红蛋白
试剂
三、洗脱液
0.05mol/L磷酸盐 缓冲液
生理盐水
仪器
一、1.2cm×40cm层析柱
仪器
二、微量可调式移液器
仪器
三、721E型分光光度计
仪器
四、自动部分收集器
510m0ml l
仪器
五、其他等
锥形瓶注射器
实验操作
1、凝胶处理 溶胀与浮选：将Sephadex G-25凝胶干粉放入 过量水中浸泡24小时或沸水水浴中2小时。浸泡后，搅动 凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反 复多次。
6、收集与测定
收集时可使用自动部分收集器或手工操作，每管接洗脱 液3ml，共收集15管。收集后用721E型分光光度计在450nm 波长处以洗脱液为空白，对每管收集液（或洗脱体积）为 横坐标，光密度为纵坐标绘制洗脱曲线。
! 注意事项:
市场凝胶如需彻底处理，可在溶胀后再用0.5mol/L NaOH0.5mol/L NaCl溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避 免在酸或碱中加热。另外，用过的凝胶柱如需再生，可用 0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗涤以去掉堵住网孔的杂 质，然后用蒸馏水洗至中性备用。一般使用几次后就需再 生。
定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱 剂。它也是层析中的重要影响因素之一。
并使各组分以不同速度移动，从而的到分离。
实验原理
层析法的特点：
➢具有极高的分辨效力 ➢具有极高的分析效率 ➢具有极高的灵敏度
➢应用广泛
影响凝胶柱层析的主要原因有？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应 均匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液， 目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于 待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变 性的缓冲液都可用于凝胶层析。
③加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分 级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分 离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%-25%.
④ 凝 胶 再 生 ： 葡 聚 糖 凝 胶 再 生 使 用 NaOH （ 0.2M ） 和 NaCl(0.5M)混合液处理。
2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用 毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层析分离效果。固定好 层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。 将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的 聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高即关闭出水口。
30kD)
●蛋白质纯化过程中的除盐
常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25
●蛋白质分子量的测定
●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否
实验原理
按动相形式不同：液相层析和气相层析。
按操作形式不同：柱层析（凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析），平面层析（纸层析，
薄层层析，薄膜层析）。
柱层析是目前最常用的层析类型
实验原理
hadexG交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用 英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为 每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200为每克干胶吸水20克。交联葡聚 糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分布范围。
样品浓度
▲目的蛋白的浓度最好低于10mg/ml
▲目的蛋白在样品中的含量如果不高， 可以数倍或数十倍的样品量上样 （ 以不超过柱结合蛋白的饱和水平为界限）
实验目的
掌握要点 （1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本原理 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
试剂
一、葡聚糖凝胶Sephadex G-25
Cl- +
+ Cl-
+ ClCl- +
高盐
等电点（pI,isoelectric point）
等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子 的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液 的pH称为该氨基酸的等电点。
两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正 负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。
当外界溶液的pH大于两性离子的pl值，两性离子释放质子带 负电。
当外界溶液的pH小于两性离子的pl值，两性离子质子化带正 电。
离子交换层析装置
亲和层析（ affinity chromatography）
是蛋白质分离纯化的最有效方法之一 有时一步纯化即可完成纯化工作
基本原理
亲和层析是利用一些生物分子和其配基之间有特 殊的 亲合力，如抗原和抗体、酶蛋白和辅酶等，它 们在一定条件下能结合为复合物。如果能将复合物 中的一方固定在固相载体上，就可从溶液中纯化另 一方
分离依据：蛋白质所带电荷
阴离子交换分离示意图1
蛋 白
样
品
If pH mobile phase =7.2
Then charge of the proteins:
(-) (-) (+) (+)
合样
的品 情与 况阴
离 子 交 换 剂 结
+
+
+
+ +
-+
+
-
--
-
++
-
+
+ +
缓冲液洗脱
蛋
阴离子交换分离示意图2
血红蛋白与核黄素的 凝胶层析分离
——Sephadex G-25凝胶层析
主讲人： 曹子昂 小组成员：努尔麦麦提 蔡青照
祖力皮卡尔
讲解流程
一
背景及意义
二 实验原理及目的
三
试剂和仪器
四
操作步骤
五
讨论
背景
色谱法(层析法)（chromatography）是由俄国化学 家茨维特于1903年创建的。他将含有叶绿素的石油 醚提取液通过装有氯化钙的柱子，发现叶绿素被分 为不同颜色的区带，故将此法称为色谱法 （chromatography） Chromatography这个词字面意思是“color writing”
实验原理
一、层析技术
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是
利层用混析合法物是中近各代组生分物的物化理学化最学常性用质的的分差别析，方使法各之组一分，以不 同程运度用分这布种在方两法个相可中以：分离性质极相似，而用一般化
固学定方相法由难层以析分介离质的组成各，种可化以合是物固，体如或液各体种。氨这基些酸物、质能 与核待分苷离酸的糖化、合蛋物白进质行可等逆。的吸附、溶解与交换作用，对层
实验原理
凝胶层析原理
优点
分离条件温和 回收率高 重复性好 设备简单
缺点 对样品的稀释大 上样量小 流速慢 操作费时
凝胶过滤层析的介质
葡聚糖凝胶:以葡聚糖为基本骨架，含大量羟基，亲水性高
交联丙烯基葡聚糖凝胶:刚性极强，流速高,不溶于所有的溶剂
凝胶过滤层析的用途
●分离分子量相差较大的蛋白质(至少差20-
实验原理
凝胶层析又称凝胶排阻、分子筛等
(一）原理：分子筛作用 （二）凝胶层析介质：交联葡聚糖、交联琼脂糖凝胶、 丙稀酰胺琼脂等。 （三）特点：(1)、操作条件温和，不会引起生物大分 子的变性失活；(2)凝胶层析柱可反复使用，每次洗脱 过程即是凝胶的再生过程；(3)、实验具有高度的重复 性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备， 亦可用于小样品的分析。 （四）应用：(1)脱盐；(2)高分子溶液的浓缩；(3)蛋 白质分子量的测定；(4)生物大分子的分离提纯。 （五）缺点：上样体积较小，仅占柱床体积的2~5%。 样品浓度会发生数倍稀释。
白 样
品
If pH mobile phase =7.2
+
Then charge of the proteins:
(-) (-) (+) (+)
-+
+
+
-
-
+
Cl- + +Cl-
+ Cl- + +
+
+ --
- Na+ Na+ +
-
Na+ Na+
Na+
-
Na+
Na+
Na+
氯化钠梯度洗Na+脱
低盐
Cl- + + Cl-
柱层析
柱的形状对分离的影响
装柱
柱体垂直固定，关闭柱的出口，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液 ↓
沿柱一侧将离子交换剂搅拌均匀，缓慢并连续地注入柱内
↓
静置至交换剂全部沉下，柱上部的液体变清
平衡柱与上样量 平衡 用至少10个柱体积的缓冲液洗柱
上样量 上样量与目的蛋白的浓度及其与 交换剂的结和能力有关。
凝胶颗粒粗细对流速的影响
试剂
二、血红蛋白与核黄素
红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一 种蛋白质(缩写为HB或HGB)。是使血液 呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成， 两条α链和两条β链，每一条链有一个包 含一个铁原子的环状血红素。氧气结合 在铁原子上，被血液运输。血红蛋白的 特性是：在氧含量高的地方，容易与氧 结合；在氧含量低的地方，又容易与氧 分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞 具有运输氧的功能。
马丁（Martin
辛格（Synge）
）1941年 色谱塔板理论， 液-液分配色谱
1952年 诺贝尔化学奖
意义
色谱法的应用
◆分离各种生物大分子（蛋白质、核酸、多糖、多肽）
◆分离生物的初级代谢产物（如氨基酸、核苷酸、有 机酸、脂肪酸）和次级代谢产物（如糖苷、色素、 生物碱、萜类）等
色谱法是基因工程下游工作中最主要的纯化方法
5、加样与洗脱
打开平衡好的层析柱底部出口，使柱内溶液流至与床表 面相切时关闭出口。将吸有0.5ml样品的加样滴管在床表 面上1cm处沿管内壁轻轻转动加样。加完后，打开底端出 口使样品流至床表面。关闭出口，用少量洗脱液同样小心 清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面。然后将洗脱液加 至距床表面2~3cm高，接上高位槽并调好流速即开始洗脱。 注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入液体，防止冲坏床表 面，影响分辨率。
利用大换层析法
分样离品原中的理蛋白质借所带的电荷与离子交换剂
的反电荷结合，在高离子强度的盐（氯化钠）洗 脱时，离子交换剂上结合的蛋白质可与洗脱液中 的Na+或Cl-离子发生交换而被洗脱到溶液中。由 于不同的蛋白质所带的电荷不同，它们与离子交 换剂的结合能力的强弱也不同，故被洗脱到溶液 中的顺序也不同，从而可被分离开来
色谱发展简史
背景
茨维特（Tswett）
1901年 色谱法
柱中有颜色的色带叫做 色谱（chromatogram）
背景
1912年 纸色谱 Nobel Prize in 1915
创导研究生物化学的第一个人
威尔斯泰特
（Willstätter）
背景
1938年 薄层色谱法
伊兹麦洛瓦 （Izmailov）
背景
3、装柱
将处理好的凝胶在烧杯内用1倍体积的溶液搅拌成悬浮液， 自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm 左右时，缓缓打开底端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬 液直至凝胶沉积至25cm高度为止。操作中注意防止气泡与 节痕产生。
4、平衡
装好后，使层析床稳定5~10分钟，然后接上高位槽， 打开出口活塞，调节高位槽的高度，控制流速为 1ml/min。用2倍于床体积的洗脱液进行平衡，使层析 床稳定。 操作过程中应特别注意：(1)在平衡与洗脱时要将高 位槽至层析柱的连接管内气泡全部排除，以免影响流速； (2)恒压高位槽内玻璃管底端口与柱底端口之差不能大于 40cm，以免压力过大，导致凝胶颗粒变形；(3)平衡过程 中务必防止流速过大导致层析床液体流干。防止层析床 液体流干的最简单方法是使连接高位槽与层析柱之间的 导管成U型，U型管底部低于层析柱的出口；(4)如果需要 温度平衡，可同时在层析柱夹套内通入恒温水。
局限性：
➢在定量分析中需要纯制的标准物质 ➢不能精确地解决物质的化学结构问题
实验原理
名称 吸附层析法 分配层析法 离子交换层析法
凝胶层析法 亲和层析法
常用的层析方法(按层析原理分类)：
分离原理 组分与吸附剂吸附力不 同 各组分在流动相与固定 相的分配系数不同 不同离子化合物所带电 荷不同 和离子交换剂作用强弱 不同 各组分分子大小不同
维生素B2，又称核黄素，维他命B2。 分子式C17H20N4O6。它是人体必需 的13种维生素之一，作为维生素B族 的成员之一，微溶于水，可溶于氯化 钠溶液，易溶于稀的氢氧化钠溶液。 维生素B2是机体中许多酶系统的重要 辅基的组成成分，参与物质和能量代 谢。
核黄素
血红蛋白
试剂
三、洗脱液
0.05mol/L磷酸盐 缓冲液
生理盐水
仪器
一、1.2cm×40cm层析柱
仪器
二、微量可调式移液器
仪器
三、721E型分光光度计
仪器
四、自动部分收集器
510m0ml l
仪器
五、其他等
锥形瓶注射器
实验操作
1、凝胶处理 溶胀与浮选：将Sephadex G-25凝胶干粉放入 过量水中浸泡24小时或沸水水浴中2小时。浸泡后，搅动 凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如此反 复多次。
6、收集与测定
收集时可使用自动部分收集器或手工操作，每管接洗脱 液3ml，共收集15管。收集后用721E型分光光度计在450nm 波长处以洗脱液为空白，对每管收集液（或洗脱体积）为 横坐标，光密度为纵坐标绘制洗脱曲线。
! 注意事项:
市场凝胶如需彻底处理，可在溶胀后再用0.5mol/L NaOH0.5mol/L NaCl溶液在室温中浸泡半小时，但注意必须避 免在酸或碱中加热。另外，用过的凝胶柱如需再生，可用 0.1mol/L NaOH-0.5mol/L NaCl洗涤以去掉堵住网孔的杂 质，然后用蒸馏水洗至中性备用。一般使用几次后就需再 生。