酵母表达系统
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A、表达水平高（最高水平的系统） B、产物可翻译后修饰：糖基化、磷酸化、酰脂化 C、过糖基化程度比酿酒酵母少（8-15个vs100-150
个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met
信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区 极性区 目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母系统具有通用性
*88个残基组成
Met
KEX2 DAP DAP
-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-
DAP：STE13编码的二肽酶
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
二大宿主系统主要选择标记
宿主 毕赤酵母 汉森酵母
选择标记 his4、G418、 Zeocin、Cu++ leu2、 his3 、ura3、 G418
甲醇酵母系统宿主
毕赤酵母系统主要宿主株
宿主株
Y11430 GS115 KM71 SMD1168 MC1003
特点
野生型、Mut+ his4- 、Mut+ his4-、 aox1::ARG4 (AOX1-)、Muts his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
半乳糖诱导Hale Waihona Puke Baidu葡萄糖抑制
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控
B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
三 酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其它酵母表达系统
（一） 酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
UAS URS
TATA
起始 DAS 位点 编码序列
mRNA 40-120bp
20-40bp
100-1400bp
1、转录起始位点； 2、TATA盒：富含AT； 3、UAS：上游激活序列;
4、URS：上游阻遏序列 5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
目的蛋白
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶
A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上
B、名称和拷贝数不同
毕赤酵母/假丝酵母
汉森酵母
醇氧化酶
甲醇氧化酶
alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX
AOX1、AOX2
MOX
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L
汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L
甲醇酵母系统宿主
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵
个甘露糖） D、产物可正确折叠和高效分泌（最高分泌表达系统） E、可利用简单无机盐培养基高密度发酵，生物量大。 F、实验室和工业操作简单 G、不能满足结构要求严格的糖基化
酿酒酵母信号肽特点
*保守性低，大多异源宿主系统的信号肽不能互用
*信号肽结构：
Met
信号肽剪切位点
正电荷区 疏水区 极性区 目的蛋白
MF-α信号肽
*分泌效率高
*在酵母系统具有通用性
*88个残基组成
Met
KEX2 DAP DAP
-Lys-Arg-Glu-Ala-Glu-Ala-
DAP：STE13编码的二肽酶
甲醇酵母系统的整合事件
YRp型载体：汉森系统 传代不稳定，传代过程同源或非同源重组，高选择
压力迫使高拷贝数整合，可达100拷贝。 YIp型载体： A、在靶序列处线性化载体DNA，诱导同源重组 B、有“插入”和“取代”二类整合模式 C、主要为单拷贝整合，1-10%为多拷贝整合
AOX1、AOX2 *AOX1与AOX2基因97%同源 *AOX1 占主导地位，负责AOX 99%以上活性
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶启动子 A、目前已发现的、最强的真核启动子 B、严谨调控型启动子
AOX1：葡萄糖和甘油脱阻遏、甲醇诱导 MOX：葡萄糖阻遏、甘油脱阻遏、甲醇诱导
2、甲醇酵母表达系统的优缺点
二大宿主系统主要选择标记
宿主 毕赤酵母 汉森酵母
选择标记 his4、G418、 Zeocin、Cu++ leu2、 his3 、ura3、 G418
甲醇酵母系统宿主
毕赤酵母系统主要宿主株
宿主株
Y11430 GS115 KM71 SMD1168 MC1003
特点
野生型、Mut+ his4- 、Mut+ his4-、 aox1::ARG4 (AOX1-)、Muts his4- 、胞外蛋白酶缺陷，高分泌 his4-、AOX1-、AOX2-，甲醇不生长
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
半乳糖诱导、葡萄糖抑制
GAL10 Promoter
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 将GAL4的启动子换成GAL10的诱导型强启动子 B、半乳糖诱导GAL4高表达，不受GAL80产物抑制，激活GAL1等高效转录
3）pho4TS-PHO5启动子
半乳糖诱导Hale Waihona Puke Baidu葡萄糖抑制
GAL80 GAL4
UAS
GAL1
GAL7 GAL10
A、 GAL1、GAL7和 GAL10基因连锁在一起，独立转录，共同调控
B、GAL4产物与UAS结合，促进转录；GAL80产物抑制GAL4产物的活性，阻遏转录 C、野生型GAL4表达水平低，产物活性可被GLAL80产物完全抑制，半乳糖诱导效果差
2）分泌表达产物过糖基化
（二） 甲醇酵母表达系统
甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子 甲醇酵母表达系统的优缺点 甲醇酵母表达系统操作原理 甲醇酵母系统高效表达影响因素与对策 甲醇酵母表达系统的应用
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇酵母（methylotrophic yeast) 指可利用甲醇作单一碳源的一类酵母。 毕赤酵母（Pichia pastoris) 汉森酵母（Hansenula ploymorpha) 假丝酵母（Candia boidinii)
三 酵母表达系统
酿酒酵母表达系统 甲醇酵母表达系统 其它酵母表达系统
（一） 酿酒酵母表达系统
酿酒酵母系统启动子 酿酒酵母分泌系统 酿酒酵母糖基化系统 酿酒酵母表达系统存在的问题
1、酿酒酵母启动子
UAS URS
TATA
起始 DAS 位点 编码序列
mRNA 40-120bp
20-40bp
100-1400bp
1、转录起始位点； 2、TATA盒：富含AT； 3、UAS：上游激活序列;
4、URS：上游阻遏序列 5、DAS：下游激活序列
酿酒酵母表达系统常用启动子
1）糖酵解途径中关键酶的强启动子，受葡萄糖诱导： 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因GAPDH 磷酸甘油激酶基因PKG 乙醇脱氢酶基因ADH
2）半乳糖激酶启动子（GAL1）
目的蛋白
3、酿酒酵母糖基化系统
糖基化位点：Asn-X-Thr/Ser（X代表任何氨基酸） N-型糖基化：天门冬酰氨酸残基上的酰胺氮进行糖 基化，对蛋白质的折叠、稳定性及活性较重要。 O-型糖基化：苏氨酸/丝氨酸上的羟基氧进行糖基化
酿酒酵母糖基化特点
* 过糖基化（超糖基化修饰）： N型或O型糖基的外链进一步形成庞大的、由甘露糖
低温诱导、磷酸盐抑制
A、PHO5启动子在培养基缺磷酸盐时启动转录
B、PHO4基因编码产物是PHO5启动子的正调控因子
C、pho4TS 温度敏感，35℃时失活，PHO5关闭
D、pho4TS-PHO5启动子通过降温（23℃）诱导表达
2、酿酒酵母分泌系统
酿酒酵母系统常用分泌信号肽来源： 性结合因子：MF-α 酸性磷酸酯酶：PHO5 蔗糖酶：SUC2 杀手毒素因子：KIL
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
甲醇氧化酶
A、甲醇代谢关键酶，占可溶蛋白的30%以上
B、名称和拷贝数不同
毕赤酵母/假丝酵母
汉森酵母
醇氧化酶
甲醇氧化酶
alcohol oxidase,AOX methanol oxidase,MOX
AOX1、AOX2
MOX
1、甲醇酵母与甲醇氧化酶启动子
AOX1与AOX2 *毕赤酵母和假丝酵母基因组存在二个AOX基因
3、甲醇酵母表达系统操作原理
宿主株与标记基因 甲醇酵母系统的整合事件 胞内表达与分泌表达
甲醇酵母系统宿主
二大宿主系统主要特点
项目 最适温度 最适pH值 甘油阻遏 糖基化 高密度发酵
毕赤酵母 30℃ 4.5 是 部分过度 100g/L
汉森酵母 37℃ 4.5 否 较正常 100g/L
甲醇酵母系统宿主
组成的、复杂分支结构的现象。增加了免疫原性、对活 性与药代稳定性均有影响。 *糖链组成
O型糖链仅由甘露糖组成、而哺乳细胞的还含唾液酸 基团
4、酿酒酵母表达系统的缺陷
1）表达水平普遍不高 A、表达载体传代不稳定（YEp、YRp） B、所采用的强启动子调控不严谨 C、不能利用简单的无机培养基进行高密度发酵