小鼠体外受精标准化程序
小鼠ivf
体外受精（IVF）实验步骤
1.实验前日准备体外受精用培养皿
精子游离以及定量用培养皿：35mm 培养皿中加入2个200μL TYH培养基液滴
*先加入50μL TYH培养基液滴，覆盖上矿物油后再加入150μL TYH 培养基液滴
体外受精用培养皿：35mm培养皿中加入两个50μL TYH培养基液滴以及两个200μL液滴
2.实验当日，处死雄小鼠一只，将附睾中的精子放入准备好的精子
游离用培养皿。
*用镊子将精子取出后直接放入一个盛有200μL TYH的液滴中。
3.让精子游离获能。
*在游离一个半小时后，进行精子浓度统计。
将5μL 精子悬浊液和45μL 3% NaCl混合，取适量在血球计数器中测定浓度。
为了保证此时的浓度维持在2×106个/毫升，将相邻的一个200μL TYH液滴中，取出相应的培养基，加入等量的精子悬液。
4.让稀释以后的精子继续游离，直至2个小时。
5.处死经过超排处理的雌鼠，分离卵管，放入装有矿物油的培养皿。
6. 用镊子取出卵丘细胞团，直接放入体外受精用培养皿中的200μL TYH培养基中。
*每个液滴内放2-3只小鼠的卵丘细胞团。
7. 用微量注射枪吸取10μL稀释后的精子悬液放入卵丘细胞团的TYH培养基中。
*此时精子的最终浓度约105个/毫升.
8. 体外受精持续4-6个小时。
9. 用吹管将完成体外受精的卵子分离，在50μL的TYH液滴中吹打洗净。
10. 移入约半小时前准备好的CZB液滴中，镜检，出去未受精卵以及只有一个前核的孤雌发育胚胎，统计体外受精百分比。
体外受精和胚胎培养
第一步：体外受精 第二步：早期胚胎的培养 第三步：胚胎移植
体外受精和早期胚胎培养
采集卵母细胞
采集精子
小鼠、兔、猪、羊动物: 收集的方法: 培养法：(人工配制 在获能溶液或专用 促性腺激素处理,从输卵 假阴道法,手 的获能液中培养）啮齿 管中冲取卵子
握法和电刺 的受精溶液中完成受 动物、家兔和猪 卵母细胞体 精子体 大家畜或大型动物: 激等 化学法：（一定浓度 外获能 外培养 精过程 载 从刚屠宰的雌性动物 体 的肝素或钙离子 卵巢中采集卵母细胞。 A23187溶液中，化学药 体外 超声波探测仪、内窥 物诱导）牛、羊 受精 镜或腹腔镜（活体）
早期胚胎的培养
• 培养பைடு நூலகம்育到适宜阶段时，可将其取出向受 体移植或冷动保存
•无机盐和有机盐，还需添加维生 牛、羊：桑椹胚或囊胚 素，激素，氨基酸，核苷酸等营养 小鼠、家兔：可在更早阶段移植 成分，以及动物血清 试管婴儿：8个或16个细胞阶段
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。
2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。
注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。
皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。
剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。
动物胚胎培育技术的操作指南
动物胚胎培育技术的操作指南随着科学技术的不断发展，动物胚胎培育技术在畜牧业和生物医学领域扮演着重要的角色。
胚胎培育技术可以帮助我们研究生殖生物学、改良家畜品种，甚至是克隆动物。
在这篇文章中，我们将介绍动物胚胎培育技术的操作指南，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
胚胎培育技术主要包括体外受精（IVF）和胚胎移植两个步骤。
在体外受精阶段，首先需要从母体动物中收集卵子和精子。
对于较大的动物，如牛、猪和马，可以通过超声波引导下的卵巢穿刺采集卵子。
对于较小的动物，如小鼠或小鸟，可以通过解剖手术或通过特殊仪器采集卵子。
精子可以通过自然排出或通过人工方式采集。
采集到卵子和精子后，需要进行体外受精。
首先，将卵子和精子放入含有适当培养液的离心管中。
然后，通过离心或通过特殊仪器的帮助，使卵子和精子接触，促进受精的发生。
接下来，将受精卵转移到培养皿中，并将其置于恒温灭菌的培养箱中。
培养皿中的培养液需要定期更换，以提供所需的营养物质和生长因子。
胚胎培养的下一步是胚胎移植。
胚胎移植是将成熟的胚胎植入到母体动物的子宫内，使其继续发育。
在进行胚胎移植前，需要将母体动物的子宫内膜准备好，以提供适宜的环境供胚胎着床。
这可以通过激素治疗或手术操作来实现。
在胚胎移植过程中，需要将培养的胚胎转移到母体动物的子宫内。
这可以通过经阴道插管或腹腔手术来完成。
移植后，需要密切观察胚胎在母体内的发育情况。
一些胚胎可能无法成功着床或在早期发展阶段产生问题，这是正常现象。
但一旦胚胎着床成功并进一步发育，将会带来新生仔动物。
动物胚胎培育技术的操作需要具备一定的专业知识和技能。
操作时，需要注意保持手术场所的清洁和无菌，以避免感染。
培养液的配制和保存也需要严格按照制定的方案进行。
此外，在胚胎移植过程中，要小心处理胚胎，以防止对其造成损伤。
动物胚胎培育技术的应用十分广泛。
不仅可以帮助畜牧业提高品种质量和数量，还可以为生物医学领域提供重要的研究工具和资源。
小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精的效果观察
小鼠卵母细胞体外成熟、体外受精的效果观察乌日琴;邓新燕;陈颖青;都同功;陈系古【期刊名称】《中国实验动物学报》【年(卷),期】1999(7)2【摘要】目的研究不同培养条件对小鼠卵母细胞体外成熟及体外受精率的影响.方法小鼠卵母细胞分别在含有FSH、BSA和胰岛素的培养液中体外成熟,在Whitten 氏液中体外受精,比较体外成熟率、体外受精率. 结果 1.裸卵(DO)的体外成熟率、体外受精率(81.4%,31.0%)均高于卵丘卵母细胞复合体(COC)(48.6%,27.1%).2.在培养液中添加FSH、胰岛素和BSA,卵母细胞的体外成熟率为77.9%,82.3%、60.7%;体外受精率为77.2%、72.6%、26.7%;2-细胞率为49.2%、34.2%、10.0%.胰岛素组的卵母细胞IVM率最高,但IVF率、2-细胞率低于FSH组.3.添加BSA的两组的体外受精率只有26.7%、25.8%,显著低于其他组,其体外成熟率也较添加FSH和胰岛素的组成.4.排出第一极体(PbI)的卵母细胞的体外受精率和2-细胞率(85.9%,22.4%)均高于GV期卵母细胞(71.1%,12.9%). 结论 1.卵丘卵母细胞(COC)较裸卵(DO)的体外成熟率、体外受精率都低,差异显著(P成熟＜0.01;P受精＜0.05).2.FSH和胰岛素均能提高小鼠卵母细胞的体外成熟率、体外受精率.3.BSA 可以降低小鼠卵母细胞体外受精率,差异极显著.4.GV期卵母细胞的体外受精率显著低于体外培养的排出第一极体的卵母细胞(P2-cell＜0.05,P受精＜0.05).【总页数】5页(P81-85)【作者】乌日琴;邓新燕;陈颖青;都同功;陈系古【作者单位】佛山科学技术学院农牧分院动医系组织胚胎教研室;中山医科大学实验动物中心，广州510089【正文语种】中文【中图分类】Q95【相关文献】1.C-ERBB2促小鼠卵母细胞成熟及在表皮生长因子调控小鼠卵母细胞体外成熟中的作用 [J], 郑莉萍;汪小浪;吴磊;郑月慧;高凤兰;肖秋香;李芳2.卵巢运输温度及卵母细胞促成熟因子对山羊卵母细胞体外成熟和体外受精的影响[J], 孙新明;戴彩华;罗婷3.LIF对小鼠卵母细胞体外成熟和体外受精效果的影响 [J], 周敏敏;丁海雷;钱红娟;赵振华;王杏龙4.小鼠腔前卵泡卵母细胞的体外培养、体外成熟和体外受精研究 [J], 李朝军;王斌;范必勤;刘智慧;阮金度5.影响小鼠卵母细胞体外成熟和体外受精效果的因素分析 [J], 乌日琴;邓新燕;陈颖青;都同功;陈系古因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
1动物胚胎工程实验教程小鼠卵的体外成熟与体外受精材料与方法
《动物胚胎工程实验教程》王子玉自编南京农业大学动科院2005年8月实验一小鼠卵母细胞的体外成熟实验一、实验目的 熟悉雌鼠的生殖器官的结构特点；掌握小鼠的超数排卵方案；掌握从卵巢上扎取未成熟卵母细胞的方法、卵母细胞的分类方法、体外成熟培养方法及核成熟情况和卵丘扩展程度的观察。
二、实验器材和材料1. 器材及药品体视显微镜，手术器械（眼科剪，眼科镊），1mL注射器，胶头滴管，口吸管，CO2培养箱，水浴锅，移液器，枪头，塑料培养皿，记号笔。
操作液（M2），成熟培养液（M－199），激素（PMSG和HCG），石蜡油。
2．实验动物：3-4周龄昆明系雌性小白鼠，自由采食饮水。
三、实验内容1.小鼠的超数排卵注射剂量皮下或腹腔注射PMSG 10 IU/只小鼠。
注射方法皮下注射：用手指捏住小鼠的头及尾部固定（图1-1），以酒精棉球消毒其背部，提起皮肤，将注射针头平插刺入皮下，将针头微向上挑起不露出针尖时，再注入药物。
随着药物的推入，在皮下可看到鼓起一个小泡，即证实药物确已注入皮下部位。
皮下注射时防止药液从针孔处逸出。
腹腔注射：针头刚进入腹腔后向上挑，防止损伤小鼠腹腔内器官。
注射针头宜选用小号细针头。
注射药物后的小鼠自由饮水、采饲，自然光照。
2.卵巢的采集方法在注射PMSG后46h利用颈椎脱臼法处死小鼠（将供体鼠置于饲养笼上，鼠爪自然抓紧笼上铁支架，此时一只手拉紧鼠尾，另一只手食指与拇指压紧鼠颈部，或用镊子压紧颈部即可致死，此为引颈法。
用75%酒精喷湿鼠全身以消毒并防止毛发飞扬）。
将小鼠头部固定，用力牵拉鼠尾，可感到颈椎部位脱臼的振动；也可用食指和拇指直接掐断颈椎致死。
然后用图钉将小鼠呈仰卧姿势固定于小木板上或鼠解剖台上。
图1－1 小鼠的固定将处死并固定好的小鼠，在下腹部中间剪开1个小口，一只手抓住鼠尾，另一只手抓住切开的皮肤向头部牵拉直至充分暴露腹部（图1-2）。
剪开腹膜，向前方揭去肠胃内脏，即暴露出生殖器官，可在肾脏后方看到两侧呈乳白色的卵巢及与输尿管相平行的两子宫角（图1-3）。
什么是体外受精体外受精的程序
什么是体外受精体外受精的程序自然界体外受精的生物包括鱼类与两栖类，是指精子与卵子在雌性生物体外结合产生受精卵的受精方式。
那么你对体外受精了解多少呢?以下是由店铺整理关于什么是体外受精的内容，希望大家喜欢!体外受精的简介体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术，英文简称为IVF。
由于它与胚胎移植技术(ET)密不可分，又简称为IVF-ET。
在生物学中，把体外受精胚胎移植到母体后获得的动物称试管动物。
这项技术成功于20世纪50年代，在最近20年发展迅速，现已日趋成熟而成为一项重要而常规的动物繁殖生物技术引。
体外受精的技术应用牛的体外受精技术不仅应用于畜牧生产，同时，也成为研究其他胚胎生物技术，如克隆、转基因、胚胎干细胞分离培养和性别控制等的重要辅助手段。
体外受精能怀孕吗在不孕症治疗中，体外受精技术是与胚胎移植技术相关联的。
就是说当受精卵在人工孵育的条件下经过分裂，达到8至16个卵裂细胞时，再用人工方法移入分泌期的妇女子宫内，使孕卵着床。
体外受精和胚胎移植技术的结合，就是人们通俗说的“试管婴儿”技术，随着科学的发展，这一技术在不孕症治疗中将发挥更大作用。
所谓协助性体外受精，就是将精子或卵子取出体外，经过处理或培养成胚胎后，再植入人体内，克服传统治疗的障碍，其中大家最熟悉的治疗就是试管婴儿。
实际上最简单的精子洗涤合并子宫的体外授精术也是体外受精的一种，对于轻度的不孕症疾病，例如轻度的精子活动力差，夫妻体内的抗精子抗体的自体免疫疾病，子宫颈的疾病，性交与射精障碍者，施以体外授精治疗每次有20%的怀孕率。
体外受精的程序采集培养1.卵母细胞的采集：卵母细胞的采集方法通常有三种。
⑴超数排卵：对于实验动物如小鼠、兔，以及家畜猪、羊等采用的主要方法是;用促性腺激素处理，使其排出更多的卵子，然后，从输卵管中冲取成熟卵子可直接与获能精子受精。
在大家畜中，由于操作程序复杂，成本较高，很少使用。
STuDy-seq标准化操作流程
STuDy-seq标准化操作流程【仪器试剂】生物安全柜，CO2培养箱，倒置显微镜，体视显微镜，冰冻切片机，激光捕获显微切割仪，恒温箱，PCR 仪，Qubit荧光定量仪，Qsep100全自动核酸蛋白分析系统，离心机，振荡摇床，单通道移液器整套，10 μL 8/12多通道移液枪，电动移液器，无菌无RNase/DNase带滤芯低吸附枪头，6 cm细胞培养皿，24孔板，剪刀，镊子，胰岛素针，烧杯，包埋盒，玻片，膜片，湿盒，50 mL离心管，15 mL离心管，1.5 mL EP管，0.2 mL PCR管，PCR 8连管，PCR管磁力架，75%消毒酒精，灭菌水（1L），DMEM/F12培养基，灭活的胎牛血清，灭活的大鼠血清，RNaseZap，Distilled water，DPBS缓冲液，无水乙醇，异戊烷，OCT包埋剂，0.5 M EU，DMSO，10% Triton X-100，0.25 M Biotin-azide，0.25 M THPTA，CuSO4，Vitamin C，氯化钠，0.5 M EDTA，10 mM each dNTP，蛋白酶k，RNA酶抑制剂，Superscript II逆转录酶，5 M Betaine，氯化镁，糖原，1.5 M醋酸钠，KAPA HiFi HotStart ReadyMix，10 μM Barcode引物，100 μM TSO引物，10 μM IS PCR引物，10 μM建库引物（P5xx + N7xx），荧光定量PCR试剂及耗材，Tn5建库试剂盒，AMPure XP beads，Qubit检测试剂，Qsep检测试剂及耗材，以及实验室其他常规仪器设备、试剂耗材等。
【实验流程】【操作步骤】第一部分小鼠胚胎获取及体外培养1.提前一周准备好小鼠，待胎鼠在孕鼠中发育至7.5天时准备解剖。
2.孕鼠解剖前2h配好dissection medium，按照每只小鼠6皿6 cm培养皿，每皿5 mL的量配置，放置CO2培养箱中平衡2h。
小鼠体外受精标准化程序
小鼠体外受精标准化程序雌鼠（8－10周龄）体外促排卵:1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),；2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只);培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天，准备如下液体1.Quinn’s 1023（HEPES-HTF培养基）：使用时添加10％SPS，共5ml；2.Quinn’s 1020：使用时添加10％SPS，共5ml；3.Quinn’s 1026：使用时添加10％SPS，共2ml；以上液体配置后，HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口，Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口，均放置于CO2培养箱内，孵育过夜。
卵子的获得：1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用；2. 于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中；3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠，取其卵巢及输卵管于上述平皿中；4. 在解剖显微镜下，用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部，即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出，用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10％SPS Quinn’s 1020微滴中；5. 反复冲洗2-3次后，将卵子转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微滴中孵育。
精子的获得：1.于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中；2.用颈椎脱臼法处死雄鼠，取其附睾上体尾部，除去脂肪与血迹后，置于上述平皿中；3.在解剖显微镜下，用1ml空针剖开附睾上体尾部，稍加震荡后即见成团精子游出；4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10％SPS Quinn’s1020液的离心管底部，放入CO2培养箱内使精子上游15-25min；5.吸取上游液于另一离心管中，室温3000rpm离心15min；6.小心吸取沉淀，加入到另一含1ml 10％SPS Quinn’s 1020液的圆底管中，混匀，置于CO2培养箱内备用。
小鼠发育生物学实验内容
小鼠发育生物学实验内容实验一：小鼠卵母细胞和精子的形态观察一、实验目的：掌握胚胎体外操作工具的制备、小鼠超数排卵方法以及小鼠精子和不同发育阶段观卵母细胞的收集方法，观察精子结构和运动状态，评估精子活力，观察卵母细胞结构，了解体外授精操作过程。
二、操作过程：1 胚胎体外操作工具制备在酒精喷灯上将玻璃管拉成直径1mm的细管，连上乳胶管即可。
2 小鼠的抓去与保定3 收集精子断颈处死公鼠，打开腹腔，找到睾丸和附睾，剪取附睾尾，剪碎，置1.5ml离心管底部，加0.5ml 生理盐水，置37度水浴锅20分钟，用吸管从离心管上部取50微升液体，置细胞计数板，观察精子结构、密度和活力。
精子活力计算公式：精子活力＝视野中直线运动的精子数/视野中总精子数4 收集卵母细胞成熟卵母细胞的收集：母鼠腹腔注射孕马血清促性腺激素PMSG（每只10单位），48小时后再注射人类绒毛膜促性腺HCG（每只10单位），18小时后断颈处死母鼠，打开腹腔，剪下输卵管，用镊子刺破输卵管壶腹部，释放卵母细胞，用透明质酸酶溶液（10毫克/毫升生理盐水）处理卵母细胞以除去颗粒细胞，在实体显微镜下观察卵母细胞的结构。
未成熟卵母细胞的收集：断颈处死性成熟前母鼠，打开腹腔，剪取卵巢，加入1毫升盐水，用刀片或镊子捣碎卵巢，寻找生发泡状态的卵母细胞，观察卵母细胞结构。
5 体外授精将卵母细胞与精子共培养（微滴培养法）（演示）三、实验结果各种精子和卵子的形态绘图；精子活力；精子密度四、实验收获与体会，存在问题和改进意见。
实验二：小鼠早期不同发育阶段胚胎的收集、观察以及胚胎移植一、实验目的：掌握小鼠附植前胚胎收集方法，观察不同发育阶段小鼠胚胎的结构，认识小鼠早期胚胎形态学，并了解体内发育阶段与所处生殖器官位置的关系，了解小鼠胚胎移植的基本原理和操作过程。
二、操作过程：1 小鼠超数排卵程序中午12时腹腔注射PMSG，48小时后腹腔注射HCG并与公鼠合笼交配，次日清晨检查阴道栓，如果发现阴道栓则妊娠0.5天。
小鼠胚胎操作手册第三章
小鼠胚胎操作手册第三章第三章小鼠胚胎操作手册第一节注射操作在小鼠胚胎培养和研究中，注射是一项关键操作。
正确的注射技术可以确保研究的准确性和成功率。
本节将介绍小鼠胚胎注射的步骤和技巧。
1. 准备工作在进行注射前，确保实验室环境整洁，并准备好所需的实验材料。
这些材料包括显微镜、注射器、胚胎培养培养皿、胚胎移植工具等。
2. 胚胎准备将小鼠产下的胚胎收集到含有去离子水的培养皿中。
使用显微镜观察胚胎的形态和发育情况，并选择符合实验需求的胚胎进行注射。
3. 注射剂准备根据实验需求制备相应的注射剂。
注射剂可以是基因编辑工具，如CRISPR/Cas9系统，也可以是药物或其他化合物。
确保注射剂的浓度和质量符合实验要求。
4. 注射操作将胚胎取出，并放置在培养盐水中以保持湿润。
使用显微镜和细注射器将注射剂缓慢注入胚胎内。
注射时要注意避免损伤胚胎，注入的剂量要准确控制。
5. 胚胎移植完成注射后，将胚胎移植回培养皿中，并放入孵化箱或恒温箱中进行进一步的培养。
确保温度、湿度和氧气供应的稳定。
第二节胚胎培养和观察胚胎培养和观察是小鼠胚胎实验研究中的核心步骤。
本节将介绍胚胎的培养条件和观察方法。
1. 培养条件将注射后的胚胎放置在含有培养基的培养皿中。
培养基应包含足够的养分和生长因子，以满足胚胎的发育需求。
培养皿要保持无菌，并放置在恒温箱中维持稳定的温度。
2. 观察方法使用显微镜观察胚胎的发育情况，并记录下重要的观察结果。
观察胚胎的细胞分裂情况、胚胎囊胚的形成和融合等发育进程。
记录这些数据对于后续的实验分析非常重要。
3. 胚胎存储如果需要长期保存胚胎，可以使用液氮冷冻保存的方法。
在胚胎培养过程中，将胚胎收集到冷冻培养基中，然后放入液氮中冷冻保存。
这样可以保持胚胎的完整性和生理活性。
第三节数据分析和结果解读在小鼠胚胎操作过程中，数据分析和结果解读是至关重要的。
本节将介绍常用的数据分析方法和结果解读的注意事项。
1. 数据分析方法对于进行注射和观察的胚胎数据，可以使用统计学方法进行分析。
11胚胎工程实验之体外受精
或 PBS 的 保温瓶内（ 25 － 35℃）中 ，在 3h 内送回实验室，然后按
照下述方法进行回收。 ①卵泡抽吸法： 用注射器套上12－16号针头，保持一定负压，从卵泡的侧面
刺入，一次进针可抽吸卵巢皮质的多个卵泡。
②卵泡解剖法：
用手术刀片将卵巢切为两半，去掉中间的髄质部分，露出卵
2.卵母细胞的活体采集 因从屠宰场收集得到的卵巢无法知道其系谱，且其
动物胚胎工程实验
王子玉 84395381 逸夫楼3084
实验二 小鼠卵母细胞的体外受精
体外受精的意义
对畜牧业生产、动物生殖机理的研究及保护濒危 动物、治疗人类的不孕不育症等具有重要意义
可望解决胚胎移植所需胚胎的生产成本及来源匿
乏等关键问题。可利用IVM－IVF－IVC体外大规
模生 产高质量的胚胎，建立工厂化生产胚胎的成
①开放培养系统：
将1－2ml成熟培养液直接置于平面皿内或五孔培养板内，然
②微滴培养系统：
将成熟培养液先在组织培养皿中做成 50－ 500µl 的
微滴，上覆石蜡油，然后将卵母细胞置于其中培养。 在一般情况下，这种培养液用在卵母细胞数量特别 少的情况下采用。 ③密闭培养系统： 将卵母细胞置于含有 1 － 2ml 成熟培养液的试管中， 加盖胶塞，然后在培养箱或恒温水浴中培养；如若采用
小鼠自交净化原理
小鼠自交净化原理
小鼠自交净化的原理是通过体外受精（In Vitro Fertilization, IVF）+胚胎移植（Embryo Transfer, ET）技术（IVF-ET），其基本原理是小鼠自身虽然被感染，但小鼠的精子或卵细胞在体内是干净无菌的。
具体操作步骤如下：
1. 取出精子：将雄鼠处死后取出精子。
2. 体外受精：将精子激活后与超排的卵母细胞进行体外受精拿到受精卵。
3. 胚胎移植：将受精卵移植到SPF级代孕小鼠的子宫中。
通过这种方法，可以得到SPF级的小鼠后代，从而减少或阻止病原体通过一个活体小鼠传染给饲养在屏障设施内的其他小鼠。
实验动物小鼠生物净化—胚胎移植和剖腹产方法-中国医学科学院医学
生物净化方法目前比较可行的包括胚胎移植和剖宫取胎（剖腹产）。胚胎移植又称受精卵移植，俗 称人工授胎或借腹怀胎，是指将雌性动物的早期胚胎，或者通过体外受精及及其他方式得到的胚胎，移 植到同种的、生理状态相同的其他雌性动物体内，使之继续发育为新个体的技术。它的本质是生产胚胎 的供体和孕育胚胎的受体共同繁殖后代的过程。它的意义是可以充分发挥雌性优良个体的繁殖能力。剖 宫取胎（剖腹产）是利用胎盘具有屏障的作用，可阻止病原微生物浸入这一作用，采取无菌剖腹手术取 出胎儿，切断母仔纵向转播疾病的途径，从而达到生物净化的作用。
（征求意见稿）
XXXX - XX - 发布
- XX - XX 实施
中国实验动物学会 发 布
T/CALAS XXXXX—XXXX
前 言
本标准按照 GB/T 1.1-2009 给出的规则编写。 本标准附录 A 为规范性附录，附录 B 为资料性附录。 本标准由中国实验动物学会归口。 本标准由全国实验动物标准化技术委员会（SAC/TC281）技术审查。 本标准由中国实验动物学会实验动物标准化专业委员会提出并组织起草。 本标准主要起草单位：广东省实验动物监测所。 本标准主要起草人：李舸，张钰，刘书华，李韵峰，黄韧，关雅伦。
6 试剂
除特别说明外，所有实验用试剂均为分析纯；实验用水为去离子水。 6.1 PMSG:用生理盐水配制成 5IU/0.1ml 方便小鼠腹腔注射用。 6.2 HCG: 用生理盐水配制成 5IU/0.1ml 方便小鼠腹腔注射用。 6.3 HTF 试剂：配制方法见附录 B。 6.4 GSH:谷胱甘肽。 6.5 石蜡油。
7.1.7 小鼠产仔和病原检测 统计产仔数量，并在仔鼠出生 4 周后对其进行《GB 14922.1-2001 实验动物寄生虫学等级及监测》
第三章 哺乳动物体外受精
Capacitation is required for the acrosomal reaction to take place.
顶体反应
顶体中的成份包括：
透明质酸酶(hyaluronidase)
顶体粒蛋白(acrosin) 原顶体粒蛋白(proacrosin) 酸性蛋白酶(acid proteinase)
4.放入培养箱培养44-48h。
注:受精液用BO液配制，其中含10mg/ml BSA， 5mmol/L咖啡因，10μg/ml肝素。
猪
1.受精前2h做好受精滴,在CO2培养箱中平衡；
2.将体外受精成熟培养42h后,卵丘细胞充分扩散的卵 母细胞用受精液)洗涤3次，移入平衡后的受精微滴中；
3.加入受精液孵育1h的精子液(每100 uL含15－20枚 卵子，精子2X107 -4X107个/mL)，臵CO2培养箱中 39℃,5%CO2.饱和湿度条件下共同培养4－6 h。
5
6 7
大鼠
狗 人
1974
1976 1978
Toyoda et al.
Mahi et al. Steptoe et al.
8
9 10
牛
绵羊 猪
1982
1985 1986
Brackett et al.
Hanada et al. Chang et al.
三、体外受精的技术关键
精子采集与保存 卵母细胞的采集和成熟培养 体外受精 胚胎培养
4、几种常见的精子体外获能体系
高强度离子液(HIS) 可臵换精子表面抗原物质或去能因子从 而诱发获能反应。 钙离子载体(IA) 与Ca2+形成复合物，携带Ca2+进入精子内， 激活顶体酶，诱发精子获能。 氨基多糖(GAG) 促进精子对Ca2+的吸收，如肝素。
小鼠促排卵-体外受精动物模型的建立
小鼠促排卵-体外受精动物模型的建立冯清;史鸿志;林燕;雷承泳【期刊名称】《实验与检验医学》【年(卷),期】2015(000)006【摘要】目的：建立小鼠促排卵-体外受精动物模型。
方法腹腔注射不同剂量促排卵药物促使昆明小鼠排卵，分析各组剂量下获取的卵-冠-丘复合物和MⅡ卵子数以确定较佳剂量组合。
再用微滴法受精+微滴法培养、四孔板法授精+四孔板法培养、四孔板法授精+微滴法培养3种方法实施小鼠体外受精技术。
比较各组的受精率、卵裂率、囊胚率确定较佳受精、培养方法。
结果⑴6~8周龄昆明小鼠采用尿促性腺激素（HMG）8U+绒促性腺激素(HCG)8U剂量组合获得卵子数目最多，成熟度最好(P<0.05)；⑵四孔板法授精+四孔板法培养受精率最高，但卵裂率、囊胚率与其它两组无显著性差异。
四孔板法授精+微滴法培养既能方便受精操作也有利于胚胎单个追踪观察。
结论6~8周龄昆明小鼠采用HMG8U+HCG8U剂量组合能最有效获取卵子；四孔板法授精+微滴法培养是体外受精技术的较佳方法。
【总页数】3页(P714-716)【作者】冯清;史鸿志;林燕;雷承泳【作者单位】赣州市人民医院生殖医学科，江西赣州 341000;秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，河北秦皇岛 066000;赣州市人民医院生殖医学科，江西赣州341000;赣州市人民医院生殖医学科，江西赣州 341000【正文语种】中文【中图分类】R-332【相关文献】1.超促排卵后不同取卵时间对昆明小鼠卵子质量、体内成熟率和体外受精率的影响[J], 彭礼繁;张小建;廖梅旭;李晓洁;余鲲2.过敏性疾病小鼠动物模型建立及表型变化的研究进展 [J], 白梦天; 胡竹林3.替莫唑胺诱导的小鼠胶质瘤耐药动物模型的建立 [J], 施林勇;李宏;辜俊伟;宋憧;李俊杰;陈磊;周强;漆松涛;陆云涛4.一种Parkin基因敲除小鼠肾虚证动物模型的建立 [J], 王玲;陈佳;陈客宏;汪晓月;王梨名;何娅妮5.昆明小鼠卵子的体外受精及其新培养系统的建立 [J], 庞也非;李冬;旭日干因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
昆明系小鼠体外受精方法及一种新培养基的应用
昆明系小鼠体外受精方法及一种新培养基的应用
刘莹;武迪迪
【期刊名称】《中国医科大学学报》
【年(卷),期】1999(028)001
【摘要】目的：为研究受精卵子早期发育机理提供大量，同步分裂的受精卵，寻
找一种更好的受卵体外培养基。
方法：小白鼠超排取卵，附睾取精，建立体外模型，并比较不同培养液对受精卵发育的影响。
结论：建立了昆明系小鼠的体外受精模型，受精２４ｈ后，Ｍ１６和ＫＳＯＭ分别有３１．５％和４８．７％发育到２－细胞期，受精４８ｈ后，则分别有１５．７％和５３．６％发育到４－细胞期，结论：ＫＳＯＭ在一定程度上克服“二细胞阻滞”。
【总页数】3页(P8-10)
【作者】刘莹;武迪迪
【作者单位】中国医科大学基础医学院生物化学教研室;中国医科大学基础医学院
生物化学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】Q132.8
【相关文献】
1.一种新的肠道沙门菌选择性琼脂(ES)培养基的应用研究 [J], 吴锡芬;王礼文
2.一种新的近交系实验动物遗传监测方法及小鼠性别相关RAPD标记的… [J], 张
文艳;龚春梅
3.亲肺巴斯德氏菌监测方法的建立及昆明系小鼠感染情况的初步调查 [J], 黄碧星;章凌;皇甫在;陈天培
4.一种新组分酵母菌培养基的研制及应用 [J], 明儒成;聂海玲;封新平
5.昆明小鼠卵子的体外受精及其新培养系统的建立 [J], 庞也非;李冬;旭日干
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小鼠体外受精标准化程序
雌鼠（8－10周龄）体外促排卵:
1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),；
2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只);
培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天，准备如下液体
1.Quinn’s 1023（HEPES-HTF培养基）：使用时添加10％SPS，共
5ml；
2.Quinn’s 1020：使用时添加10％SPS，共5ml；
3.Quinn’s 1026：使用时添加10％SPS，共2ml；
以上液体配置后，HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口，Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口，均放置于CO2培养箱内，孵育过夜。
卵子的获得：
1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用；
2. 于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中；
3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠，取其卵巢及输卵管于上述平皿中；
4. 在解剖显微镜下，用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部，即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出，用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10％SPS Quinn’s 1020微滴中；
5. 反复冲洗2-3次后，将卵子转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微
滴中孵育。
精子的获得：
1.于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与
35mm的平皿中；
2.用颈椎脱臼法处死雄鼠，取其附睾上体尾部，除去脂肪与血迹后，
置于上述平皿中；
3.在解剖显微镜下，用1ml空针剖开附睾上体尾部，稍加震荡后即
见成团精子游出；
4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10％SPS Quinn’s
1020液的离心管底部，放入CO2培养箱内使精子上游15-25min；
5.吸取上游液于另一离心管中，室温3000rpm离心15min；
6.小心吸取沉淀，加入到另一含1ml 10％SPS Quinn’s 1020液的圆
底管中，混匀，置于CO2培养箱内备用。
体外受精：
1. 用处理过的精液做几个50μl左右的微滴，盖油，吸取各卵子粘液团分别放置于各微滴中，置于CO2培养箱内受精5－6hr；
胚胎培养：
1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1026做10－15个微滴，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用；
2. 用拉过的巴斯德吸管分别吸取受精卵，于新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微滴中反复吹打数次后，转入预平衡的10％SPS Quinn’s 1026微滴中，培养并观察分裂情况；
3. D1：用拉过的巴斯德吸管吸取受精卵转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1026微滴中，在倒置显微镜下观察受精情况，并对胚胎进行评分；
4. D2：培养液预平衡
Quinn’s 1029：使用时添加10％SPS，共1ml, 半旋口，放置于CO2培养箱内，孵育过夜。
5. D3：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1029做10－15个微滴，盖油，置于CO2培养箱内，孵育。
将胚胎转入10％SPS Quinn’s 1029培养基内继续培养至囊胚。