汉恒腺病毒载体操作手册

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腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖 85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生 95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 9 5.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 115.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 17 5.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20 第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Gal actopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介13.2AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程2 4第二章应用重组腺病毒的优点4.1技术3 将基因克隆入AdEasyTM转移载体4 第三章AdEasyTM4.1.13 3.1技术概况缩写英文全称中文全称AdAdenovirus腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB培养基MCSMultipleCloningSite5Ad5Adenovirusserotype5血清型腺病毒多克隆位点分钟腺病毒载体MinMinuteAdV AdenoviralVector AmpAmpicillin氨苄青霉素感染复数MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) -半乳糖苷酶β-Galβ-GalactosidaseβRNA mRNAMessengerRNA信使MWCOMOIecularWeightCut-offbpBasePair碱基对PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresisBSABovineSerumAlbumin小牛血清白蛋白聚丙烯凝胶电泳PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液互补cDNAComplementaryDNADNADNA 闭环螺旋空斑形成单位PFUPlaqueFormingUnitcccDNAClosedCircularCoiledDNA CPECytopathicEffect细胞病理效应感染后piPostInfection CsClCesiumChloride氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus增殖性腺病毒培养基DMEMDulbecco'sModifiedEagleMediumDMEM RITRRightInvertedTerminalRepeat右侧反向末端重复DMSODimethylSulfoxide二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate十二烷基硫酸钠乙二胺四/二硫苏糖醇DTTDithiothreitol TBETrisBorate/EDTA三羟甲基氨基甲烷硼酸盐EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid乙二胺四乙酸乙酸组织培养感染剂TCID50TissueCultureInfectiousDose5050%溴化乙锭EtBrEthidiumBromide量FBSFetalBovineSerum胎牛血清TCPTotalCellularProtein细胞总蛋白小时HrHourITRInvertedTerminalRepeat反向末端重复溶液TETris/EDTA TE 卡那霉素KanKanamycin wtWildType野生型溴千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5-kbKilobases半乳糖苷-3--4-氯吲哚-千道尔顿KDaKiloDaltons β-D-第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒中文操作手册

腺病毒中文操作手册腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1 第二章应用重组腺病毒的优点 2 第三章AdEasyTM 技术 3 3.1 技术概况 3 3.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程 3 第四章主要流程 4 4.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 4 4.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体54.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 5 4.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A 细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术7 第五章常见技术85.1 QBI-293A细胞培养8 5.1.1 QBI-293A细胞的初始培养8 5.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖8 5.1.3 QBI-293A细胞的冻存8 5.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生9 5.2.1 感染QBI-293A细胞95.2.2 病毒空斑形成9 5.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞9 5.3 MOI测定10 5.4 腺病毒感染力测定105.4.1 X-Gal染色11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化11 5.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表示和基因输送11 5.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增125.5.3 Western杂交13 5.5.4 Southern杂交和点杂交13 5.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定145.5.7 功能测定14 5.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增15 5.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒16 5.7.1 不连续密度梯度离心17 5.7.2 连续密度梯度离心17 5.7.3 病毒溶液去盐和浓集17 5.8 病毒滴度测定185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法20 5.8.3 50%组织培养感染剂量法20 第六章疑难解答226.1 QBI-293A细胞培养22 6.2 感染力测定22 6.3 转移载体克隆23 6.4 在BJ5183细胞中共转化和重组246.5 转染QBI-293A细胞25 6.6 筛选和测定25 6.7 在QBI-293A细胞中表示26 6.8 重组腺病毒的扩增26 6.9 纯化26 6.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNA cccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNA CPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-off PAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)使用指南1404

自噬双标腺病毒〔mRFP-GFP-LC3〕使用指南背景：自噬是细胞内的一种“自食〔Self-eating〕〞的现象，凋亡是“自杀〔Self-killing〕〞的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚. 自噬是指膜〔目前来源还有争议，大部分表现为双层膜，有时多层或单层〕包裹部分胞质和细胞内需降解的细胞器、蛋白质等形成自噬体，最后与溶酶体融合形成自噬溶酶体，降解其所包裹的内容物，以实现细胞稳态和细胞器的更新。

目前文献对自噬过程进行观察和检测常用的策略和手段有：通过western blot检测LC3的剪切；通过电镜观测自噬体的形成；在荧光显微镜下采用GFP〔-RFP〕-LC3等融合蛋白来示踪自噬体形成以与降解。

近几年对自噬流的研究日趋增多，针对于此我们汉恒生物科技〔XX〕XX自主研发了用于实时监测自噬(流)的mRFP-GFP-LC3腺病毒，mRFP 用于标记与追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP 荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

这种串联的荧光蛋白表达载体系统直观清晰的指示了细胞自噬流的水平，是我们自噬研究尤其是自噬流研究不可或缺的利器。

mRFP-GFP-LC3腺病毒的操作收到病毒后的处理〔一〕、腺病毒的储存1、腺病毒采用冰袋运输。

〔1〕、收到病毒液后如未融化请置于-80℃冰箱，下次使用时再进行分装；〔2〕、如客户收到时腺病毒已融化，请直接分装后置于-80℃冰箱保存；若短期内用于实验，可分装部分于4℃保存〔尽量一周内用完〕。

2、尽量避免反复冻融，否则会降低病毒滴度〔每次冻融会降低病毒滴度10%〕。

建议不要在-20℃下长期保存。

如果病毒储存时间超过6个月，应该重新测定病毒滴度。

3、建议收到病毒产品后根据实验需求自行分装或购买经过分装的小包装病毒产品〔购买时请提出〕。

汉恒生物-病毒载体操作安全手册

病毒载体操作安全手册引言根据W HO生物安全手册对感染性微生物的相对危害程度制订的危险度等级的划分标准。

病毒的危险度为 4 级，它对个体和群体的危险均高，通常能引起人或动物的严重疾病，并且很容易发生个体之间的直接或间接传播，对感染一般没有有效的预防和治疗措施。

所以我们需要制定一定的安全注意事项，包括设备的要求、操作人员的防护、操作的规范性以及废弃物的处理等，以避免潜在的危险。

一、病毒房设备要求我们知道细胞培养技术与其他一般实验室工作的主要区别在于要求保持无菌操作，避免微生物及其他有害因素的影响。

目前超净工作台的广泛使用，很大程度上方便了组织细胞培养工作，并使一些常规实验室有可能用于进行细胞培养。

细胞培养实验室应能进行六方面的工作：无菌操作、孵育、制备、清洗、消毒灭菌处理、储藏。

病毒房的设备在普通细胞房的基础上要求更高，尤其是其无菌操作设备。

(一)无菌操作区1、无菌操作室：无菌操作区只限于细胞培养及其他无菌操作的区域，最好能与外界隔离，不能穿行或受其他干扰。

理想的无菌操作室应划为三部分：1（1）更衣室—―供更换衣服、鞋子及穿戴帽子和口罩。

（2）缓冲间—―位于更衣间与操作间之间，目的是为了保证操作间的无菌环境，同时可放置恒温培养箱及某些必需的小型仪器。

（3) 无菌操作间—―专用于无菌操作、细胞培养。

无菌操作间的空气消毒：紫外线灯。

2、二级生物安全柜：生物安全柜是为操作原代培养物、菌毒株以及诊断性标本等具有感染性的实验材料时，用来保护操作者本人、实验室环境以及实验材料，使其避免暴露于上述操作过程中可能产生的感染性气溶胶和溅出物而设计的。

（二）孵育区本区对无菌的要求虽不比无菌区严格，但仍需清洁无尘，因此也应设置在干扰少而非来往穿行的区域。

孵育一般可在恒温培养箱内进行。

（三）制备区在该区主要进行培养液及有关培养用的液体等的制备，如条件有限，可以在操作区进行。

（四）储藏区主要存放各类冰箱、干燥箱、液氮罐、无菌培养液、培养瓶等，此环境也需要清洁无尘。

汉恒腺病毒载体操作手册

4、细胞离心，1000rpm，5min。去掉上清。 5、根据细胞计数结果加入细胞冻存液（70%完全培养基 +20%FBS+10%DMSO）,重悬细胞，密度为 3 x 106 个/ml。 6、分装进细胞冻存管，放入冻存盒中，放入-80℃超低温冰箱。 7、第二天将细胞放于液氮罐中长久保存，并作记录。保存过程中，要不时复苏细胞检测细胞存活率，观察细胞状态等。
6
汉恒生物公司地址：上海市徐汇区斜土路
E-mail:service@
1175 号 15 楼

T实e验l：室02地1-址51：29上62海58市张江高科技园区蔡伦路 781 弄张江药谷 503
腺病毒载体操作手册
四、腺病毒包装、扩增和纯化
（一）腺病毒包装
5118bp
GFP
(NotI ) (NcoI ) (NcoI )
pUC ori
SV40 PolyA LoxP
HindIII
[ SacI SalI
Amp r pUC ori
SacII
XbaI(456)
ITR
ITR
1
(NdeI )
(NdeI )
NheI(1384)
pHB Ad-U6-RFP 4993bp
1
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腺病毒载体操作手册
蛋白（GFP）。pHBAd-CMV-IRES-RFP 和 pHBAd-U6-RFP 能表达红色荧光蛋白（RFP）。
3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。

腺相关病毒操作手册--汉恒生物

汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 1汉恒生物---腺相关病毒操作手册一、腺相关病毒（Adeno-Associated Viral Vector ，AAV ）简介腺相关病毒属微小病毒科( parvovirus)，为无包膜的单链线状 DNA 病毒。

AA V 的基因组约 4700bp ，包括上下游两个开放读码框架(ORF)，位于分别由 145 个核苷酸组成的2个反向末端重复序列(ITR)之间。

基因组中有 3 个启动子(P5、P19 和 P40) 和 2 个开放阅读读框(ORF)，rep 和 cap ，如图 1 所示。

rep 编码 4 个重叠的多功能蛋白，即 Rep78、Rep68、Rep52 和 Rep40，其中 Rep78 与 Rep68 参与 AA V 的复制与整合，Rep52 和 Rep40 具有解螺旋酶和 ATP 酶活性，与 Rep78、Rep68 共同参与单链基因组的复制；cap 编码的 VP1、VP2、VP3是装配成完整病毒所需要的衣壳蛋白，它们在 AA V 病毒整合、复制和装配中其重要作用。

图 1. AA V 基因组结构二、腺相关病毒的优点1. 安全性高：迄今从未发现野生型A A V 对人体致病，重组A A V 基因组序列上去除了大部分的野生型A A V 基因组元件，进一步保证了安全性；2. 免疫原性低：AA V2 的基因组仅 4681 个核苷酸，便于用常规的重组 DNA 技术进行操作，而且进行动物实验时造成的免疫反应小；3. 宿主范围广：能感染分裂细胞和非分裂细胞；4. 表达稳定：能介导基因的长期稳定表达；5. 物理性质稳定：在60℃不能被灭活，能抗氯仿；三、重组腺相关病毒载体系统简介汉恒生物科技(上海)有限公司 400‐092‐0065 2AAV 是一种复制缺陷型微小病毒，其增殖复制需要腺病毒或疱疹病毒的辅助。

AAV 无辅助病毒系统（AAV Helper-Free System ）可以在无辅助病毒的条件下生产出重组腺相关病毒。

ips操作指南-腺病毒版本

IPS操作指南第四版IPS操作指南--腺病毒版本IPS简介：iPS细胞是通过基因转染技术（gene transfection）将某些转录因子导入动物或入的体细胞使，体细胞直接重构成为胚胎干细胞（embryonic stemcell,ESC）细胞样的多潜能细胞。

现在大多是通过病毒携带特定的转录因子进入体细胞内，来获得多能性干细胞。

2006年日本京都大学Shinya Yamanaka在世界著名学术杂志《细胞》上率先报道了诱导多能干细胞的研究。

他们把Oct3/4,Sox2、c-Myc和Klf4这四种转录因子基因克隆入病毒载体，然后引入小鼠成纤维细胞，发现可诱导其发生转化，产生的iPS细胞在形态、基因和蛋白表达、表观遗传修饰状态、细胞倍增能力、类胚体和畸形瘤生成能力、分化能力等方面都与胚胎干细胞相似。

用Retrovirus、Lentivirus诱导IPS成功的例子已经非常多，但是由于retrovirus和lentivirus的基因组整合性，往往伴随基因组的破坏与癌化。

用Lentivirus和retrovirus 建立的IPS子宫移植繁衍而成的克隆鼠往往都伴随着肿瘤的高发生率。

Adenovirus（腺病毒）是一类滴度极高，不整合基因组，可以简单实现高效感染的病毒载体，近年来以Adenovirus介导的IPS诱导已被证实成功且安全。

一、实验材料腺病毒OSKM四因子：Ad-OCT4、Ad-SOX2、Ad-KLF4和Ad-c-MYC；病毒扩增细胞：293A细胞；ES Feeder细胞：MEF（C57）。

二、实验仪器和耗材（一）实验仪器二级安全柜、37度培养箱、4度冰箱、液氮储存器、倒置显微镜、低温离心机。

耗材PBS、无菌水、明胶粉、DMEM培养基、FBS、非必须氨基酸、β-巯基乙醇、胰酶、血清替代物（SR）、mTESR1、T75培养瓶、无菌水、15ml离心管、50ml离心管，巴氏管等。

三、ips诱导方法（一）Feeder细胞1、Feeder细胞的分离（MEF）取妊娠13.5-14.5d的孕鼠，在无菌情况下取出胎鼠，去除鼠头，尾，四肢及内脏，然后用PBS进行冲洗。

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明

汉恒生物无缝克隆试剂盒使用说明一、试剂盒的内容物概述：1.无缝克隆启动载体：该载体为无缝克隆试剂盒的核心部分，包含了无缝克隆所需的各种元件，如多克隆位点、选择标记等。

2.多克隆位点插入片段：该片段用于插入到无缝克隆启动载体中，并可用于构建目的表达载体。

3.切割酶：用于对目的基因和无缝克隆启动载体进行切割，以便于插入片段可以与启动载体连接。

4.酶切缓冲液：用于稀释切割酶和提供最适宜的环境条件，以保证酶切反应的进行。

5.连接酶：该酶可使目的基因插入到无缝克隆启动载体中的多克隆位点上。

6.连接酶缓冲液：用于稀释连接酶和提供最适宜的环境条件，以保证酶切反应的进行。

7.质粒提取试剂盒：用于提取构建好的质粒，以便于后续的获得目的基因。

二、试剂盒的使用步骤：1.酶切实验准备：a.取出所需的切割酶和酶切缓冲液，根据实验需求合理稀释。

b.根据所需的目的基因和启动载体的大小，选择适当的酶切位点和酶切缓冲液。

c.将所需的目的基因和启动载体取出，并按照实验要求分别加入切割酶和酶切缓冲液，固定加入量为1μgDNA。

d.在37℃下孵育1-2小时，将酶切反应停止。

2.连接实验准备：a.取出所需的连接酶和连接酶缓冲液，根据实验需求合理稀释。

b.将酶切后的目的基因和启动载体取出，并按照实验要求分别加入连接酶和连接酶缓冲液。

c.在16℃下孵育16-18小时，将连接反应停止。

3.质粒提取：a.取出质粒提取试剂盒，按照说明书的步骤进行质粒提取。

b.质粒提取后，可通过电泳实验证实提取到了目的基因。

c.取出目的基因，可用于后续的目的表达。

三、注意事项：1.实验前应充分准备好所需的试剂、仪器和实验器具，确保实验的顺利进行。

2.在使用切割酶和连接酶时，应注意避免反复冻融，以免降低酶活性。

3.在酶切和连接反应中，孵育温度和时间是非常关键的，应根据说明书上的建议进行操作。

4.实验中应注意无菌操作，以防止外源性DNA的污染。

5.在酶切和连接反应后，应通过电泳实验验证实验结果，确保实验成功。

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM 操作手册目录第一章简介 1 3.2AdEasyTM 系统中产生重组腺病毒的时程 3第二章应用重组腺病毒的长处 2 第四章主要流程 4第三章 AdEasyTM 技术 3 4.1 将基因克隆入 AdEasyTM 转移载体 43.1 技术概略 3缩写英文全称中文全称AdAdenovirus 腺病毒LBLuria-Bertani(broth)LB 培育基Ad5Adenovirusserotype5 血清 5 型腺病毒MCSMultipleCloningSite 多克隆位点AdVAdenoviralVector 腺病毒载体MinMinute 分钟AmpAmpicillin 氨苄青霉素MOIMultiplicityofInfection(Virus/Cell) 感染复数β-Gal β-Galactosidase - 半β乳糖苷酶mRNAMessengerRNA 信使 RNAbpBasePair 碱基对MWCOMOIecularWeightCut-offBSABovineSerumAlbumin 小牛血清白蛋白PAGEPolyAcrylamideGelElectrophoresis 聚丙烯凝胶电泳cDNAComplementaryDNA 互补 DNA PBSPhosphateBufferedSaline 磷酸盐缓冲液cccDNAClosedCircularCoiledDNA 闭环螺旋 DNA PFUPlaqueFormingUnit 空斑形成单位CPECytopathicEffect 细胞病理效应piPostInfection 感染后CsClCesiumChloride 氯化铯RCAReplicationCompetentAdenovirus 增殖性腺病毒DMEMDulbecco’ sModifiedEagleMediumDMEM 培育基RITRRightInvertedTerminalRepeat 右边反向尾端重复DMSODimethylSulfoxide 二甲基亚砜SDSSodiumDodecylSulfate 十二烷基硫酸钠DTTDithiothreitol 二硫苏糖醇TBETrisBorate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四EDTAEthyleneDiamineTetraaceticAcid 乙二胺四乙酸乙酸EtBrEthidiumBromide 溴化乙锭TCID50TissueCultureInfectiousDose5050% 组织培育感染剂FBSFetalBovineSerum 胎牛血清量HrHour 小时TCPTotalCellularProtein 细胞总蛋白ITRInvertedTerminalRepeat 反向尾端重复TETris/EDTATE 溶液KanKanamycin 卡那霉素wtWildType 野生型kbKilobases 千碱基对X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactopyranoside5- 溴KDaKiloDaltons 千道尔顿-4-氯 -3-吲哚 -β-D- 半乳糖苷第一章简介此刻基因输送技术的发展日益复杂，一些治疗药物（生长激素、扰乱素、抗病毒和抗癌复合物）和诊疗性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

腺病毒包装操作手册

汉恒重组腺病毒操作手册目录腺病毒安全使用和注意事项腺病毒储存与稀释的注意事项一、整体实验流程二、实验材料三、腺病毒包装和浓缩四、重组腺病毒滴度（PFU）的测定五、重组腺病毒感染目的细胞六、重组腺病毒用于动物实验附1：汉恒生物腺病毒载体附2：腺病毒感染细胞最佳MOI的摸索（表达荧光的病毒）附3：汉恒生物常见三种病毒感染目的细胞比较腺病毒安全使用和注意事项➢腺病毒安全使用注意事项（*非常重要*）1) 腺病毒相关实验请在生物安全柜（BL-2级别）内操作。

2) 操作病毒时请穿实验服，佩戴口罩和手套，尽量不要裸露双手及手臂的皮肤。

3) 操作病毒时需要特别小心病毒溅出。

如果操作时超净工作台有病毒污染，请立即用70%乙醇加 1%的SDS溶液擦拭干净。

4) 接触过病毒的枪头、离心管、培养板及培养瓶请用84消毒液浸泡后统一处理。

5) 如实验过程中需要离心，应使用密封性好的离心管，必要时请用封口膜封口后离心。

6) 病毒相关的废弃物需要特殊收集，统一经高温灭菌后处理。

7) 实验完毕后请用香皂清洗双手。

➢腺病毒储存与稀释的注意事项1）腺病毒的储存收到病毒液后若在短期内使用，可将病毒放置于 4℃保存（一周内使用完最佳）；如需长期保存请分装后放置于 -80 ℃ 。

注：a.反复冻融会降低病毒滴度（每次冻融会使病毒滴度降低10%~50%），因此在病毒使用过程中尽量避免反复冻融。

汉恒生物对病毒已进行分装（200 μl/tube），收到后请直接放置-80℃冰箱保存即可。

b.若病毒储存时间超过6个月，汉恒生物建议在使用前重新测定病毒滴度（参见附表2-慢病毒滴度测定方法）。

2）腺病毒的稀释需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰浴融解后，使用PBS或培养目的细胞用的无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后置于 4℃保存(一周内使用完最佳)。

重组腺病毒是一种复制缺陷的腺病毒载体系统，在基因治疗、基础生命科学研究等领域被广泛应用。

汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版

2. 感染细胞最佳 MOI 的测定 MOI（Multiplicity of Infection，感染复数）是指每个细胞感染的病毒
数，通常 MOI 越高，病毒整合到染色体的数量以及目的蛋白的表达量越高。对于分裂活跃的细胞，比如 Hela、293 细胞，MOI=1～3 时，80%以上的细胞均表达目的基因。而对于非分裂细胞，比如原代细胞，感染效率较低。需要进行 MOI 梯度摸索实验，选择适合的 MOI 进行实验。
四、慢病毒包装和浓缩（一）质粒扩增
构建好的慢病毒载体和辅助质粒需经过大量抽提，浓度大于 1ug/ul,A260/280 在 1.7-1.8 间方可用以包毒。推荐使用 Qiagen 大抽试剂盒进行质粒的大量去内毒素抽提。（二）传 293T 细胞
将培养 293T 细胞 T75 瓶中的培养基吸净，加入 2mL 4 度冰箱取出的 0.25% 胰酶，使其均匀覆盖瓶底，置于 37 度培养箱中 3-5min，取出，摇晃可发现细胞于底部脱离，将其全部晃下，加入 3mL 37 度水浴中预热的 10％ DMEM，移液枪用 10mL 移液管进行吹打，较大力吹打 6-8 次即可，不留死角，瓶口处较难吹打可将移液管对准培口，小力将培养基打出即可覆盖到接近瓶口的细胞。之后，将所有细胞吸出，置于 15mL 离心管中，取 50ul 混匀后的细胞于 1.5mL eppendorf
当细胞传代次数过多，细胞状态变差时，或者细胞出现污染事故时，需要丢弃并对最初冻存的细胞进行复苏。
1、设置温度为 37~42℃的水浴。 2、查看细胞库记录，根据记录从液氮罐中取出冻存的细胞（需戴上棉手套，防止被冻伤），迅速丢入水浴锅中并快速晃动，尽量在 1~2min 内使细胞溶液完全溶解。 3、将细胞溶液转移到 15ml 离心管中，并在其中加上 1ml 新鲜的完全培养基，混匀后离心，1000rpm，5min。 4、去掉上清，加入 5ml 新鲜的完全培养基，混匀沉淀后，转入 6cm 培养皿。 5、将培养皿平稳放入 37℃、5%CO2 和 95%相对湿度的培养箱中培养。 6、第二天观察细胞存活率。给细胞换一下培养基。以后每天观察细胞生长情况。

AAV-LC3操作手册

体内自噬研究工具-AAV-mRFP-GFP-LC3关于自噬：自噬（autophagy）自噬是细胞在自噬相关基因(autophagy related gene，Atg)的调控下利用溶酶体降解自身受损的细胞器和大分子物质的过程。

自噬是生物机体的一种细胞内部压力协调与代谢机制，所以，自噬是发生在细胞内部的，以细胞为发生单位的一种表现。

关于自噬的作用讨论详见《汉恒生物-自噬（Autophagy）及其研究方法概述》技术文件。

Zhifen Yang&Daniel J.Klionsky,Nature Cell Biology12,814–822 (2010)细胞自噬自噬发生在细胞内部的一种机制，而千千万万的细胞形成了组织，器官，系统，最终协调形成了复杂的生命综合体。

正是由于自噬是细胞内部的一种压力应对机制，研究自噬时，除了LC3IIB的Western blot检测和电镜检测，我们经常还需要将细胞从实验动物中分离，并应用汉恒LC3双标腺病毒（Ad-mRFP-GFP-LC3：汉恒LC3双标，自噬研究金指标）进行体外细胞自噬流实时检测。

汉恒LC3双标-细胞自噬流检测体系：mRFP-GFP-LC3融合蛋白的病毒产品。

mRFP用于标记及追踪LC3，GFP的减弱可指示溶酶体与自噬小体的融合形成自噬溶酶体，即由于GFP荧光蛋白对酸性敏感，当自噬体与溶酶体融合后GFP荧光发生淬灭,此时只能检测到红色荧光。

通过显微镜成像后，计算红黄光点的数量以衡量自噬流的强弱；比较红黄点的数量，以评价自噬流的平衡状态。

体内自噬研究汉恒通过将体内基因转染利器-腺相关病毒红绿荧光merge后通过merge后出现的黄色斑点即只是自噬体.红色的斑点指示自噬溶酶体,通过不同颜色斑点的计数可以清晰的看出自噬流的强弱。

如下图:细胞转染mRFP-GFP-LC3病毒后给予氨基酸剥夺处理2小时后出现明显增强的自噬以及自噬流。

自噬是细胞内的一种“自食（Self-eating）”的现象，凋亡是“自杀（Self-killing）”的现象，二者共用相同的刺激因素和调节蛋白，但是诱发阈值和门槛不同，如何转换和协调目前还不清楚。

汉恒生物CRISPR protocol-2质粒构建和建系

CRISPR/Cas9系统操作说明-2
---基于lentiCRISPR v2应用指南-载体构建和建系
汉恒生物提供CRISPR/Cas9载体的快速构建试剂盒，同时也提供各种载体构建和病毒包装（慢病毒、腺病毒和AAV）、建系服务
说明
lentiCRISPR v2载体是张锋实验室发布一个慢病毒载体，cas9和sgRNA表达框在同一各载体上。而且Cas9的C端带有FLAG融合标签，载体包含Puromycin抗性基因，适合建系。验证sgRNA活性的时候也适合顺转；包装成慢病毒适合常规细胞系的建系。构建非常方便。
oligo就需要加磷处理！！！（红色框内是FengZhang提供的protocol，设计脱磷，可以参考））
仅作参考
病毒包装体系
包装病毒使用的包装体系如下（for 100 mm dish， 6x106 293T）
4 μg 3 μg 1 μg lentiCRISPR v2-gDNA plasmid psPAX2 packaging plasmid pMD2.G envelope plasmid
单克隆的挑取---单克隆可以有限稀释到96-well plate（～30 cells/plate）
（293T、HeLa、MEF等细胞系推荐使用）。如果编辑效率50%，推荐分两块plate即可，最终拿到20-30个单克隆一般可以得到成功KO的细胞系；或者铺到100 mm dish里，一周后挑取单克隆（这种方法适合单细胞不容易成活的细胞系如，但是挑取的单克隆偶尔不纯，有时需要重新亚克隆）。
目的细胞系的感染/转染
转染（2 g plasmid/60 mm dish，细胞密度60-80%）
【v2=lentiCRISPR v2，下同】

(整理)腺病毒载体操作手册1407-R2

腺病毒载体操作手册一、实验流程制备腺病毒穿梭质粒，分别高纯度无内毒素抽提腺病毒穿梭质粒和骨架质粒，共转染293A细胞，转染后6h更换为完全培养基，培养十几天，在中间四五天左右更换一次新鲜培养基，然后收集细胞和1ml培液置于15ml离心管后，液氮/37度冻融三次（冻-融要彻底），2000rpm离心5分钟，取上清即为病毒液初代原液。

连续三代反复扩增收集病毒后，行病毒的大量扩增，然后通过CsCl密度梯度离心-透析联用法纯化病毒。

二、实验材料（一）腺病毒载体、包装细胞和菌株该病毒包装系统为两质粒系统，组成为穿梭质粒（包括pHBAd-CMV-IRES-GFP,pHBAd-CMV-IRES-RFP,pHBAd-U6-GFP, pHBAd-U6-RFP）和骨架质粒pBHGlox（delta）E1,3Cre。

其中穿梭质粒pHBAd-CMV-IRES-GFP和pHBAd-U6-GFP能表达绿色荧光蛋白（GFP）。

pHBAd-CMV-IRES-RFP和pHBAd-U6-RFP能表达红色荧光蛋白（RFP）。

1、载体信息1) 腺病毒克隆载体图谱如下：各载体用途如下表：2）骨架质粒信息如下：2、细胞株293A，腺病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，经培养生长增殖形成单层细胞,生长培养基为DMEM(含10% FBS)。

3、菌株大肠杆菌菌株DH5α。

用于扩增腺病毒载体和腺病毒骨架载体质粒。

三、包装细胞293A细胞的培养（一）293A细胞的冻存293A细胞来源于一个用作空斑测定的亚克隆，具有易使用和易转染的特性。

该细胞株对于高细胞密度很敏感，当细胞超过70%汇合时，一些细胞可能会丢失它们的表型。

若细胞密度持续在70%以下，QBI-293A细胞则能连续培养3~4个月维持原有细胞特性。

若以购买得到的293A作为第一代，则30代内能得到最佳结果。

随着传代的次数增加，293A细胞会出现生长状态下降、突变等。

为了防止此类现象的出现，我们需要在开始就对细胞进行大量冻存，以保证实验的稳定性和持续性。

腺相关病毒包装操作手册

Arch3.0-EYFP pHBAAV-CMV-DIO-
hCHETA-EYFP pHBAAV-hSyneNpHR3.0-EYFP pHBAAV-hSynhChR2(H134R)-mcherry
启动子及其特点
CAG（人巨细胞病毒启动子 CMV 和鸡 beta-actin 嵌合型启动子），广谱，强
CMV（人巨细胞病毒启动子），广谱，强
4) 汉恒生物 AAV-mRFP-GFP-LC3 自噬流监测工具（表 4）
载体类型双标单标
载体名称
pHBAAV-mRFP-GFP-LC3 pHBAAV-GFP-LC3
启动子及其特点
CMV，广谱，强 CMV，广谱，强
标记基因
mRFP/GFP GFP
是否 Cre 依赖否否
五、整体实验流程（图 2）
图 1、 AAV2 基因组结构示意图。四、汉恒生物 AAV 产品服务及载体信息与现货列表 1. 汉恒 AAV 产品分类：
常规基因的过表达和干扰定制（载体列表见“七、载体构建”部分）；组织特异性启动子过表达定制（载体列表见“七、载体构建”部分）；常规启动子和组织特异性启动子驱动的 AAV-Cas9 定制； AAV 介导的光遗传、化学遗传载体现货及改造服务等（见表 1）；双标、单标 LC3 自噬流监测工具（见表 2）；组织特异性 AAV-DIO 载体的定制（原理见附件 2）。 2. 汉恒 AAV 产品特点：
hChR2(H134R)-mcherry
mcherry
否
pHBAAV-GFAP-ArchT-
抑制
EYFP
否
EYFP
GFAP（星形胶质细胞特异
红光激活
pHBAAV-GFAPC1V1 (t/t)-TS-mcherry

腺病毒中文操作手册

腺病毒载体操作手册中文版腺病毒重组系统AdEasyTM操作手册目录第一章简介 1第二章应用重组腺病毒的优点 2第三章 AdEasyTM 技术 33.1 技术概况 33.2 AdEasyTM系统中产生重组腺病毒的时程3第四章主要流程 44.1 将基因克隆入AdEasyTM转移载体 44.1.1 克隆的一般原则 44.1.2 构建重组AdEasyTM转移载体 5 4.2 细菌内AdEasyTM重组子的产生 54.2.1 共转化的一般原则 54.2.2 共转化方法 54.2.3 预期结果 54.3 AdEasyTM重组质粒的筛选和扩增 6 4.4 AdEasyTM重组子转染QBI-293A细胞 64.4.1 细胞铺板 64.4.2 磷酸钙转化技术 7第五章常用技术 85.1 QBI-293A细胞培养 85.1.1 QBI-293A细胞的初始培养 85.1.2 QBI-293A细胞的维持培养和增殖85.1.3 QBI-293A细胞的冻存 85.2 QBI-293A细胞的转染和病毒空斑的产生95.2.1 感染QBI-293A细胞 95.2.2 病毒空斑形成 95.2.3 琼脂糖覆盖被感染细胞 95.3 MOI测定 105.4 腺病毒感染力测定 105.4.1 X-Gal染色 11 5.5 重组腺病毒的筛选和纯化 115.5.1 挑选最佳重组腺病毒：表达和基因输送 115.5.2 病毒空斑挑选和小量扩增 125.5.3 Western杂交 135.5.4 Southern杂交和点杂交 135.5.5 病毒裂解产物PCR 145.5.6 免疫测定 145.5.7 功能测定 145.6 病毒颗粒在QBI-293A细胞中的大量扩增 155.7 两次氯化铯密度梯度离心纯化重组腺病毒 165.7.1 不连续密度梯度离心 175.7.2 连续密度梯度离心 175.7.3 病毒溶液去盐和浓集 175.8 病毒滴度测定 185.8.1 O.D.260 nm (VP/ml) 195.8.2 空斑测定法 205.8.3 50%组织培养感染剂量法 20第六章疑难解答 226.1 QBI-293A细胞培养 226.2 感染力测定 226.3 转移载体克隆 236.4 在BJ5183细胞中共转化和重组 24 6.5 转染QBI-293A细胞 256.6 筛选和测定 256.7 在QBI-293A细胞中表达 266.8 重组腺病毒的扩增 266.9 纯化 266.10 病毒滴度测定 27缩写英文全称中文全称Ad Adenovirus 腺病毒Ad5 Adenovirus serotype 5 血清5型腺病毒AdV Adenoviral Vector 腺病毒载体Amp Ampicillin 氨苄青霉素β-Gal β-Galactosidase β-半乳糖苷酶bp Base Pair 碱基对BSA Bovine Serum Albumin 小牛血清白蛋白cDNA Complementary DNA 互补DNAcccDNA Closed Circular Coiled DNA 闭环螺旋DNACPE Cytopathic Effect 细胞病理效应CsCl Cesium Chloride 氯化铯DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMEM培养基DMSO Dimethyl Sulfoxide 二甲基亚砜DTT Dithiothreitol 二硫苏糖醇EDTA Ethylene Diamine Tetraacetic Acid 乙二胺四乙酸EtBr Ethidium Bromide 溴化乙锭FBS Fetal Bovine Serum 胎牛血清Hr Hour 小时ITR Inverted Terminal Repeat 反向末端重复Kan Kanamycin 卡那霉素kb Kilobases 千碱基对KDa KiloDaltons 千道尔顿LB Luria-Bertani ( broth ) LB培养基MCS Multiple Cloning Site 多克隆位点Min Minute 分钟MOI Multiplicity of Infection (Virus/Cell ) 感染复数mRNA Messenger RNA 信使RNA MWCO MOIecular Weight Cut-offPAGE PolyAcrylamide Gel Electrophoresis 聚丙烯凝胶电泳PBS Phosphate Buffered Saline 磷酸盐缓冲液PFU Plaque Forming Unit 空斑形成单位pi Post Infection 感染后RCA Replication Competent Adenovirus 增殖性腺病毒RITR Right Inverted Terminal Repeat 右侧反向末端重复SDS Sodium Dodecyl Sulfate 十二烷基硫酸钠TBE Tris Borate/EDTA 三羟甲基氨基甲烷硼酸盐/乙二胺四乙酸TCID50 Tissue Culture Infectious Dose 50 50%组织培养感染剂量TCP Total Cellular Protein 细胞总蛋白TE Tris/EDTA TE溶液wt Wild Type 野生型X-Gal5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-Galactop yranoside 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷第一章简介当今基因输送技术的发展日趋复杂，一些治疗药物（生长激素、干扰素、抗病毒和抗癌复合物）和诊断性蛋白（单克隆抗体）的设计、发展与合成需要更高效的基因输送工具。

悬浮细胞专用腺病毒操作技术

汉恒悬浮细胞专用腺病毒操作技术文档腺病毒基本操作请参考“汉恒腺病毒操作手册”，但悬浮细胞专用腺病毒（Ads）一些特殊要点列举如下：一、悬浮细胞专用腺病毒（Ads）实验策略与关键知识点1.悬浮细胞专用：汉恒生物开发的悬浮细胞专用腺病毒针对悬浮细胞的细胞膜特性进行了腺病毒的改造，病毒感染体系也进行了相应的优化，极大改善对悬浮细胞的感染能力。

对贴壁细胞的感染能力无影响，可以通用（感染贴壁细胞请参考“汉恒腺病毒操作手册”）。

2. 超强感染效率汉恒悬浮细胞专用腺病毒对Jurkat、K562等众多悬浮培养细胞系感染效率接近100%，对血液来源原代细胞，如CD4+ T细胞感染效率可达60%以上。

3.腺病毒的细胞感染特性：1）腺病毒不插入细胞基因组，不形成稳定转染；2）腺病毒的瞬时表达能力一般为2-4周，细胞增殖越快，表达时间越短；3）由于不会随机插入损伤基因组，相比较慢病毒，腺病毒对体外培养的目的细胞毒性较小，因此可以用较高MOI来感染目的细胞。

4）高滴度：汉恒生物提供的腺病毒产品滴度较高，由于采用了汉恒特有的体系，用于细胞感染级别的腺病毒一般可以达到1010 PFU/ml滴度。

4.腺病毒细胞实验策略：由于腺病毒的非稳转性、低离体细胞毒性以及高滴度，应用腺病毒感染细胞的一般策略是：先扩增足量的目的细胞，然后用腺病毒载体感染目的细胞，待目的基因表达后直接进行后续的细胞功能性实验。

一般不会用腺病毒先感染细胞后再对细胞进行二次扩增放大化培养。

5.悬浮细胞专用腺病毒感染实验相关知识点：1）悬浮细胞准备：腺病毒建稳转细胞系前，请确保目的细胞状态良好、无支原体污染。

2）感染细胞最佳MOI的测定：MOI（感染复数）是指每个细胞感染的病毒数。

腺病毒对于不同种类不同来源的细胞，其最适MOI各有差别。

对于悬浮细胞，腺病毒MOI 一般以30、100、300、1000、2000的比例递增进行梯度摸索，相比于贴壁细胞，悬浮细胞的腺病毒MOI需求更高，MOI梯度摸索建议用96孔板进行以节省病毒和细胞。