纤维连接蛋白1的原核表达、纯化及抗体的制备

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纤维连接蛋白１的原核表达、纯化及抗体的制备

王菲菲苏畅吴海东王萌孔鹏洲刘民李欣汤华

【摘要】目的构建人纤维连接蛋白ｌ（ＦＮｌ）基因的原核表达载体，诱导其表达并纯化该蛋白，制备特异性抗体。方法利用ＲＴ—ＰＣＲ方法扩增人ＦＮＩ编码序列４５０ｂｐ的片段，包含ＦＮｌ羧基端的１５０个氨基酸。构建原核表达质粒ｐＲＳＥＴＡ２－ＦＮｌ，转化大肠杆菌Ｂ也１（ＤＥ３），ＦＮｌ蛋白经异丙基二Ｂ－Ｄ·硫代半乳糖苷（ＩＰＴＧ）诱导表达。融合蛋白通过Ｎｉ“一ＮＴＡ树脂亲和纯化后免疫兔制备抗体血清。蛋白质免疫印迹（Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ）和免疫组化检测其特异性。结果成功构建重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮＩ，限制性内切酶酶切鉴定及ＤＮＡ测序均显示插入片段正确。ＳＤＳ．ＰＡＧＥ凝胶显示表达的融合蛋白相对分子质量约为

２００００（ＦＮＩ．Ｈｉｓ标签），与预期结果一致。酶联免疫吸附试验（ＥＬＩＳＡ）检测抗体效价约为ｌ：１００００，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ显示可以特异性地检测出人血浆和肝癌细胞系ＨｅｐＧ２全细胞裂解液中相对分子质量约２５００００的纤维连接蛋白。免疫组织化学可显示ＦＮＩ在正常肺及肺癌组织中的特异性分布。结论成功地原核表达了ＦＮＩｃ．末端蛋白，并免疫获得了抗ＦＮＩ特异性抗体。

【关键词】纤维连接蛋白；基因表达；抗体；癌症

Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ，ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｈｕｍａｎｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ１ＷＡＮＧＦｅｉ－ｆｅｉ，ＳＵＣｈａｎｇ，ＷＵＨａｉ－ｄｏｎｇ，ＷＡＮＧＭｅｎｇ，ＫＯＮＧＰｅｎｇ·ｚｈｏｕ，ｕｕＭｉｎ。ＬＩＸｉｎ，ＴＡＮＧＨｕａ．Ｔｉａｎｊｉｎ啦ＳｃｉｅｎｃｅＲｅｓｅａｒｃｈＣｅｎｔｅｒａｎｄＢａｓｉｃＭｅｄｉｃａｌＳｃｈｏｏｌ，ＴｉａｎｊｉｎＭｅｄｉｃａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｔｉａｎｊｉｎ３０００７０，Ｃｈｉｎａ

Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＴａｎｇＨｕａ．Ｅ－ｍａｉｌ：ｈｔａｎ９２００２＠ｙａｈｏｏ．ＣＯｒｎ

【Ａｂｓｔｒａｃｔ】ＯｂｊｅｃｔｉｖｅＴｏｅｘｐｒｅｓｓｈｕｍａｎｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎｌａｎｄｇｅｎｅｒａｔｅｓｐｅｃｉｌｉｃｈｕｍａｎｆｉｂｍｎｅｃｔｉｎｌａｎｔｉ：ｂｏｄｙｉｎｒａｂｂｉｔ．ＭｅｔｈｏｄｓＡ４５０ｂｐｌｅｎｇｔｈｆｒａｇｍｅｎｔｏｆｈｕｍａｎＦＮｌｇｅｎｅ。ｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｔｈｅ１５０ａｍｉｎｏａｃｉｄｓｏｆｔｈｅＣ—ｔｅｒｍｉｎａｌ。ＷａＳａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＲＴ·ＰＣＲ，ａｎｄｗａｓｃｌｏｎｅｄｔｏｐＲＳＥＴＡ２ｖｅｃｔｏｒ．ＴｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＦＮＩＷａＳｉｎＢＬ２１（ＤＥ３）ａｎｄｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎＷａＳｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙｔｈｅＮｉ２＋·ＮＴＡｒｅｓｉｎ．ＰｕｒｉｆｉｅｄＦＮｌｗａｇｉ啦ｔｅｄｔＯｔｈｅｒａｂｂｉｔｔｏｒａｉｓｅａｎｔｉｂｏｄｙ，ａｎｄｐｕｒｉｆｉｅｄｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｂｙａｆｆｉｎｉｔｙｍｅｔｈｏｄ．ＴｈｅｓｐｅｃｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙＷａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｒｏｎ＃Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎｄｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＲｅｓｕｌｔｓＴｈｅｐＲＳＥＴＡ２－ＦＮＩｖｅｃｔｏｒＷａＳｃｏｎｆｉｒｍｅｄｃｏｒｒｅｃｔｌｙｔｈｒｏｕｇｈｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｅｎｚｙｍｅｄｉｇｅｓｔｉｏｎａｎｄｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ．Ｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗｉｔｈ２００００（ＦＮＩ－Ｈｉｓｔａｇ）Ｗａｓｐｕｒｉ·ｆｌｅｄｂｙＮｉ“．ＮＴＡｃｏｌｕｍｎ．ＴｈｅｔｉｔｅｒｏｆｇｅｎｅｒａｔｅｄＦＮｌａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｒａｂｂｉｔｗａｇａｂｏｕｔｌ：１００００ｂｙＥＬＩＳＡ．Ｔｈｅ

ｐｕｒｉｆｉｅｄＦＮＩａｎｔｉｂｏｄｙｂｙａｆｆｉｎｉｔｙＷａｓｕｓｅｄｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅＦＮＩｉｎｌｕｎｇａｎｄ

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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ；Ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ；Ａｎｔｉｂｏｄｙ；Ｃａｎｃｅｒ

纤维连接蛋白（ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ＦＮ）是一类高分子

糖蛋白，是由相对分子质量约为２５００００的单体组

ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．Ｊ．ｉ髓ｎ．１６７３－４３９４．２０１０．０１．０１７

基金项目：国家高技术研究发展计划（８６３）（２００７ＡＡ０２１８０８）；

国家自然科学基金资助项目（３０８７３０１７）；天津市自然科学基金重

点项目（ＯＳＪＣＺＤＪＣ２３３００。０９ＪＣＺＤＪＣｌ７５００）

作者单位：３０００７０。天津医科大学基础医学院天津市生命科学

中心实验室（王菲菲，硕士研究生）

通信作者：汤华。Ｅ．ｍａｉｌ：ｈｔａｎｓ２００２＠ｙａｈｏｏ．㈣·论著·

成的二聚体，其结构类似、免疫原性相同，具有广泛的生物学活性，与细胞的形态、粘附和转移等相关…。ＦＮ是许多组织基质中的组成成分，其在基质中的不断聚集，不仅在细胞周期的调节过程中发挥了重要作用，而且也是基质的其他组分，如胶原、凝血酶敏感蛋白和纤维蛋白原等沉积的基本调节因子，具有自我装配和配体结合的特性【引。研究证实，ＦＮ的存在对于Ｉ型胶原、凝血酶敏感蛋白ｌ、无活性转化生长因子（ＴＧＦ－Ｂ）结合蛋白和原纤ｌ的持

续组装是必需的，而且ＦＮ的胶彬明胶结合区域中存在着原纤的结合位点口刮。同时，ＦＮ的聚集对基质的稳定、细胞一基质粘附位点的重塑和整连蛋白信号通路的调节也至关重要”】。基质ＦＮ还可以通过促进已获得的抗药性的发挥和为靶组织中的转移细胞提供着位点来影响转移细胞的命运【６Ｊ。所以说，ＦＮ是细胞外基质生物合成的主导。

ＦＮ是连接细胞与基质间的一种介质，存在于细胞表面、结缔组织、大多数基质膜和细胞外液中，根据其在体内分布的不同，分为细胞型和血浆型。细胞型的纤维连接蛋白存在于成纤维细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、平滑肌等的表面；血浆型的纤维连接蛋白则在血浆和细胞间液中，具有可溶性。细胞ＦＮ是由成纤维细胞和其他细胞类型表达并释放于临近的细胞外基质，血浆ＦＮ则是由肝细胞高表达并以可溶的形式分泌于血浆，在循环中的半衰期是２ｄ。细胞ＦＮ存在于组织中，并组合到纤维网，而可溶性的ＦＮ则在血管损伤的时候聚集。ＦＮ从细胞分泌出来的时候是可溶的、无活性的、二硫键结合的二聚体，然后以活性形式结合到原纤，其中血浆ＦＮ含量对多种疾病的诊断和预后有重要的意义【＿７ｌ。本研究通过克隆表达ＦＮｌ部分基因片段，纯化多肽。免疫兔，获得了抗ＦＮｌ特异性纯化的抗体。

１材料和方法

ｉ．Ｉ材料

主要试剂与菌株：ＴＲｌｚｏｌ购自Ｉｎｖｉｔｒｉｇｅｎ公司，Ｍ．ＭＬＶ逆转录酶购自Ｐｒｏｍｅｇａ公司，限制性内切酶ＢａｍＨｌ和Ｘｈｏｌ、Ｔ４ＤＮＡ连接酶、ＴａｑＤＮＡ聚合酶、ｄＮＴＰ为ＴａＫａＲａ产品，，完全弗氏佐剂、不完全弗氏佐剂为Ｓｉｇｍａ公司产品。大肠杆菌ＸＬｌ一Ｂｌｕｅ、ＢＬ２１（ＤＥ３）感受态、ｐＲＳＥＴＡ２表达载体由本实验室保存。Ｎｉ２＋一ＮＴＡ树脂购自Ｑｉａｎｇｅｎ公司，Ｅｐｏｘｙ修饰琼脂糖凝胶购于北京韦氏博公司。

１．２方法

１．２．１ＨｅｐＧ２细胞ＲＮＡ的提取、逆转录：提取ＨｅｐＧ２细胞ＲＮＡ按照ＴＲＩｚｏｌ说明书进行。逆转录反应：总ＲＮＡ５斗ｇ，ＯｌｉｇｏｄＴｌ斗ｇ，加ＤＥＰＣ水至１１山，６５℃１０ｍｉｎ，冰上冷却２ｍｉｎ，１２０００ｒ·ｍｉｎ。离心５ｓ，加入逆转录缓冲液４山、１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰｌ一、０．１ｍｏｌ／ＬＤ’ｒＩ’２山、ＲＮａｓｉｎ１一、２００Ｕ·ｗｌＭ－ＭＬＶｌ山。４２。Ｃ孵育１ｈ，７０℃１０ｒａｉｎ，产物保存于一２０℃。１．２．２ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮｌ载体构建：以逆转录产物ｅＤＮＡ为模板，上游引物５’ＧＣＧＧＡＴＣＣ’兀ＷＧＡＡＧＴ－ＧＧＴＣＡＴＩｑ＇ＣＡＧＡＴＧ３’（含ＢａｍＨｌ内切酶位点）和下游引物５’ＣＣＧＡＣＴＣＧＡＧＴＴＡＣＴｃＴＣＧＧＧＡＡＴＣＴ．ＴＣＴＣＴＧ３７（含Ｘｈｏｌ内切酶位点，引物由北京奥科合成）。ＰＣＲ反应条件：９４ｏＣ预变性４ｍｉｎ，再以９４℃１ｍｉｎ，５５℃１ｍｉｎ，７２℃１ｍｉｎ，３５个循环，最后７２℃延伸１０ｍｉｎ。ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳鉴定。切胶回收ＰＣＲ产物，ＢａｍＨｌ、Ｘｈｏｌ酶切ｐＲＳＥＴＡ２表达载体和ＦＮｌＰＣＲ回收片段，３７℃孵育４ｈ，酶切后再次回收，用Ｔ４ＤＮＡ连接酶４℃连接约１６ｈ。然后将重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２一ＦＮｌ转化入ＸＬｌ一Ｂｌｕｅ中，３７ｏＣ２５０ｒ·ｍｉｎ。１培养过夜。采用碱裂解法小量快速抽提质粒ＤＮＡ，以ＢａｍＨｌ、Ｘｈｏｌ双酶切作进一步鉴定，选取阳性重组子委托北京奥科公司测序。

１．２。３ｐＲＳＥＴＡ２－ＦＮＩ融合蛋白的诱导表达：将重组质粒ｐＲＳＥＴＡ２．ＦＮｌ转化人大肠杆菌ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取单克隆菌落培养过夜后按１：１００的比例接种于１００ｍｌＬＢ氨苄抗性培养基中，３７℃培养至菌液ＯＤ６００达到０．５—１．０时，取１ｍｌ作为诱导前对照，加入ＩＰＴＧ至终浓度为１ｍｍｏｌ·Ｌ～，３７０Ｃ诱导表达４ｈ。６０００ｒ·ｒａｉｎ一，４０００ｇ离心１５ｍｉｎ，去上清收集菌体，加入Ｂｕ能ｒＢ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ４ＮａＨ２Ｐ０４，１０ｍｍｏｌ·Ｌ～ＴｒｉｓＣｌ，８ｍｏｌ·Ｌ４尿素，ｐＨ

８．０）重悬菌体后超声裂解，１００００ｇ离心１０ｍｉｎ留取上清。取部分上清加入上样缓冲液（含有１００ｍｌ·Ｌ４ｐ一巯基乙醇）水浴煮沸５ｒａｉｎ，冰上放置５ｍｉｎ，上样，进行ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳，考马斯亮蓝染色分析。

１．２．４融合蛋白的纯化：将表达融合蛋白的菌液转接到３００ｉｎｌＬＢ中扩大培养，并按上述条件诱导表达和裂解菌体，然后离心将上清液加到Ｎｉ“－ＮＴＡ树脂中，４ｏＣ旋转混匀３０ｍｉｎ，加入ＢｕｆｆｅｒＣ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ—ＮａＨ２Ｐ０４、１０ｍｍｏｌ·Ｌ～ＴｒｉｓＣｌ、８ｍｏｌ·ＬＪ尿素，ｐＨ６．３）洗涤柱床去除杂蛋白，再加入ＢｕｆｆｅｒＤ（１００ｍｍｏｌ·Ｌ“ＮａＨ２Ｐ０４、１０ｍｍｏｌ·Ｌ“ＴｒｉｓＣｌ，８ｍｏｌ·ＬＪ尿素，ｐＨ４．５）洗脱目的蛋白，最后洗脱液经磷酸盐缓冲液（１×ＰＢＳ）透析后一２０℃保存。其中，每一步过柱后的液体取部分样品进行ＳＤＳ．ＰＡＧＥ电泳分析。

１．２．５免疫：将纯化后的重组ＦＮｌ蛋白透析后冷冻干燥成粉末，免疫前以无菌１×ＰＢＳ溶解，与等体