小鼠体外受精标准化程序

小鼠体外受精标准化程序
雌鼠（8－10周龄）体外促排卵:
1.4点左右腹腔注射尿促性素针剂(10U/只),；
2.48hr后腹腔注射绒促性素针剂(10U/只);
培养液预平衡: 雌鼠注射绒促的当天，准备如下液体
1.Quinn’s 1023（HEPES-HTF培养基）：使用时添加10％SPS，共
5ml；
2.Quinn’s 1020：使用时添加10％SPS，共5ml；
3.Quinn’s 1026：使用时添加10％SPS，共2ml；
以上液体配置后，HEPES-HTF培养基需要拧紧离心管口，Quinn’s 1020与Quinn’s 1026则半旋口，均放置于CO2培养箱内，孵育过夜。

卵子的获得：
1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1020做四个微滴的三个培养皿，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用；
2. 于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与35mm的平皿中；
3. 用颈椎脱臼法处死促排卵雌鼠，取其卵巢及输卵管于上述平皿中；
4. 在解剖显微镜下，用1ml空针剖开小鼠输卵管的壶腹部，即见粘附有大量颗粒细胞的卵子粘液团流出，用拉过的巴斯德吸管吸取置于预先孵育的10％SPS Quinn’s 1020微滴中；
5. 反复冲洗2-3次后，将卵子转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微
滴中孵育。

精子的获得：
1.于超净台中，取昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1023液2-3ml与
35mm的平皿中；
2.用颈椎脱臼法处死雄鼠，取其附睾上体尾部，除去脂肪与血迹后，
置于上述平皿中；
3.在解剖显微镜下，用1ml空针剖开附睾上体尾部，稍加震荡后即
见成团精子游出；
4.用拉过的巴斯德吸管吸取后轻轻加入到含2ml 10％SPS Quinn’s
1020液的离心管底部，放入CO2培养箱内使精子上游15-25min；
5.吸取上游液于另一离心管中，室温3000rpm离心15min；
6.小心吸取沉淀，加入到另一含1ml 10％SPS Quinn’s 1020液的圆
底管中，混匀，置于CO2培养箱内备用。

体外受精：
1. 用处理过的精液做几个50μl左右的微滴，盖油，吸取各卵子粘液团分别放置于各微滴中，置于CO2培养箱内受精5－6hr；
胚胎培养：
1. 前准备：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1026做10－15个微滴，盖油，置于CO2培养箱内，孵育备用；
2. 用拉过的巴斯德吸管分别吸取受精卵，于新鲜的10％SPS Quinn’s 1020微滴中反复吹打数次后，转入预平衡的10％SPS Quinn’s 1026微滴中，培养并观察分裂情况；
3. D1：用拉过的巴斯德吸管吸取受精卵转入新鲜的10％SPS Quinn’s 1026微滴中，在倒置显微镜下观察受精情况，并对胚胎进行评分；
4. D2：培养液预平衡
Quinn’s 1029：使用时添加10％SPS，共1ml, 半旋口，放置于CO2培养箱内，孵育过夜。

5. D3：用昨日预平衡的10％SPS Quinn’s 1029做10－15个微滴，盖油，置于CO2培养箱内，孵育。

将胚胎转入10％SPS Quinn’s 1029培养基内继续培养至囊胚。