蛋白质A的表达、制备及鉴定

XXX大学

生物技术综合实验论文

论文题目：《蛋白质A的表达、制备及鉴定》所在班级：生物技术

学号：XXXXXXXXXXXXX

学生姓名：XXXX

指导老师：XXX XXXX

时间：2010.9 —2010.11

目录

一、前言 (3)

1.1有关SPA (3)

1.1.1 金黄色葡萄球菌A蛋白的简介 (3)

1.1.2 SPA的结构特点 (3)

1.1.3 SPA的生物活性 (3)

1.1.4 SPA的应用 (4)

1.2实验相关原理 (5)

1.2.1外源基因的表达 (5)

1.2.2SDS-PAGE检测表达的蛋白质 (5)

1.2.3 Western blotting (6)

二、材料与方法 (7)

2.1材料 (7)

2.1.1表达载体与抗体 (7)

2.1.2 主要仪器 (7)

2.1.3 主要药品和溶液 (7)

2.1.2.1 SPA基因的诱导表达 (7)

2.1.2.3 Western blotting (10)

2.2 方法 (11)

2.1.1 SPA的表达 (11)

2.1.2 SPA的提取 (12)

2.1.3 破细胞收菌 (12)

2.1.4 SDS-PSGE检测表达的蛋白质 (12)

2.1.5 Western blottong (13)

三、实验结果与讨论 (13)

3.1 实验结果 (13)

3.1.1 SDS-PAGE检测表达的蛋白质 (13)

3.2.2 western blotting (14)

3.2 结果分析 (14)

3.2.1 SDS-PAGE的分析 (14)

3.2.2 western blotting的分析 (14)

3.2.3 综述 (15)

3.3 实验讨论 (15)

3.3.1 SDS-PAGE的讨论 (15)

3.3.2 western blotting的讨论 (16)

3.3.3 实验建议 (16)

四、结语 (17)

【摘要】：本试验通过用大肠杆菌表达系统表达金黄色葡萄球菌蛋白 A （SPA），IPTG 诱导大肠杆菌表达，用超声波破细胞收菌提取SPA ，SDS-PAGE及western blotting分析，完成了对SPA的表达、制备、鉴定。

【关键词】：SPA SDS-PAGE western blotting

一、前言

1.1有关SPA

1.1.1 金黄色葡萄球菌A蛋白的简介

金黄色葡萄球菌A蛋白(Staphylococcal Protein A、简称SPA)是细胞壁抗原的主要成分，几乎90%以上的菌株均含有这种成分，但不同的菌株含量差别十分悬殊。SPA 存在于大多数(90％)金黄色葡萄球菌中，而不存在于表皮葡萄球菌中，并且主要存在于血浆凝固酶阳性菌株，而不存在于阴性菌株中，前者是致病的，后者是非致病的.

1.1.2 SPA的结构特点

SPA为蛋白质成分，由三部分组成，第一部分为信号肽序列；第二部分为与lgG 结合的E、D、A、B、C五个高度重复的功能域，每区由58个以上的氨基酸组成，不含色氨酸和半胱氨酸；第三部分为蛋白质与细胞壁肽聚糖结合的具有高度重复序列的功能域，共有395个氨基酸残基，蛋白紫外光谱为275nM，等电点为pH5.1，仅含少量或不含碳水化合物。一般在每个菌体细胞壁上约有8万个SPA分子，约占细胞壁总重的6．7％。因提取及测定方法不同其分子量有差异，用脱氧核糖核酸酶消化细胞壁后超速离心或用加热油提法，所测分子量为12000-15000D，用沉淀平衡分析和在6mol／L鸟嘌呤盐酸盐中凝胶过滤，测出分子量为42000D。其天然结构十分稳定，在应用6mol／L鸟嘌呤盐酸盐变性剂的条件下，尚能保存某些三级结构，如将此变性剂除去，则能自然矫正而恢复原有结构[1]。

1.1.3 SPA的生物活性

SPA能与血清IgG起反应，作用部位是IgG Fc段而不是Fab段，认为IgG与SPA 的结合是非特异性的“假免疫反应”，这种结合不会影响抗体的活性。现己表明SPA 除与人血清中的IgG结合外还能与豚鼠、小白鼠、狍、猪、貂、猴，北极熊等动物血

清中的IgG结合，其中与猪的IgG结合力最强，与大白鼠、羊、鸡、刺猬、鱼类、两栖类及大部分鸟类等动物血清中的IgG不结合。SPA除与IgG结合还能与IgA2，和IgM 反应，SPA与IgM的结合区位于互补决定区及开放读码框架，D结构域与其他结构域比较对IgM及IgA亲和力较高。另外SPA是一种B细胞激活剂，具有对B淋巴细胞促有丝分裂作用，固相SPA作用明显，并不需要T细胞辅助，可容性SPA作用微弱，必须有T细胞参与。由于IgG的Fc段结合点既是lgG调理活性结合点，又是SPA反应点。因此，SPA可与吞噬细胞竞争，结果抑制了多形核白细胞的吞噬作用，也可能是SPA阻断调理素与吞噬细胞作用的结果。引起豚鼠离体回肠产生类似过敏反应样的收缩和家鼠局部过敏样坏死，有研究显示SPA与鼠类的脓毒性关节炎有关刺激机体免疫反应刺激人体角膜细胞使其NF．1cB活化和细胞因子TNF-aand 1I_,-8时间依赖性分泌，能剂量依赖性的刺激淋巴细胞分泌IgM抗体向lgG抗体的转化[2、3]。

1.1.4 SPA的应用

SPA研基于SPA与IgG的Fc段的结合能力，自70年代开始，国外应用SPA建立了许多敏感、特异性强、快速和简易的实验方法，SPA在免疫学、微生物学等领域得到了广泛应用，并在许多方面的应用中积累了实际应用的材料，现已广泛应用到免疫学及其相关科学如细胞学、细菌学和病毒学等。

1．作为广谱第二抗体由于SPA能与多种动物的IgG的Fc段结合，因此，作为第二抗体或标记抗体，SPA的最大优点是不受种属特异性的限制；

2．用来纯化免疫球蛋白由于SPA与IgG及其某些亚型的Fc段有较强的结合力，可利用来提纯、分析免疫球蛋白制剂，结合后的PSA．IgG可再用解离剂如4mol／L 尿素、4mol／L，硫氰酸盐或6mol／L的鸟嘌呤盐酸盐使之解离.大量研究表明SPA 是一种比较理想的提纯和分析免疫球蛋白的试剂[3]。

3．应用于免疫细胞化学由于SPA具有双价结合力，在免疫细胞化学技术中可作为桥抗体或标记抗体，同样，于SPA能与多种动物的IgG的FC段结合，不受种属特异性的限制，故在目前各种免疫细胞化学技术中也已得到广泛的应用。SPA分子量小(13000-42000)，易于穿透组织，而免疫球蛋白酶标记抗体为200000，PAP复合物为430000，均较SPA分子量大。

4．可作为一种研究免疫复合物、膜抗原、膜受体和膜Ig的固相吸附剂。SPA用于细胞膜抗原、表面IgG和Fc受体的研究最大特点是能研究活细菌。已得到愈来愈广泛的应用，是一种较为理想的免疫电镜技术。