血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
生化实验血红蛋白的凝胶过滤
血红蛋白的凝胶过滤植物098 原硕0901080808摘要：用凝胶过滤分离血红蛋白样品，理解凝胶过滤原理，熟悉凝胶过滤操作方法。
关键字：血红蛋白，凝胶过滤一、研究背景及目的：凝胶过滤（gel [filtration] chromatography ; gel filtration chromatography ; GFC）作为一种常用的分离过滤方法，是实验中的常用手段之一，具有它的突出优点是层析所用的凝胶属于惰性载体，不带电荷，吸附力弱，操作条件比较温和，可在相当广的温度范围下进行，不需要有机溶剂，并且对分离成分理化性质的保持有独到之处。
对于高分子物质有很好的分离效果等优点。
在很多方面都有所应用：⑴脱盐：高分子（如蛋白质、核酸、多糖等）溶液中的低分子量杂质，可以用凝胶层析法除去，这一操作称为脱盐。
本法脱盐操作简便、快速、蛋白质和酶类等在脱盐过程中不易变性。
适用的凝胶为SephadexG-10、15、25或Bio-Gel-p-2、4、6.柱长与直径之比为5-15，样品体积可达柱床体积的25％-30％，为了防止蛋白质脱盐后溶解度降低会形成沉淀吸附于柱上，一般用醋酸铵等挥发性盐类缓冲液使层析柱平衡，然后加入样品，再用同样缓冲液洗脱，收集的洗脱液用冷冻干燥法除去挥发性盐类。
⑵用于分离提纯：凝胶层析法已广泛用于酶、蛋白质、氨基酸、多糖、激素、生物碱等物质的分离提纯。
凝胶对热原有较强的吸附力，可用来去除无离子水中的致热原制备注射用水。
⑶测定高分子物质的分子量：用一系列已知分子量的标准品放入同一凝胶柱内，在同一条件下层析，记录每一分钟成分的洗脱体积，并以洗脱体积对分子量的对数作图，在一定分子量范围内可得一直线，即分子量的标准曲线。
测定未知物质的分子量时，可将此样品加在测定了标准曲线的凝胶柱内洗肿后，根据物质的洗脱体积，在标准曲线上查出它的分子量。
⑷高分子溶液的浓缩：通常将SephadexG-25或50干胶投入到稀的高分子溶液中，这时水分和低分子量的物质就会进入凝胶粒子内部的孔隙中，而高分子物质则排阻在凝胶颗粒之外，再经离心或过滤，将溶胀的凝胶分离出去，就得到了浓缩的高分子溶液所以理解其原理及应用方法也是很重要的，本实验通对血红蛋白采用凝胶过滤，理解凝胶过滤的基本原理，熟悉和掌握凝胶过滤的基本操作技术。
Sephadex G-25 凝胶层析2
Sephadex G-15
Sephadex G-25
粗 中粗 细 超细
Sephadex G-50
粗 中粗 细 超细
Sephadex 中粗
G-75
超细
Sephdex G-100
中粗 超细
Sephadex 中粗 G-150 超细
Sephadex 中粗 G-200 超细
干胶颗粒 直径/μm
40-120
40-120
凝胶装置图
色谱峰和分离结果
影响凝胶柱层析的主要因素有哪些？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应均 匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液，目 的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于待分 离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变性的 缓冲液都可用于凝胶层析。
（1）凝胶处理。将Sephadex G-25 凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸 水水浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，戴凝胶沉积后，倾去上层细粒悬 液，如此反复多次。
（2）层析住的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。
（3）装柱。将处理好的凝胶在烧杯内用一倍体积的洗脱液搅拌成悬浮液， 自柱顶部沿管内壁缓缓加入柱中。
补：核黄素
维生素B2，又称核黄素， 维他命B2。分子式 C17H20N4O6。它是人 体必需的13种维生素之一， 作为维生素B族的成员之 一，微溶于水，可溶于氯 化钠溶液，易溶于稀的氢 氧化钠溶液。维生素B2 是机体中许多酶系统的重 要辅基的组成成分，参与 物质和能量代谢。
【实验器材与试剂】
（2）离子交换层析(ion exchange chromatography)
实验 血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
5、分光光度计
血红蛋白（Hemoglobin)
MW: 68,000
核黄素（Riboflavin or Vitamin B2 )
MW: 376
实验操作
注意： 整个操作过程中柱子不能流干！
1、凝胶处理：溶胀与浮选 2、装柱 3、平衡：控制流速为1ml/分 4、加样与洗脱：
坐标作图。
• 记录原始数据、绘制洗脱曲线并 分析实验结果
• 绘制实验装置图 • 思考题
BSZ-100自动部份收集器结构与 使用方法
1. 按“复位”键，仪器自动复位至起点后“报警”， 再按“复位”键，仪器自动复位。
2. 设置定时时间： （1）按下“手动/自动”键，使仪器处于“手动”状 态。 （2）按“选择”键，设定时间为3min。
凝胶层析介质
• 交联葡聚糖，商品名为Sephadex，它是由 葡聚糖交联而成的多孔性网状结构的凝胶 颗粒
• 交联琼脂糖凝胶，如Sepharose-6B。 • 聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶，商品名
Sephacryl。
交联葡聚糖是葡聚糖与3－氯－1,2环氧丙烷（交联剂）相互交联而 成，交联度由环氧氯丙烷的百分比控制。
• 由于混合物中各组分的理化性质的差异(吸附力、 溶解度、分子形状和大小、分子极性、分子亲和 力等)，各组分受到的推力和阻力不同，移动速度 不同，使混合物中的组分得以分离。
层析的特点
1、具有极高的分辨效力：能分离同系物、同分异 构体。
2、具有极高的分析效率：只需几十分钟，乃至几 分钟就可完成一个分析周期。
– 加样 – 用少量洗脱液清洗管内壁1-2次 – 然后将洗脱液在柱内约加至2cm高，接上高位槽并
凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离
凝胶色谱法的原理和方法血红蛋白的提取和分离凝胶色谱法是一种常用的分离和纯化生物大分子的方法，例如蛋白质、多肽和核酸等。
色谱是将混合物中的目标分子按照其不同的性质在固定相与流动相之间的相互作用上进行分离的方法。
凝胶色谱法又叫柱色谱法，它是利用固定相为凝胶的柱状体进行分离的。
1.分子筛层析：分子筛层析是一种以分子的尺寸为基础进行分离的方法。
这种方法利用孔径具有限制性能的固定相，将溶液中的分子按照其分子量大小进行分离。
分子筛层析对于相对分子量较小的分子的分离效果较高。
2.凝胶亲和层析：凝胶亲和层析是以分子之间的亲和性或特异性相互作用为基础进行分离的方法。
固定相表面上特异性结合一定类型的分子，从而实现目标分子的选择性吸附和分离。
凝胶亲和层析可以根据不同的结合模式进一步分类，例如亲和吸附、离子交换和金属络合等。
血红蛋白的提取和分离：血红蛋白是存在于红细胞中的一种蛋白质，其具有生物学功能，例如运输氧气和二氧化碳。
提取和分离血红蛋白可以用于研究血红蛋白的结构、功能和生理活性等。
血红蛋白的提取过程：1.血样准备：采集一定量的血液样本，一般采用静脉血样。
将血液收集到抗凝剂中，如EDTA管或肝素管，以防止凝血。
2.血细胞分离：离心血液样本，使红细胞和血浆分离。
血浆通常是上清液，可以留取备用。
3.溶解红细胞：将红细胞沉淀用一种溶解剂加以溶解，如生理盐水或磷酸盐缓冲液。
4.血红蛋白的提取：将溶解后的红细胞溶液进行离心，以去除不溶性物质。
离心后的上清液中含有血红蛋白。
血红蛋白的分离过程：1.凝胶色谱柱的准备：准备凝胶色谱柱，如分子筛柱或亲和层析柱，根据需要选择合适的柱子。
预先处理柱子，使其达到平衡状态。
2.样品加载：将提取得到的血红蛋白样品加载到凝胶色谱柱上。
样品与固定相之间进行相互作用，目标分子被吸附到柱子上。
3.洗脱：通过改变流动相的性质或条件，洗脱血红蛋白。
这可以通过调整溶剂的浓度、温度或pH值等方式实现。
4.分馏：通过洗脱的过程，将血红蛋白从其他杂质物质中分离出来。
凝胶层析法分离酪蛋白与核黄素
Separate Casein and Riboflavin by Sephadex G-75
Purpose
principle of separating riboflavin (核黄 素) and casein by Sephadex G-75
basic operation of gel chromatography (凝胶层析)
principle
1. Conception
GewleclchormoemtaotuosgerthaepsheyP, oinwearnPaolinytttiecmapl lcathees,mNieswtry, techniqCuoenfteonrt dseespiganr,a1t0inyegacrsheexmpeicriaelncseubstances by exploiting the differences in the rates at which they pass through a bed of a porous, semisolid substance (gel). The method is especially useful for separating enzymes, proteins, peptides, and amino acids from each other and from substances of low molecular weight.
Gel Chromatography
Gel Filtration (Porath,Flodin,1959) molecular sieve chromatography
(Hjertén,Mosbach,1962)
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离电液
凝胶处理。将sephadex g-25凝胶干粉放入过量水中浸泡24h或沸水水 浴2h。浸泡后，搅动凝胶再静置，待凝胶沉积后，倾去上层细粒悬液，如 此反复多次。
层析柱的预备。用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用毛 刷，以免擦伤层析柱子内壁，影响层析分离效果。固定好层析柱各处的接 口，用水检查层析柱各处的接口密封性。将清洗后的层析柱垂直固定在铁 架台上。自柱底端出口的聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部 的气泡，待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高既可关闭出水口。
装柱。 将处理好的凝胶在烧杯内用1倍提及的洗脱液搅拌成悬浮液，自柱 顶部沿管内壁缓缓加入柱中。待底部凝胶沉积至5cm左右时，缓缓打开低 端出口管，随之继续缓慢添加凝胶悬浮液直至凝胶体积沉积至25cm高度 为止。操作中注意防止气泡与节痕产生。
平衡。 装好后，使 层析床稳定 5~10min,然后接上 高位贮液瓶，打开出 口活塞，调节高位贮 液瓶的高度，控制流 速为1ml/min。用2 倍于床体积的洗脱液 进行平衡，使层析床 稳定.
血红蛋白与核黄素的凝胶 层析分离电液
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实验目的
01 掌握凝胶层析的原理。 Add a title
02 掌握柱层析的基本装置。 Add a title
03 熟悉凝胶层析的操作过程。 Add a title
层析技术
层析技术的概念： 任何层析都有两层:固定相与流动相，两相互不溶。
操作过程中应特别注意：①在平衡与洗脱 时要将高位贮液瓶至层析柱的连接管内的 气泡全部排出，以免影响流速；②恒压高 位贮液瓶内玻璃管底端出口高度之差不能 大于40cm，以免影响流速；③平衡过程中 务必防止层析床液体流干。防止层析床液 体流干最简单的方法是使连接高位贮液瓶 与层析柱之间的导管形成U形，U形管底部 低于层析柱的出口；④如果需要温度平衡， 可同时在层析柱夹套内通入恒温水。
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告一、实验目的本实验的目的是通过凝胶层析分离法，将血红蛋白与核黄素进行分离，并通过紫外吸收光谱法进行检测。
二、实验原理凝胶层析法是一种基于分子大小差异的分离方法，其原理是将待分离物质通过一定孔径大小的凝胶柱，使大分子无法进入孔隙而被留在柱上，小分子则能够穿过孔隙而流出柱底。
血红蛋白和核黄素在凝胶层析柱中的迁移速率不同，因此可以进行有效分离。
三、实验材料与仪器1. 血红蛋白和核黄素样品；2. Sephadex G-25凝胶柱；3. 紫外吸收光谱仪；4. 0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）。
四、实验步骤1. 将Sephadex G-25凝胶柱用0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）洗涤至平衡状态；2. 将样品混合后加入到凝胶柱中，以0.05mol/L磷酸盐缓冲液（pH7.4）作为流动相；3. 收集柱底流出的分离物质，用紫外吸收光谱仪进行检测。
五、实验结果与分析1. 实验结果将血红蛋白和核黄素样品通过凝胶层析柱进行分离后，收集到了两种物质。
经过紫外吸收光谱检测，血红蛋白的最大吸收波长为280nm，核黄素的最大吸收波长为375nm。
2. 结果分析通过凝胶层析法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离。
在紫外吸收光谱检测中，血红蛋白和核黄素都有明显的吸收峰。
由于两种物质在不同波长下具有不同的最大吸收值，因此可以通过紫外吸收光谱法对其进行定量检测。
六、实验注意事项1. 凝胶柱洗涤至平衡状态后再加入样品；2. 流动相需保持恒定；3. 采用紫外吸收光谱法时需注意波长选择。
七、实验结论本实验通过凝胶层析分离法成功地将血红蛋白和核黄素进行了有效分离，并通过紫外吸收光谱法进行了检测。
该方法简单易行，可用于生物大分子的分离和检测。
凝胶过滤层析法分离血红蛋白
2109年5月18日
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2019/5/18
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4.操作步骤
5、洗脱和标定：用试管收集洗脱液体。调节流速使液体均 匀流出（约1ml/min），同时记录如下数据：起始、红始、 红终、黄始、黄终、终止(1.5倍柱体积)。观察血红蛋白 与鱼精蛋白的洗脱次序并记录实验现象(注意洗脱过程中 随时添加蒸馏水，以免干柱)。
6、清洗：待所有色带流出层析柱后，继续加入蒸馏水并加 快流速，清洗层析柱至凝胶洁净呈白色为止。
2109年5月18日
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3.实验用品
仪器
（1）锥形瓶 （2）层析柱（1cm×25cm的 玻璃柱）（3）铁架台 （4）弹簧夹 （5）细橡皮管（长2cm） （6）量筒 （7）小烧杯100ml
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试剂
（1）交联葡聚糖G-50 （2）二硝基氟苯 （3）鱼精蛋白 （4）0.9%NaCl （5）10%碳酸氢钠 （6）95%乙醇
凝胶过滤层析法分离血红蛋白
化学生物学实验
2109年5月18日
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药学院 化学生物学教研室
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1.实验目的
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初步了解凝胶过滤层析 法的简单原理及应用
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初步掌握应用凝胶过滤 法分离蛋白质
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2.实验原理
层析法是利用混合物中各组分物理经学性质的差别（如吸
附力、溶解度、分子形状、大小和极性等），使各组分以 不同的程度分布在两相中，从而使各组分以不同的速度随 流动相向前流动而达到分离的目的。层析法可分为多种类 型，包括分配层析，离子交换层析，凝胶过滤层析，亲和 层析等。
凝胶过滤层析
分配层析
凝胶层析法分离酪蛋白与核黄素流程图
取层析柱， 底部填塞棉花
3.
柱效检查及Vo测定
洗脱液流至与柱床面 齐平，关闭出口
4.
分离纯化
洗脱液流至与柱床 齐平，关闭出口
滴加蓝色葡聚糖溶液10滴， 滴加样品液10滴， 打开出口收集洗脱液 打开出口，试管 收集，10滴/管 无色液小量筒收集，蓝收集样品液， 冻存，绘洗脱曲线
小烧杯中凝胶以 引流法装填进柱
硼酸缓冲液洗脱 20分钟
根据蓝色最深试管 之前体积，计算Vo
加NaOH 3ml 加少量核黄素
(约1刮刀) 约30min
每管无色洗脱液取 1滴至白瓷板，加 1滴双缩脲试剂检测
2.
准备样品称取粗品0.4g至离心管
加蒸馏水至6ml 2500转离心 10min 60℃水浴溶解 取上清液备用
实验6-血红蛋白凝胶柱层析 (恢复)
3 血红蛋白样品制备 取1ml抗凝血于小烧杯中，加入10ml 20 mmol/L、pH7.0 的磷酸缓冲液，再加入固体铁氰 化钾，使浓度达到5mg/mL（全班共享）。 4 层析柱还原层的形成 吸管取1ml 40mM FeSO4于小烧杯中，加入1mL 0.2 mmol/L Na2HPO4-1ml80mmol/L Na2H2EDTA 混 合液搅拌均匀。控制层析柱上缓冲液几乎完全进 入凝胶时，止体。速取该混合液0.5ml，小心加 入层析柱中，控制流速，使混合液缓缓进入柱床， 至完全；加入0.5ml缓冲液，同法操作。
5 上样 待柱中的磷酸缓冲液进入柱床后，止流，加 入前面配制好的血红蛋白样品0.5ml，打开液流 使样品溶液完全流入柱内。
6 洗脱 滴管小心加入磷酸缓冲液进行洗脱，控制液面约 4cm高度，拧紧上柱盖，进液管臵缓冲液瓶中。 控制调整流速，观察记录色带产生与变化，用洁 净玻璃试管分别收集红色和黄色流出液，备用。 7 清洗 待所有色带流出层析柱，继续用缓冲液清洗 层析柱2min.用磷酸缓冲液混悬，回收凝胶。
实验6 血红蛋白凝胶柱层析
实验目的
1.学习蛋白质大分子的分离纯化原理和方法 2.学习凝胶柱层析的操作技术
实验原理
生物实验中经对不同生物大分子进行分离纯化， 以便对他们作进一步的研究。对生物大分子进行 分离纯化的基本原理主要是利用它们之间各种理 化性质的差异，如：利用分子表面荷电状态的不 同发展成熟的电泳技术；根据不同分子对介质吸 附性不同而建立的吸附层析，疏水层析等技术； 利用生物大分子特异亲和的特性建立亲和层析技 术及生物芯片检测技术。
蛋白质鉴定 1.双缩脲显色: 试管中加入待试液10滴,加入双缩脲 试剂2滴，观察颜色变化. 2.沉淀反应: 蛋白质溶液1mL, 加10%醋酸2滴，加 饱和苦味酸7滴，观察现象。蛋白质溶液产生沉淀。
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离
实验器材与试剂
（一）器材 1.2cm x 40cm层析柱、1mL微量可调式移液
器、721E型分光光度计、恒压贮液瓶、自动部分 收集器 （二）试剂
（1）葡聚糖凝胶Sephades G-25 （2）血红蛋白与核黄素的混合液 （3）洗脱液：0.05mol/L磷酸盐缓冲液
（pH=7.3）或生理盐水
实验操作
新柱装好后，要用洗脱缓冲液 平衡，一般用3～5倍体积的缓冲液 在恒压下流过柱床。
新装好的柱要检验其均匀性－ 可用带色的高分子物质如蓝色葡聚 糖-2000配成2mg/mL的溶液过柱， 观察色带是否均匀下降。也可以对 光检查，看其是否均匀或有无气泡 存在。
（三）加样
由于凝胶层Байду номын сангаас的稀释作用，似乎样品浓
剂和葡聚糖的配比及反应条件来控制。交 联度越大，网孔越小，吸水膨胀就越小。 交联度越小，网孔越大，吸水膨胀就越大 。
G类葡聚糖凝胶常用G-X代表，X数字 既代表交联度，也代表特水量。X数字越小， 交联度越大，网孔越小，适用于分离低分 子质量生化产品。X数字越大，交联度越小， 网孔越大，适用于分离高分子生化产品。X 数字也代表凝胶的持水量，如G-25表示1g 干胶持水2.5mL，G-100表示 1g干胶持水 10mL，依次类推。
细和超细四类。颗粒越细，分离效果 越好，因为它容易达到平衡，但流速 慢。颗粒越粗，流速越快，会使区带 扩散，使洗脱峰变平变宽。在一般柱 层析中，使用干颗粒直径在70μm左右 较合适。对于在水中保存的凝胶如琼 脂粉凝胶颗粒直径应在150μm左右。 凝胶颗粒大小要均匀，这样流速稳定， 效果较好。
葡聚糖凝胶和生物胶多以干粉形
4．分辩率不高 （1）装拄不均匀 （2）样品量过大 （3）流速太快 （4）拄不垂直或拄不合适
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告(一)
血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告(一)血红蛋白与核黄素的凝胶层析分离实验报告研究背景血红蛋白与核黄素都是蛋白质分子，二者的相互作用对于生命科学研究具有重要的意义。
为了探究这种相互作用，我们进行了凝胶层析分离实验。
实验方法1.准备样品：分别制备血红蛋白和核黄素的样品。
2.制备凝胶：用30%的聚丙烯酰胺凝胶制备样品解离。
3.层析操作：将样品注入凝胶柱中，用适当的缓冲液洗涤后，逐步加入梯度缓冲液。
4.收集分离产物：根据吸光度检测结果，将分离出的产物收集保存。
实验结果通过吸光度检测，我们得到了血红蛋白和核黄素分离的结果。
两种物质的吸光度曲线如下图所示：Sample 1 Sample 2 Sample 3_____ _____ _____| | | | | || | | | | |____| |__________| |________| |_______Hb Hb,NH2 Hb-NHCO-CH2-CH2-NH2λ(max) = 415nm λ(max) = 440nm从图中可以看出，血红蛋白在415nm处具有显著的吸收峰，而核黄素则在440nm处具有吸收峰。
因此我们可以得出分离的结论：实验成功地分离出了血红蛋白和核黄素。
结论通过凝胶层析分离实验，我们成功地分离并检测到了血红蛋白与核黄素。
这对于深入探究蛋白质之间的交互作用具有重要的意义。
优缺点及改进凝胶层析分离方法具有以下优缺点：优点：1.物理操作，不需要高级设备和化学试剂。
2.操作简便，易于掌握，基本上不受样品成分的限制。
3.实验效果比较直观，方便定量计算。
缺点：1.分离效果受到诸多因素的影响，如凝胶质量、样品的pH、流速等。
2.方法适用性比较狭窄，不能对所有样品都使用。
3.不能精确的定位蛋白组分的位置，往往会破坏部分分子。
针对凝胶层析分离方法的缺点，我们可以通过以下改进来提高其分离效果：1.优化凝胶质量，选择适合样品的凝胶制备方法。
2.优化流速等操作条件，使得样品分离效果更好。
实验七Hb与核黄素的凝胶层析简化PPT演示文稿
凝胶层析是生物化学中一种常用的分离手段，它 具有设备简单、操作方便、样品回收率高、实验重 复性好、特别是不改变样品生物学活性等优点，因 此广泛用于蛋白质（包括酶）、核酸、多糖等生物 分子的分离纯化，同时还应用于蛋白质分子量的测 定、脱盐、样品浓缩等。
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2.实验原理
2.1凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。 凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒，凝胶颗粒的内部 具有立体网状结构，形成很多孔穴。当含有不同分子大小的 组分的样品进入凝胶层析柱后，各个组分就向固定相的孔穴 内扩散，组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子大小。 比孔穴孔径大的分子不能扩散到孔穴内部，完全被排阻在孔 外，只能在凝胶颗粒外的空间随流动相向下流动，它们经历 的流程短，流动速度快，所以首先流出；而较小的分子则可 以完全渗透进入凝胶颗粒内部，经历的流程长，流动速度慢， 所以最后流出；而分子大小介于二者之间的分子在流动中部 分渗透，渗透的程度取决于它们分子的大小，所以它们流出 的时间介于二者之间，分子越大的组分越先流出，分子越小 的组分越后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按 分子从大到小的顺序依次流出，从而达到了分离的目的。 10
离子交换剂是通过化学反应将带电荷基团引入惰性 支持物上而形成。离子交换作用是指一溶剂中某一种 离子与一固体中的另一种具有相同电荷的离子进行相 互位置的调换。由于各种离子所带电荷的多少不同， 它们对交换剂的亲和力就有所差别。
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实验七：血红蛋白与核黄素的凝胶层析
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实验性质：分析性 目的要求：1.了解凝胶层析法的基本原理应用
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层析系统分为两个相：固定相和流动相。由
于各组分受固定相的阻力和受流动相的推力影
响不同，各组分移动速度也各异，从而使各组
生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析
实验3 生物大分子的分离——血红蛋白凝胶层析3.1 相关基础知识凝胶层析又称凝胶排阻层析、凝胶过滤、分子筛层析和凝胶渗透层析，是一种按分子大小分离物质的层析方法，广泛应用于蛋白质、核酸、多糖等生物大分子的分离和纯化。
该方法是把样品加到充满着凝胶颗粒的层析柱中，然后用缓冲液洗脱。
大分子无法进入凝胶颗粒中的静止相中，只能存在于凝胶颗粒之间的流动相中，因而以较快的速度首先流出层析柱，而小分子则能自由出入凝胶颗粒中，并很快在流动相和静止相之间形成动态平衡，因此就要花费较长的时间流经柱床，从而使不同大小的分子得以分离。
凝胶层析所用的基质是具有立体网状结构、筛孔直径一致，且呈珠状颗粒的物质。
这种物质可以完全或部分排阻某些大分子化合物于筛孔之外，而对某些小分子化合物则不能排阻，但可让其在筛孔中自由扩散、渗透。
任何一种被分离的化合物被凝胶筛孔排阻的程度可用分配系数Kav（被分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示。
Kav值的大小与凝胶床的总体积（Vt）、外水体积（Vo）及分离物本身的洗脱体积（Ve）有关，即：Kav= (Ve-Vo)/(Vt-Vo)在限定的层析条件下，Vt和Vo都是恒定值，而Ve值却是随着分离物分子量的变化而变化的。
分离物分子量大，Kav值小；反之，则Kav值增大。
因此，在同一凝胶柱上分离分子量不同的物质时，由于流动相的作用，这些分离物质将发生排阻和扩散效应。
若缓冲液连续地倾入柱中，柱中物质的排阻和扩散效应也将连续地发生，其最终结果是分子量大的物质先从柱中流出，分子量小的物质则后从柱中流出。
流出物用部分收集器分管等量或等时地收集起来，检测后分段合并相同组分的各管流出物，即等于把分子量不同的物质相互分离开了。
其分离效果受操作条件（如基质的颗粒大小、均匀度、筛孔直径和床体积的大小、洗脱液的流速以及样品的种类等）的影响，而最直接的影响是Kav值的差异性，Kav值差异性大，分离效果好；Kav值差异性小，则分离效果很差，或根本不能分开。
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定方向移动的液体或气体。柱层析中流动相一般被称为洗脱 剂。它也是层析中的重要影响因素之一。
并使各组分以不同速度移动，从而的到分离。
实验原理
层析法的特点：
➢具有极高的分辨效力 ➢具有极高的分析效率 ➢具有极高的灵敏度
➢应用广泛
影响凝胶柱层析的主要原因有？
①层析柱的选择与装填 层析柱的大小应根据分离样品量的 多少及对分辨率的要求而定。凝胶柱填装后用肉眼观察应 均匀、无纹路、无汽泡。
②流动相――洗脱液的选择：是含有一定浓度盐的缓冲液， 目的是为了防止凝胶可能有吸附作用。其选择主要取决于 待分离样品，一般来说只要能溶解洗脱物 质，并不使其变 性的缓冲液都可用于凝胶层析。
③加样量：加样量的多少应根据具体的实验而定：一般分 级分离时加样量约为凝胶柱床体积的1％－5％，而分组分 离时加样量约为凝胶柱床体积的 10%-25%.
④ 凝 胶 再 生 ： 葡 聚 糖 凝 胶 再 生 使 用 NaOH （ 0.2M ） 和 NaCl(0.5M)混合液处理。
2、层析柱的预备
用清洗剂将层析柱仔细清洗干净。清洗过程中不能使用 毛刷，以免擦伤层析柱内壁，影响层析分离效果。固定好 层析柱各处的接口，用水检查层析柱各处的接口密封性。 将清洗后的层析柱垂直固定在铁架台上。自柱底端出口的 聚乙烯管内注入溶液以除去柱管内和尼龙网底部的气泡， 待气泡排出后，使溶液在底部留至3~5cm高即关闭出水口。
30kD)
●蛋白质纯化过程中的除盐
常用的凝胶是葡聚糖凝胶G-25
●蛋白质分子量的测定
●研究蛋白质二聚体或寡聚体的存在与否
实验原理
按动相形式不同：液相层析和气相层析。
按操作形式不同：柱层析（凝胶层析、离子交换层 析、亲和层析），平面层析（纸层析，
薄层层析，薄膜层析）。
柱层析是目前最常用的层析类型
实验原理
hadexG交联葡聚糖的商品名为Sephadex，不同规格型号的葡聚糖用 英文字母G表示，G后面的阿拉伯数为凝胶得水值的10倍。例如，G-25为 每克凝胶膨胀时吸水2.5克，同样G-200为每克干胶吸水20克。交联葡聚 糖凝胶的种类有G-10、G-15、G-25、G-50、G-75、G-100、G-150、和G200。因此，“G”反映凝胶的交联程度，膨胀程度及分布范围。
样品浓度
▲目的蛋白的浓度最好低于10mg/ml
▲目的蛋白在样品中的含量如果不高， 可以数倍或数十倍的样品量上样 （ 以不超过柱结合蛋白的饱和水平为界限）
实验目的
掌握要点 （1）掌握凝胶层析的原理 （2）掌握柱层析的基本原理 （3）熟悉凝胶层析的操作过程
试剂
一、葡聚糖凝胶Sephadex G-25
Cl- +
+ Cl-
+ ClCl- +
高盐
等电点（pI,isoelectric point）
等电点：在某一pH的溶液中，氨基酸解离成阳离子和阴离子 的趋势及程度相等，所带净电荷为零，呈电中性，此时溶液 的pH称为该氨基酸的等电点。
两性离子所带电荷因溶液的pH值不同而改变，当两性离子正 负电荷数值相等时，溶液的pH值即其等电点。
当外界溶液的pH大于两性离子的pl值，两性离子释放质子带 负电。
当外界溶液的pH小于两性离子的pl值，两性离子质子化带正 电。
离子交换层析装置
亲和层析（ affinity chromatography）
是蛋白质分离纯化的最有效方法之一 有时一步纯化即可完成纯化工作
基本原理
亲和层析是利用一些生物分子和其配基之间有特 殊的 亲合力，如抗原和抗体、酶蛋白和辅酶等，它 们在一定条件下能结合为复合物。如果能将复合物 中的一方固定在固相载体上，就可从溶液中纯化另 一方
分离依据：蛋白质所带电荷
阴离子交换分离示意图1
蛋 白
样
品
If pH mobile phase =7.2
Then charge of the proteins:
(-) (-) (+) (+)
合样
的品 情与 况阴
离 子 交 换 剂 结
+
+
+
+ +
-+
+
-
--
-
++
-
+
+ +
缓冲液洗脱
蛋
阴离子交换分离示意图2
血红蛋白与核黄素的 凝胶层析分离
——Sephadex G-25凝胶层析
主讲人： 曹子昂 小组成员：努尔麦麦提 蔡青照
祖力皮卡尔
讲解流程
一
背景及意义
二 实验原理及目的
三
试剂和仪器
四
操作步骤
五
讨论
背景
色谱法(层析法)（chromatography）是由俄国化学 家茨维特于1903年创建的。他将含有叶绿素的石油 醚提取液通过装有氯化钙的柱子，发现叶绿素被分 为不同颜色的区带，故将此法称为色谱法 （chromatography） Chromatography这个词字面意思是“color writing”
实验原理
一、层析技术
层析技术，亦称色谱技术，是一种物理的分离方法。它是
利层用混析合法物是中近各代组生分物的物化理学化最学常性用质的的分差别析，方使法各之组一分，以不 同程运度用分这布种在方两法个相可中以：分离性质极相似，而用一般化
固学定方相法由难层以析分介离质的组成各，种可化以合是物固，体如或液各体种。氨这基些酸物、质能 与核待分苷离酸的糖化、合蛋物白进质行可等逆。的吸附、溶解与交换作用，对层
实验原理
凝胶层析原理
优点
分离条件温和 回收率高 重复性好 设备简单
缺点 对样品的稀释大 上样量小 流速慢 操作费时
凝胶过滤层析的介质
葡聚糖凝胶:以葡聚糖为基本骨架，含大量羟基，亲水性高
交联丙烯基葡聚糖凝胶:刚性极强，流速高,不溶于所有的溶剂
凝胶过滤层析的用途
●分离分子量相差较大的蛋白质(至少差20-
实验原理
凝胶层析又称凝胶排阻、分子筛等
(一）原理：分子筛作用 （二）凝胶层析介质：交联葡聚糖、交联琼脂糖凝胶、 丙稀酰胺琼脂等。 （三）特点：(1)、操作条件温和，不会引起生物大分 子的变性失活；(2)凝胶层析柱可反复使用，每次洗脱 过程即是凝胶的再生过程；(3)、实验具有高度的重复 性，回收样本几乎可达100%，既可用于大样本制备， 亦可用于小样品的分析。 （四）应用：(1)脱盐；(2)高分子溶液的浓缩；(3)蛋 白质分子量的测定；(4)生物大分子的分离提纯。 （五）缺点：上样体积较小，仅占柱床体积的2~5%。 样品浓度会发生数倍稀释。
白 样
品
If pH mobile phase =7.2
+
Then charge of the proteins:
(-) (-) (+) (+)
-+
+
+
-
-
+
Cl- + +Cl-
+ Cl- + +
+
+ --
- Na+ Na+ +
-
Na+ Na+
Na+
-
Na+
Na+
Na+
氯化钠梯度洗Na+脱
低盐
Cl- + + Cl-
柱层析
柱的形状对分离的影响
装柱
柱体垂直固定，关闭柱的出口，先在柱内加入约1/3柱床体积的水或缓冲液 ↓
沿柱一侧将离子交换剂搅拌均匀，缓慢并连续地注入柱内
↓
静置至交换剂全部沉下，柱上部的液体变清
平衡柱与上样量 平衡 用至少10个柱体积的缓冲液洗柱
上样量 上样量与目的蛋白的浓度及其与 交换剂的结和能力有关。
凝胶颗粒粗细对流速的影响
试剂
二、血红蛋白与核黄素
红蛋白是高等生物体内负责运载氧的一 种蛋白质(缩写为HB或HGB)。是使血液 呈红色的蛋白。血红蛋白由四条链组成， 两条α链和两条β链，每一条链有一个包 含一个铁原子的环状血红素。氧气结合 在铁原子上，被血液运输。血红蛋白的 特性是：在氧含量高的地方，容易与氧 结合；在氧含量低的地方，又容易与氧 分离。血红蛋白的这一特性，使红细胞 具有运输氧的功能。
马丁（Martin
辛格（Synge）
）1941年 色谱塔板理论， 液-液分配色谱
1952年 诺贝尔化学奖
意义
色谱法的应用
◆分离各种生物大分子（蛋白质、核酸、多糖、多肽）
◆分离生物的初级代谢产物（如氨基酸、核苷酸、有 机酸、脂肪酸）和次级代谢产物（如糖苷、色素、 生物碱、萜类）等
色谱法是基因工程下游工作中最主要的纯化方法
5、加样与洗脱
打开平衡好的层析柱底部出口，使柱内溶液流至与床表 面相切时关闭出口。将吸有0.5ml样品的加样滴管在床表 面上1cm处沿管内壁轻轻转动加样。加完后，打开底端出 口使样品流至床表面。关闭出口，用少量洗脱液同样小心 清洗管内壁1~2次，使样品流至床表面。然后将洗脱液加 至距床表面2~3cm高，接上高位槽并调好流速即开始洗脱。 注意在加样和洗脱过程中应缓慢加入液体，防止冲坏床表 面，影响分辨率。
利用大换层析法
分样离品原中的理蛋白质借所带的电荷与离子交换剂
的反电荷结合，在高离子强度的盐（氯化钠）洗 脱时，离子交换剂上结合的蛋白质可与洗脱液中 的Na+或Cl-离子发生交换而被洗脱到溶液中。由 于不同的蛋白质所带的电荷不同，它们与离子交 换剂的结合能力的强弱也不同，故被洗脱到溶液 中的顺序也不同，从而可被分离开来