条件性基因敲除的策略
CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定
CDHR2基因条件性敲除小鼠模型的构建及鉴定夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【摘要】目的:构建CDHR2基因条件性敲除小鼠模型,为研究CDHR2基因的生物学功能提供条件.方法:构建CDHR2基因条件打靶载体,电转入小鼠胚胎干细胞(ES 细胞),用G418和GANC筛选阳性细胞克隆.胚胎注射阳性ES细胞入小鼠囊胚,获得嵌合体小鼠.嵌合体小鼠与Cre小鼠交配获得条件性敲除小鼠.分别通过PCR方法和免疫组织化学方法对CDHR2的敲除结果进行验证.结果:成功构建打靶载体,并获得6个正确同源重组的ES细胞阳性克隆.阳性ES细胞克隆注射入C57BL/6J小鼠的囊胚中,获得5只嵌合鼠.嵌合鼠再与Flp小鼠交配,获得6只阳性F1代去Neo 小鼠.去Neo小鼠与Cre小鼠杂交,获得CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠.免疫组织化学检测表明,阳性小鼠肠道组织中的CDHR2基因被特异性敲除,而肾脏组织CDHR2基因的表达没有受到影响.结论:成功构建CDHR2基因肠道特异性敲除小鼠,为进一步研究CDHR2基因的作用奠定了基础.%Objective:To construct a CDHR2 conditional knockout mouse model, and to provide conditions for the study on biological function of CDHR2 gene.Methods:The conditional CDHR2 targeting vector was constructed and transfected into mouse embryonic stem (ES) cells by electroporation.The positive ES cells screened by G418 and GANC were microinjected into the blastocysts of C57BL/6J mice.The chimeric mice were obtained and then mated with Cre mice to obtain conditional CDHR2 knockout mice.The phenotype was analyzed by PCR and immunohistochemistry, respectively.Results:The conditional CDHR2 targeting vector was successfully constructed, with six positive clones of ES cells being obtained.The positive clones of ES cells weremicroinjected into blastocysts of C57BL/6J mice with 5 chimeric mice being obtained.The chimeric mice were mated with Flp mice, and 6 positive F1 generation mice without Neo gene were obtained.Finally, such mice were hybridized with Cre mice to obtain intestine-specific CDHR2 knockout mice.Immunohistochemistry assay showed that the CDHR2 gene in intestinal tracts of the positive mice was specifically knocked out.In contrast, the expression of CDHR2 in kidney tissue was notaffected.Conclusions:The successful construction of intestine-specific CDHR2 knockout mice has laid the foundation for provides a basis for further functional study on CDHR2 gene.【期刊名称】《中国临床医学》【年(卷),期】2017(024)002【总页数】5页(P176-180)【关键词】CDHR2;基因敲除;Cre/loxP系统【作者】夏梓元;蒋华波;王洋;黄美金;陆斌【作者单位】第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433;第二军医大学长海医院病理科,上海 200433;解放军成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明 650010;第二军医大学药学院生化药学教研室,上海 200433【正文语种】中文【中图分类】R-33原钙黏蛋白(protocadherin,PCDH)家族是属于钙黏蛋白超家族中的一员，可以根据其基因结构分为集簇型PCDH和非集簇型PCDH两类[1]。
基因敲除小鼠的制作方法
一、常规基因敲除鼠( Conventional Knockout )常规基因敲除是通过基因打靶，把需要敲除的基因的几个重要的外显子或者功能区域用 Neo Cassette 替换掉。
这样的小鼠其全身所有的组织和细胞中都不表达该基因产物。
此类基因敲除鼠一般用于研究某个基因在对小鼠全身生理病理的影响，而且这个基因没有胚胎致死性。
二、条件性基因敲除小鼠( Conditional Knockout )条件性基因敲除小鼠是通过基因打靶，把两个 loxP 位点放到目的基因一个或几个重要的外显子的两边。
该小鼠和表达 Cre 酶小鼠杂交之前，其目的基因表达完全正常。
当和组织特异性表达 Cre 酶的小鼠进行杂交后，可以在特定的组织或细胞中敲除该基因，而该基因在其他组织或细胞表达正常。
条件性基因敲除鼠适用范围为：( 1 )该基因有胚胎致死性；( 2 )用于研究该基因在特定的组织或细胞中的生理病理功能。
三、基因敲入小鼠( Knockin )基因敲入小鼠是通过基因打靶，把目的基因序列敲入到小鼠的相应基因位点，使用小鼠的表达调控元件指导目的基因表达。
此类基因敲入鼠一般用于药物的筛选，信号通路的研究等。
一、 ZFN 技术制作基因敲除鼠ZFN 能够识别并结合指定的基因序列位点，并高效精确地切断。
随后细胞利用天然的DNA 修复过程来实现 DNA 的插入、删除和修改，这样研究人员就能够随心所欲地进行基因组编辑。
这在过去是无法想象的，传统的基因敲除技术依赖细胞内自然发生的同源重组，其效率只有百万分之一，而 ZFN 的基因敲除效率能达到 10% 。
利用这些技术进行小鼠基因的定点敲除和敲入，可以把时间从一年缩短到几个月。
这项技术中设计特异性的 ZFN 是最关键的环节，目前研究者采用计算生物学方法设计高特异性的 ZFN，但 ZFN的脱靶( off target )，也就是把不该切的地方切了的问题仍是一个挑战。
也正因为这个原因，利用 ZFN 技术进行小鼠的基因修饰还无法完全取代传统技术。
分子生物学课件：基因敲除
Neo gene Neor基因进入ES细胞的基因组 在G418、单核苷酸类似物的培养 基中，可以存活。
P53 gene Neo gene HSV-Tk
Neor基因和HSV-TK基因同时进入ES 细胞的基因组 在G418培养基中存活，但是含有单核苷 酸类似物培养基中死亡。
2
3A
3B
嵌合体
与阴性小鼠 交配
1
3D
基因敲除的 纯合子小鼠
杂合子小鼠
3C
扩展知识：
上述基因打靶策略虽然实现了目标基因的特异失活， 但基因组中引入了一个外源标记的基因（NeoR), 该基因会 影响机体正常的功能。怎么改进？
有些基因是胚胎生长发育过程中非常重要的基因，一旦被 敲除可导致胚胎发育受损甚至不能发育为一个个体, 针对这 类基因如何采用基因敲除技术进行研究呢？
➢ 如果Tk 基因进入细胞，在含单核苷酸类似物的培养基中生长时会 因为以上分解反应产生的有毒物质而死亡
筛选标志在这个过程中如何发挥作用的？
正负筛选系统பைடு நூலகம்作原理
1. 同源重组
10-5-10-6
Neo HSV-Tk P53 gene
ES cells
P53 gene P53基因被替换
2. 随机插入，非同源重组
如果基因组序列是：
123
待敲除基因
4
基因敲除载体的结构是：
LoxP
TK
4
LoxP
LoxP
Neo
•使待敲除基因位于两个LoxP位点之间
基本流程：
•条件性基因敲除载体的构建 •在ES细胞中进行第一次常规性基因敲除
Genomic DNA:
123
基因敲除小鼠技术
转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，并逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业一、技术介绍与研究进展转基因、基因敲入/敲除动物技术已经成为现代生命科学基础研究和药物研发领域不可或缺的重要技术，该技术从上世纪七八十年代诞生以来，至今已有近四十年的历史，经典技术如DNA原核显微注射、胚胎干细胞显微注射技术一直以来经久不衰，在小鼠模型构建方面日趋完善，并且如同剪切酶和抗体等常规分子生物学试剂的制备技术一样，逐渐从基础研究实验室转向商业模式，成为一项高度标准化的新兴产业，催生了数以百计的创新药物和数以千计的优秀文章。
尽管如此，传统技术仍然存在一些难以克服的缺陷，如步骤繁琐、周期漫长、成功率低、费用高昂等，而ZFN和TALEN等新技术的出现，或有可能将这一局面彻底改变。
二、同源重组技术原理基因敲除鼠技术是上世纪80年代中后期基于DNA同源重组的原理发展起来的，Capecchi和Smithies在1987年根据同源重组（homologous recombination）的原理，首次实现了ES的外源基因的定点整合（targeted integration），这一技术称为"基因打靶"（gene targeting）或"基因敲除"（gene knockout），利用这种ES的显微注射就可以制作出基因敲出小鼠（KO Mice: knockout mice）;由于这一工作，Capecchi和Smithies于2007年与Evans分享了诺贝尔医学奖。
同源重组（homologous recombination）定义：是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
几种基因敲除鼠简介
目录
• 基因敲除鼠概述 • 条件性基因敲除鼠 • 全敲除鼠 • 诱导性基因敲除鼠
01 基因敲除鼠概述
基因敲除鼠的定义
• 基因敲除鼠：通过基因工程技术，将特定基因从 老鼠体内敲除，从而产生具有特定表型特征的转 基因动物。
基因敲除鼠的用途
疾病模型
药物筛选
基因敲除鼠可以模拟人类遗传性疾病 的发生和发展过程，用于研究疾病的 发病机制和治疗方法。
全敲除鼠通常是通过将经过基因 编辑的胚胎干细胞注入早期胚胎 中，然后移植到代孕母鼠体内发
育而成。
全敲除鼠的应用
01
02
03
疾病研究
全敲除鼠可以模拟人类遗 传性疾病，用于研究疾病 的发病机制、病理生理变 化和药物筛选等。
药物研发
全敲除鼠可以用于评估新 药对特定基因缺陷的治疗 效果，加速药物的研发进 程。
部分基因敲除鼠
03
将特定基因部分敲除或敲低，产生具有部分缺失或降低该基因
表达的转基因动物。
02 条件性基因敲除鼠
条件性基因敲除鼠的原理
条件性基因敲除鼠是通过基因打靶技术，将特 定基因的启动子替换为可诱导的启动子，使得 基因的表达只在特定条件下被激活或沉默。
可诱导的启动子通常来源于激素响应元件或化 学诱导系统，如四环素响应系统、干扰素响应 系统等。
药物研发
利用条件性基因敲除鼠可以筛选出 对特定疾病有疗效的药物，缩短药 物研发周期并提高成功率。
条件性基因敲除鼠的优缺点
优点
条件性基因敲除鼠具有高度特异性，可以避免全身敲除基因带来的副作用；同 时，可以在特定时间和空间范围内研究基因的功能，提高实验的可控性和精确 度。
缺点
条件性基因敲除鼠的构建过程复杂，需要较高的技术要求和时间成本；同时， 诱导系统的效果可能受到多种因素的影响，如激素水平、给药方式等。
第九章 基因敲除与药学
三、筛选与鉴定
标记筛选法：正负筛选法(PNS法) 标记筛选法：正负筛选法 法
含正、负两种选择性标记基因，前者插入或取代 载体上同源序列的关键外显子，后者位于同源序列的 外侧。转染ES细胞后 （1）末整合入外源基因(大多数， neo－/HSV-tk－)： 在含G418培养基中（－） （2）随机插入 (neo＋/HSV-tk＋)：在含更昔洛韦的培 养基中（－） （3）同源重组 (neo＋/HSV-tk－)，在含有G418和更 昔洛韦的培养基中生长。
全部“敲 全部“ 除”
受精卵
没能提高 “同源重 组”的效 率
需要成千 上万个受 精卵
天无绝人之路 英国的马丁· 英国的马丁·埃文斯博士
模仿“囊胚”中的微环境， 模仿“囊胚”中的微环境， 让培养皿中的干细胞无限 繁殖下去， 繁殖下去，同时又完整地 保留干细胞的“全能” 保留干细胞的“全能”特 性
成为在实验室条件下成功地繁殖 胚胎干细胞的世界第一人， 胚胎干细胞的世界第一人，为 基因靶向” “基因靶向”技术提供了足够多 的靶细胞
一、条件性基因敲除
利用Cre／LoxP实现靶基因的切除原理
一、条件性基因敲除
条件性基因敲除的程序分为两步： 条件性基因敲除的程序分为两步： 产生目标序列被两个重组酶识别位 点锚定的“ 点锚定的“Loxp floxed”动物 动物 动物与cre转基因 “Loxp floxed”动物与 动物与 转基因 动物杂交， 动物杂交，产生条件性基因敲除动 物
3.磷酸钙法 磷酸钙法
二、基因敲除载体导入ES细胞 基因敲除载体导入 细胞
将待转染的 DNA溶解在磷 溶解在磷 酸缓冲液中， 酸缓冲液中， 加入CaCl2后， 加入 DNA片段与磷 片段与磷 酸钙共沉淀并 形成大的颗粒； 形成大的颗粒； 将此颗粒悬浮 液加入贴壁培 养的细胞中， 养的细胞中， 外源DNA就被 外源 就被 靶细胞所吸收， 靶细胞所吸收， 进而实现转基 因。
基因敲除专题
2.3.2 RNAi的优缺点
步骤 2.1.2 条件性基因敲除法 2.1.3 诱导性基因敲除法 2.1.4 同源重组基因敲除缺点
2.2 利用随机插入突变进行基因敲除 2.2.1 基因捕获法 2.2.2 基因捕获法的优缺点组法敲除靶基因的基本步骤
a． 基因载体的构建： b．ES 细胞的获得 ｃ．同源重组： ｄ．选择筛选已击中的细胞： ｅ．表型研究： f．得到纯合体：
需要敲除的靶基因转录翻译出活性蛋白
2.2.1 基因捕获法
基因捕获法是最近发展起来的利用随机插入突变进行基因敲除的 新型方法。
基因捕获法的基本原理图
2.2.2 基因捕获法的优缺点
利用基因捕获可以建立一个携带随机插入突变和更迅速地进行 小鼠染色体组的功能分析。 缺点是无法对基因进行精细的遗传修饰。
他的表现远不能令人满意，他从来不听从教导，经常固执己见，按照自己的 想法胡搅蛮惨，因此常常陷入到困境里。我知道他立志将来成为一位科学家， 这很不错有 理想有目标，不过根据他现在的表现，这非常荒谬。如果他不能
学会一些简单的生物学常识，将来根本不会有任何机会去做一位专家级的工 作，不管对他自己还是教 他的老师们来说，纯粹是浪费时间
基因敲除定义 实现基因敲除的多种原理和方法 基因敲除技术的应用及缺陷
基因敲除定义：
中文名称：基因敲除 英文名称：gene knock-out;gene knockout 其他名称：基因剔除
条件性基因敲除与敲入ppt课件
构建Cre转基因动物与构建普通转基因动物的方法相
似，最为常用的基因转移方法仍为受精卵雄性原核
显微注射法和胚胎干细胞的囊胚注射法。
20
先将Cre时空特异表达载体线性化后注入雄性原核，使其以随机插入的 方式整合进基因组，然后将该受精卵或早期胚胎植人到假孕母鼠的输 卵管或子宫内。受精卵雄性原核显微注射法的具体步骤简述如下：
3
经典的基因敲除的具体实施方法可以简述如下： 选择需要研究的目的基因的部分或全部DNA片 段，通过分子生物学方法使其产生突变，然后 与相应的载体进行重组，成为靶载体。分离试 验动物的胚胎干细胞，在体外将上述靶载体导 入到胚胎干细胞内，使其与细胞内相似或相同 的序列进行同源重组，替代细胞内原来的基因。 通过一定的筛选方法筛选出发生同源重组的细 胞，再将其注入囊胚腔内；把经过上述处理的 囊胚重新植入到假孕小鼠的子宫内，使其发育 成为一个完整的个体。含有相应突变基因的嵌 合体雄性小鼠与正常雌性小鼠进行交配后，通 过筛选可获得携带该突变基因的纯合子小鼠。
条件性基因敲除与敲入
1
在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
基因敲除
基因敲除技术(组图)一．概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二．实现基因敲除的多种原理和方法：1．利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞（ES细胞）分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，首次证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson首次建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中最普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤(图1)：①．基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②．ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，最常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是１２９及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
[2，3]③．同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
一般地，显微注射命中率较高，但技术难度较大，电穿孔命中率比显微注射低，但便于使用。
如何正确选择基因敲除敲入质粒？
如何正确选择基因敲除敲⼊质粒？研究基因功能最有效的⽅法之⼀是⽤实验室设计的DNA⽚段取代或破坏基因，使其失活或“敲除”。
构建特殊的质粒可以通过同源重组替代酵母、⼩⿏或果蝇中的基因。
其原理很简单:将⼀个带有⽬标序列修复模板的质粒递送到细胞，该细胞将模板与内源性基因重组。
在这⾥，我们将主要探讨⽤于灭活哺乳动物细胞中特定基因的技术和质粒。
尽管CRISPR的敲除/敲⼊系统⾮常流⾏，但这个系统仍然很有价值，特别是在CRISPR不能使⽤的情况下(例如，附近没有合适的PAM序列，或者你感兴趣的基因很难⽤gRNA特异性靶向)。
在选择敲除策略时，⼀定要记住这些技巧!敲除质粒1.同源重组是⼀种准确修复破坏性的双链断裂的机制，核苷酸序列在两个相似或相同的DNA分⼦之间进⾏交换。
基因靶向则是利⽤这⼀⾃然过程，运⽤⼀种特殊设计的含有同源序列的载体，将⽬标基因位点替换为同源序列。
为了更了解这个过程，我们将介绍⼀个旨在敲除给定基因的第2外显⼦的实验。
设计你的⽬标结构。
为了在细胞中重组，⾄少需要2 kb的同源序列，但6到14 kb的同源序列是靶向结构的典型特征。
在图1所⽰的例⼦中，与⽬标基因外显⼦1和外显⼦3相对应的序列已克隆到载体抗⽣素抗性基因的任意⼀侧。
为了避免选择那些结构随机整合到基因组中的细胞，像HSV 胸苷激酶(HSV-tk)这样的阴性选择标记被包含在⼀个同源臂之外。
当我们稍后选择细胞时，我们将⾸先对抗⽣素抗性基因进⾏阳性选择，然后对阴性选择标记进⾏反选择——这后⼀步将杀死许多随机整合了全部或⼤部分质粒的细胞。
2.呈递质粒给宿主细胞。
重组后，⽬标基因的第2外显⼦将从染⾊体上移除，并被抗性基因取代。
这样基因就被破坏或敲除了。
3.利⽤正负选择确定正确的重组细胞。
重组是⼀个偶然事件，所以你必须选择⽽不是筛选已经发⽣重组的细胞。
新霉素、嘌呤霉素和潮霉素耐药基因通常⽤于阳性选择。
正选择标记对重组进⾏选择，⽽负选择标记对不适当的、随机的到不同位点的重组进⾏选择。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
基因功能分析的基本策略
后代
受精
植入
全能性细胞
假孕小鼠
转基因动物应用
1、通过转基因动物来研究特定基因在组织中特异表达或表达 的时相； 2、在活体内研究或发现基因的新功能； 3、可用于只在胚胎期才表达的基因结构和功能研究； 4、建立研究外源基因表达、调控的动物模型； 5、遗传性疾病的研究； 6、建立人类疾病的动物模型，为人类的基因治疗提供依据； 7、动物新品种的培育； 8、基因工程产品的制备；
13、乍见翻疑梦，相悲各问年。。22.8.722.8.718:19:4518:19:45August 7, 2022
14、他乡生白发，旧国见青山。。2022年8月7日星期日下午6时19分45秒18:19:4522.8.7
15、比不了得就不比，得不到的就不要。。。2022年8月下午6时19分22.8.718:19August 7, 2022
Cre／loxP系统的原理
➢ Cre／loxP系统来源于F1噬菌体，可以介导位点特异的 DNA重组。 ➢该系统含有两种成分：①一段长34bp的DNA序列，含有 两个13 bp的反向重复序列和一个8 bp的核心序列。这段 34bp序列是重组酶识别的位点，被称为loxP位点(10cus of X—over in P1)。 ➢②Cre重组酶(cyclizationrecombination)，它是一种由343 个氨基酸组成的单体蛋白，可以引发loxP位点的DNA重组。 任何序列的DNA，当其位于两个loxP位点之间的时候，在 Cre重组酶的作用下要么被缺失(两个loxP位点的方向相同)， 要么方向发生倒转(两loxP位点的方向相反)，如图所示。
一、反义RNA技术
反义RNA技术是根据RNA序列人工合成的互补RNA。根 据反义RNA的作用机制可将其分为三类： 1、反义RNA是直接作用于靶mRNA的核蛋白体结合位 点或与靶mRNA直接结合形成双链RNA，从而直接抑制 mRNA的翻译或被RNA酶Ⅲ识别降解。 2、反义RNA是与mRNA的非编码区结合，引起mRNA 构象的变化，从而抑制其翻译。 3、反义RNA是作用于基因的启动子，直接抑制靶 mRNA的转录。
基因敲除小鼠饲养繁殖技巧
基因敲除⼩⿏饲养繁殖技巧科研狗但凡要做动物实验的，哪个不需要伺候⼩⿏？每天好吃的好喝地伺候着，定期更换垫料，还要操⼼它们的⼈⽣⼤事，给它分配对象，⽣了娃还要给帮它们做“亲⼦鉴定”，看见⼩⿏脱发了，要想办法，母⿏不⽣了，要想办法。
回头再看看⾃⼰，没头发，还没对象，天天愁⽂章，担⼼毕不了业，全指望⼩⿏们加油，让⾃⼰早⽇出成果，所以可不得好吃好喝的伺候它们嘛！尤其是基因敲除⼩⿏，⾝价昂贵，从接到它的那⼀刻起，整个⼈都⼜兴奋⼜紧张，⽣怕怠慢了这些⼩家伙，那么收到基因敲除⼩⿏后要如何制定计划进⾏扩群繁殖以满⾜实验需要呢？除了了解所选品系的⽣活习性外，我们还要考虑⾃⼰需要的基因编辑⿏可能出现哪些问题，有没有解决或者是改善的⽅法，这些我们可以通过查阅⽂献看有没有关于该基因敲除⼩⿏的相关信息并作出⼀个初步判断。
1.背景品系的特点这个不⽤多说，需要做动物实验的同学，谁还没养过⼏只⼩⿏呀，养之前肯定已经把它的⽣活习性、繁殖特点、饲养要求等了解的很清楚了，举个栗⼦，⽐如说C57BL/6J,该品系的雄⿏好⽃，尤其是刚断奶后不同窝的雄⿏不宜放⼀笼饲养。
2.饲养环境的要求应尽可能地给⼩⿏提供适宜的⽣活环境和营养，这⽅⾯可以参照国家标准来进⾏饲养管理。
⽐如，⼩⿏对于噪⾳、光照⽐较敏感，所以我们应给⼩⿏提供安静的环境，尽量选在⼈员⾛动少的地⽅，也不要频繁查看⼩⿏情况，这样⼩⿏会有压⼒的。
母⿏有筑巢的天性，可以向笼中放柔软的棉垫，⿎励其筑巢，有助于提⾼产量。
3.基因敲除⼩⿏饲养管理应注意哪些问题⼤多数基因敲除⼩⿏相对野⽣型⼩⿏⽽⾔，在某些⽅⾯会存在或⼤或⼩的问题，所以我们需要查阅相关的⽂献，看看有没有该基因敲除⼩⿏的⽂献报道，该基因被修饰后会出现哪些问题？这些问题有没有解决或者是改善的⽅法。
如果是某种基因被修饰后会导致⼩⿏不能合成某种物质，那么可以给⼩⿏额外补充该物质；若是基因敲除⼩⿏的成活率低，问题有可能出现在着床期⾄成年期的任意时间段，通过代乳和改善饲养条件也许能得以解决；如果基因敲除⼩⿏的⽣殖⼒低。
条件性敲除小鼠
条件性敲除小鼠定义：条件性基因敲除小鼠（也叫Flox小鼠）是指在目的基因中含有成对的loxp位点的小鼠，与Cre工具小鼠交配后可在特定的组织或细胞中敲除目的基因。
CKO如何实现？重组酶系统（如：Cre-loxP）介导的位点特异性重组技术。
Cre是重组酶（38kDa），可识别34bp 长的DNA 序列loxP。
loxP 两侧各13bp 构成回文结构，中间8bp为非回文结构，因此loxp具有方向性。
（当DNA 分子上存在两个同向loxP 序列时，Cre可将两个loxP 序列之间的DNA 片段切出并环化，同时将loxP 两侧的序列进行连接；当DNA 分子上存在两个方向相反的loxP 序列时，Cre 可导致loxP 之间的序列发生反转。
）CKO敲除的是什么？条件性基因敲除的靶基因中必须带有可以被Cre 重组酶识别的loxP 序列，这种基因称为floxed gene。
带有floxed 靶基因的小鼠称为flox 小鼠。
在这种小鼠中，通常采用DNA 同源重组方法，在拟敲除基因片段的两侧分别放置一个同向的loxP 位点。
loxP 位点的存在应不影响该基因的功能，故选择对照为flox/flox小鼠CKO敲除何时何地发生？除了flox 小鼠以外，重组酶系统介导的条件性基因敲除还需要另一类重要的基因工程小鼠的参与——Cre 工具鼠。
Cre 工具鼠中，将Cre 重组酶的编码序列置于特定的基因启动子下，Cre 的表达特性决定了靶基因何时何地发生敲除。
Cre 在哪一种组织细胞中表达，靶基因的敲除就发生在哪种组织细胞；Cre 的表达水平将影响靶基因在此种组织细胞中进行修饰的效率；使用诱导型Cre 重组酶可以通过给予诱导剂，决定在特定的发育时期或疾病发生阶段，定时地进行基因敲除。
（范衡宇老师课件）实验时，将flox 小鼠和Cre 工具鼠进行交配，最后获得flox 纯合且Cre 杂合的小鼠。
在这类小鼠中，凡是表达Cre 的细胞，两个loxP 之间的序列被切除，从而实现组织特异性基因敲除。
gene knockout
基因敲除技术的缺陷
基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点，即 基因敲除技术始终存在着一个难以克服的缺点， 敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能， 敲掉一个基因并不一定就能获知该基因的功能，其 原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的， 原因包括：一方面，许多基因在功能上是冗余的， 敲掉一个在功能上冗余的基因， 敲掉一个在功能上冗余的基因，并不能造成容易识 别的表型， 别的表型，因为基因家族的其他成员可以提供同样 的功能；另一方面，对于某些必需基因，敲除后会 的功能；另一方面，对于某些必需基因， 造成细胞的致死性， 造成细胞的致死性，也就无法对这些必需基因进行 相应的研究了。 相应的研究了。
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前言
基因敲除的发展史 基因敲除的成就
诺贝尔奖获奖情况 70岁的美国科学家马里奥卡佩奇，82岁 的美国科学家奥立佛史密斯与66岁的英 国科学家马丁埃文斯，凭借基因打靶技 术共同分享了2007年度诺贝尔生理学或医 学奖。因为他们发现了如何用基因控制老 鼠胚胎细胞，评委会认为，是因为其“开 创了全新的研究领域”，为人类攻克某些 疾病提供了药物试验的动物模型。
1.利用基因同源重组进行基因敲除
基因同源重组法敲除靶基因的基本步骤
由嵌合体得到基因敲除的纯Βιβλιοθήκη 体小鼠2.条件性基因敲除法
条件性基因敲除法可定义为将某个基因 的修饰限制于小鼠某些特定类型的细胞 或发育的某一特定阶段的一种特殊的基 因敲除方法。 因敲除方法。它实际上是在常规的基因 敲除的基础上，利用重组酶Cre介导的 敲除的基础上，利用重组酶 介导的 位点特异性重组技术， 位点特异性重组技术，在对小鼠基因修 饰的时空范围上设置一个可调控的“ 饰的时空范围上设置一个可调控的“按 钮”，从而使对小鼠基因组的修饰的范 围和时间处于一种可控状态。 围和时间处于一种可控状态。
基因敲除的原理
《基因敲除的原理》基因敲除可以说是基因组学、细胞分离培养以及转基因技术的组合。
那么基因敲除的原理是什么呢？基因敲除的方法有哪些呢？在此，做个小结，以供大家学习。
一.概述：基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA 同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA ，它们同样可以达到基因敲除的目的。
二.实现基因敲除的多种原理和方法：1.利用基因同源重组进行基因敲除基因敲除是80年代后半期应用DNA 同源重组原理发展起来的。
80年代初，胚胎干细胞(ES细胞)分离和体外培养的成功奠定了基因敲除的技术基础。
1985年，**证实的哺乳动物细胞中同源重组的存在奠定了基因敲除的理论基础。
到1987年，Thompsson**建立了完整的ES细胞基因敲除的小鼠模型[1]。
直到现在，运用基因同源重组进行基因敲除依然是构建基因敲除动物模型中*普遍的使用方法。
(1)利用同源重组构建基因敲除动物模型的基本步骤：①. 基因载体的构建：把目的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA 分子都重组到带有标记基因(如neo 基因，TK 基因等)的载体上，成为重组载体。
基因敲除是为了使某一基因失去其生理功能，所以一般设计为替换型载体。
②.ES 细胞的获得：现在基因敲除一般采用是胚胎干细胞，*常用的是鼠，而兔，猪，鸡等的胚胎干细胞也有使用。
常用的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。
而其他遗传背景的胚胎干细胞系也逐渐被发展应用。
③.同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中，使外源DNA 与胚胎干细胞基因组中相应部分发生同源重组，将重组载体中的DNA 序列整合到内源基因组中，从而得以表达。
基因敲除
双链RNA进入细胞
RdRP诱导 扩增 Dicer酶裂解 双链RNA
Dicer酶裂解
siRNA
解开变成单链
结合某些蛋白
复合物
复合物+与siRNA互补的mRNA
以SiRNA作为引物，以 mRNA为模板，在RdRP作 用下合成mRNA互补链
双链mRNA
mRNA被 RNA酶裂解 Dicer酶裂解 siRNA
复合物
聚合酶链式反应
抑制基因表达
对于哺乳动物，如对于一些敲除 后小鼠在胚胎时就会死亡的基因， 可以在体外培养的细胞中利用 RNAi技术研究它的功能
RNAi还被用来研究在发育过程中起作用 的基因，如可用RNAi来阻断某些基因的 表达，来研究他们是否在胚胎干细胞的 增殖和分化过程中其起着关键作用
利用随机插 入突变进行 基因敲除
转座子插人突变
基因捕获法
以农杆菌介导的T一DNA插人突变适用于多 种植物，可以直接在植物基因组DNA中产生稳定 的插人突变，而且插人位点的随机性较强，但是 它只适用于那些容易被T一DNA转化的植物，以 农 杆 菌 介导的T一DNA插人突变适用于多种且常 常会引起的染色体重排现象，使突变体表型与T一 DNA插人无关而难以进行遗传学分析。尽管如此， 近年来将T一DNA插人突变应用于拟南芥还是获 得了广泛的成功。
转座子
转座子是一类在细菌的染色体，质粒或噬菌体之间 自行移动的遗传成分，是基因组中一段特异的具有 转位特性的独立的DNA序列. 转座子是存在于染色体DNA上可自主复制和位移的 基本单位。最简单的转座子不含有任何宿主基因而 常被称为插入序列（IS），它们是细菌染色体或质 粒DNA的正常组成部分 转座(因)子是基因组中一段可移动的DNA序列，可 以通过切割、重新整合等一系列过程从基因组的一 个位置“跳跃”到另一个位置。
条件性基因敲除小鼠的繁育策略
条件性基因敲除⼩⿏的繁育策略
要获得条件性基因敲除⼩⿏⾄少需要两步遗传杂交。
第⼀步，将GeneX-Cre杂合⼦⼩⿏与GeneY-flox杂合或纯合⼦⼩⿏交配，获得的Cre与flox双阳性（GeneX Cre/wt; GeneY lox/wt）⼦代⼩⿏。
第⼆步，将Cre与flox双阳性（GeneX Cre/wt;GeneY lox/wt）⼦代⼩⿏再与GeneY-flox 杂合或纯合⼦⼩⿏交配，获得所需的GeneX Cre/wt; GeneY lox/lox⼩⿏为实验组。
⼀般对照组为同窝GeneX wt/wt; GeneY lox/lox⼩⿏。
如果Cre的整合破坏内源基因，那么应选择GeneX Cre/wt;GeneY wt/wt⼩⿏作为对照。
条件性基因敲除的常规育种策略。
在进⾏基因型鉴定的时候，不仅要对⼩⿏⿏尾进⾏基因鉴定，对特异性⽬标组织也需要进⾏基因型检测。
这时需要设计PCR引物⽅便区分野⽣型等位基因、flox等位基因和重组后的KO等位基因。
在⿏尾鉴定时，如果发现重组后的KO产物，那么需要考虑该组织特异性Cre⼩⿏的⽣殖系表达问题。
条件性基因敲除的基因型鉴定引物设计⽰意图。
之后需要检测重组后靶基因的mRNA和蛋⽩表达，来验证Cre-lox系统的⼯作效果。
根据靶基因与lox位点的位置，可以设计qPCR模板或者探针来检测重组后的靶基因转录情况。
进⼀步可以通过免疫组化检测条件性基因敲除后靶基因蛋⽩翻译是否缺失或异常。
不过这很⼤程度上依赖于探针或抗体的灵敏度和特异性。
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条件性基因敲除的策略
条件性基因敲人是在特定的时期、特定的组织和器官中使某个基因获得表达，可用于研究致病基因的功能或者构建在特定的条件下、特定的组织和器官中表达某个基因的转基因动物模型。
其基本原理和实施方法与前面介绍的条件性基因敲人非常相似，只不过在构建loxP 转基因动物时，靶基因与启动子之间含有一段具有翻译终止密码的基因序列，导致靶基因不能正常翻译。
而这段分割序列的两侧各有一个loxP位点，在Cre重组酶存在的情况下可以使loxP位点之间的分割序列缺失，从而使靶基因获得开放。
这样一个含有靶基因、分割序列和loxP位点的基因片段通常被置于一些持续表达基因(如p―肌动蛋白、还原磷酸甘油醛脱氢酶)的启动子的调控之下，从而使这样一个功能单位在生物体内的各个时期、各种组织和器官中都能够持续获得转录。
但是由于分割序列的存在，靶基因并不能在这些组织中翻译出有功能的蛋白质。
分割序列一般选择绿色荧光蛋白(EGFP)或lacZ的编码序列，这两种基因的产物都可以作为一种标记物，在loxP转基因动物体内标记靶基因的存在。
具体设计如图所示。
条件性基因敲入时，靶基因、分割序列、loxP位点和启动子的排列
构建好这样一个loxP的转基因小鼠后，只要让它和特定的Cre转基因小鼠进行杂交，就可以实现在目标基因的条件性敲人。
条件性基因敲人的具体实施方法与条件性基因敲除大同小异，在此不赘述。