基因的提取方法_基因工程的基本操作程序

基因文库:
将含有某种生物不同基因的许多DNA片 段,导入受体菌的群体中储存,各个受体菌分别 含有这种生物的不同的基因
基因组文库 基因文库 部分基因文库 如：cDNA文库
某种生物某个时期的 mRNA
反转录 cDNA
与运载体连接 导入
受体菌群体
cDNA文库
根据已知的氨基酸序列合成DNA法 ：
根据已知蛋白质 的氨基酸序列，推测 出相应的信使RNA序 列，然后按照碱基互 补配对原则，推测出 它的结构基因的核苷 酸序列，再通过化学 方法，以单核苷酸为 原料合成目的基因。
1.2 基因工程的基本操作程序
四 个 基 本 步 骤：
• 目的基因的提取方法
直接分离基因
人工合成基因
反转录法
根据已知的氨基酸序列 合成DNA
（补充知识）基因的结构 1、原核细胞的基因结构
非编码区
编码区
编码区上游
启动子
非编码区 编码区下游
终止子
与原R核NA聚编合码酶区结合能位转点录相应的信使RNA，能编码蛋白质
也从DNA模板链上脱落下来启。动子
2、真核细胞的基因结构
非编码区
编码区
编码区上游 启动子
与RNA聚合酶
结合位点
外显子
内含子
非编码区 编码区下游
终止子
外显子：能够编码蛋白质的序列 内含子：不能够编码蛋白质的序列
直接分离基因
某生物体内全部DNA
限制酶
许多DNA片段
与运载体连接 导入
受体菌群体
基因组文库
20 温度(℃)
40 50 60 70 80 90 100
(%)
① 概念：PCR全称为_聚__合__酶_链__式__反__应___，是一项 在生物_体__外_复制特__定__D_N__A_片__段_的核酸合成技术
②原理：__D_N_A_复__制___
③条件：_已__知__基_因__的__核__苷_酸__序__列______、 _四__种__脱_氧__核__苷__酸___、__引__物_______ 、 _D_N_A_聚__合__酶___.
体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Mullis 5’ 的构思 3’
5’ 3’ 3’
3’ 5’3’
5’ 5’
5’
引物
3’
5’
5’
3’
3’5’
3’5’ 3’ 特定DNA片段
DNA聚合酶？ 耐热
Taq DNA聚合酶（thermus aquaticus)
100
酶 80 活 性 60
40
蛋白质的氨基酸序列
推测
mRNA的核苷酸序列
推测
结构基因的核苷酸序列
化学合成
目的基因
• 哪些新技术能大大简化基因工程的操作技术？
1）DNA序列自动测序仪：
对提取出来的基因进 行核苷酸序列分析。
2）PCR技术：
使目的基因的片段 在短时间内成百万倍 地扩增。
利用PCR技术扩增目的基因
• 又称聚合酶链式反应(polymerase chain reaction) 通过模拟体内 DNA 复制的方式，在
段的技术。PCR过程一般经历下述三十多次循环：
95℃下使模板DNA变性、解链→55℃下复性（引物
与DNA模板链结合）→72℃下引物链延伸（形成新
的脱氧核苷酸链）。下列有关PCR过程的叙述中不
正确的是（ ）
C
• A．变性过程中破坏的是DNA分子内碱基对之间的
氢键，也可利用解旋酶实现
• B．复性过程中引物与DNA模板链的结合是依靠碱 基互补配对原则完成
Fra Baidu bibliotek
获取目的基因的方法有多种，下列
不属于目的基因获取方法的是（） C
A、从基因组文库中获取 B、从cDNA文库中获取 C、从含目的基因生物细胞中获取 D、利用PCR技术获取
但如果所需要的目的基因的序列完全不知，或只 知道目的基因序列的一段，或想从一种生物体内获得 许多基因，或者想知道这种生物与另一种生物之间有 多少基因不同，或者想知道一种生物在个体发育的不 同阶段表达的基因有什么不同，或者想得到一种生物 的全基因组序列，往往就需要构建基因文库。
如何从基因文库中得到所需要的基因？
④方式：以_指__数__方式扩增，即__2_n_（n为扩增 循环的次数）
⑤反应过程：
a.变性(90～95℃): DNA模板解链 b.退火(55～60℃): 引物与模板结合(使两种引物分别与模板
DNA链3′端的互补序列互补配对 )，形成局部 双链
c.延伸(70～75℃):
在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为原料，从引 物的5′端→3′端延伸，合成与模板互补的DNA链
依据：目的基因的有关信息
如：根据基因的核苷酸序列 基因的功能 基因在染色体上的位置 基因的转录产物mRNA 基因翻译产物蛋白质等特性
例：根据基因的部分核苷酸序列找到目的基因 第一步，通过PCR方法将目的基因已知的部分核苷酸 序列扩增出来，进行放射性同位素标记。 第二步，将基因文库中的所有菌落转移至硝酸纤维膜 上。然后，通过处理溶解消化掉细菌中的蛋白质，并 使DNA固定在膜上。 第三步，按DNA杂交的方法进行杂交。 第四步，在X光底片上出现黑斑的菌落，这表明这个 菌落中含有所需要的目的基因。 第五步，从该菌落中再提取目的基因。
PCR技术与体内DNA复制的区别：
1. PCR不需要解旋酶；体内DNA复制需要；
2. PCR需要耐热的DNA聚合酶（常用 TaqDNA聚合酶），而生物体内的聚合酶在 高温时会变性；
3. PCR一般要经历三十多次循环，而生物 体内DNA复制受生物体遗传物质的控制。
• 多聚酶链式反应(PCR)是一种体外迅速扩增DNA片
• C．延伸过程中需要DNA聚合酶、ATP、四种核糖 核苷酸
• D．PCR与细胞内DNA复制相比所需要酶的最适温 度较高
为什么要构建基因文库？直接从含有目的基因的 生物体内提取不行吗？
构建基因文库是获取目的基因的方法之一，并不是 唯一的方式。如果所需要的目的基因序列已知，就可 以通过PCR方式从含有该基因的生物的DNA中，直接获 得，也可以通过反转录，用PCR方式从mRNA中获得， 不一定要构建基因文库。
细①胞 RNA聚合酶能①够不识能别转调录控为序信列使中R的N结A合，位不点能，编并码与蛋
的基 因②结
构
其转结非录合编开。码始区后，②RN有白A调聚质控合遗酶传沿信DN息A表分达子的移核动苷，酸并序以列， DNA分子的一条在链该为序模列板中合，成最R重N要A的。是位于编码区
③ 转录完毕后，R上N游A链的释RN放A出聚来合，酶紧结接合着位R点N。A聚合酶