原核表达及抗体的制备

实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化

细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。感受态细胞的制备

1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。

2．取50UL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。

以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行：

3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。

4．将上述细胞分装于1.5mL离心管(离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。

5．将感受态细胞迅速转移到-20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。

转化：

1．新鲜制备的或-20℃下保存的感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。

2．取200UL的感受态细胞，加入适量的重组子，轻轻混匀.

3.冰浴30min.

4．42℃水浴热激90秒。

5．冰上放置2-5分钟。

6．加400UL LB培养液，37℃振荡培养45分钟。

7．将适量的菌液涂布在Amp/LB（Amp50ug/ml）琼脂平板上。

9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。

[实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。

实验二质粒DNA的提取

[实验原理]

碱裂解法提取质粒利用的是共价闭合环状质粒DNA与线状的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0-12.5这个狭窄的范围内，线状的DNA双螺旋结构解开变性，在这样的条件下，共价闭环质粒DNA的氢键虽然断裂，但两条互补链彼此依然相互盘绕而紧密地结合在一起。当加入pH4.8的

醋酸钾高盐缓冲液使pH降低后，共价闭合环状的质粒DNA的两条互补链迅速而准确地复性，而线状的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，不能迅速而准确地复性，它们缠绕形成网状结构。通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来，而质粒DNA却留在上清液中。

实验三DNA的琼脂糖凝胶电泳

[实验原理]

DNA分子在高于等电点的pH 溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖—磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量碱基的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子本身的大小和构型，具有不同分子量的DNA片段迁移速度不一样，迁移速度与DNA分子量的对数值成反比关系。凝胶电泳不仅可分离不同分子量的DNA，也可以分离分子量相同、但构型不同的DNA分子。一般提取的质粒有3种构型：超螺旋的共价闭合环状DNA(covalently closed circular DNA，简称cccDNA)，开环DNA，即共价闭合环状质粒DNA有一条链断裂，(open circular DNA，简称ocDNA)，线状质粒DNA，即质粒DNA 在同一处两条链都发生断裂(linear DNA，简称LDNA)。由于这3种构型的质粒DNA 分子在凝胶电泳中的迁移率不同，因此通常抽提的质粒在电泳后往往出现3条带，其中超螺旋质粒DNA泳动最快，其次为线状DNA，最慢的为开环质粒DNA。注意事项：

1.通常DNA凝胶电泳使用浓度为1％的胶，即0.25g琼脂糖加25mlATE缓冲液，在微波炉中以低中火加热2min即可。

2.电泳时，取用5ul的样品，加入1ul的6×Loding Buffer(溴酚蓝)充分混匀。溴酚蓝充当电泳指示剂和上样缓冲剂。当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1—2cm处，停止电泳。

3.电泳缓冲剂至电泳槽中，加液量要使液面没过胶面1-1.5毫米。

4.DNA的迁移速度与电场强度成正比，一般电场强度不要超过5V／cm。一般用100-120V即可。

5.电泳好后放入EB（溴化乙锭）溶液中染色20-30min即可，染色时间不可过长，时间过长会导致DNA分解，产生弥散。

实验四DNA重组

[实验原理]

DNA重组是将外源DNA与载体分子连接，这样重新组合的DNA叫做重组体或重组子。DNA重组的方法主要有粘端连接法和平端连接法。重组的DNA 分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。常用的DNA连接酶是T4噬菌体DNA连接酶，它不但能使粘性末端的DNA分子连在一起，而且能使平末端的双链DNA分子连接起来，但这种连接的效率比粘性末端的连接效率低，一般可通过提高T4噬菌体DNA连接酶浓度或增加DNA浓度来提高平末端的连接效率。如果是单酶切，为了防止载体本身的自身连接，可以用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）处理，去掉酶切后5'端的磷酸。这样做能有效防止质粒的自身环化，降低转化的背景，大大提高重组子的筛出效率。连接反应的温度在37℃时有利于连接酶的活性，但是在这样的温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。一般的