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2018/10/20
APP水解途径
非淀粉样途径：被α分泌酶（C83）和γ-分 泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的 产生，被β-分泌酶 （C99）和γ分泌酶依 次切割
β分泌酶水解670Met～671Asp之间的肽键，将APP一分为二，生成670个 氨基酸的APP片段和带完整Aβ的跨膜C段。
8
课题选取的5个APP突变
突变及检验
重叠延伸法PCR结果 A673T A673V E682K E693G E693Q 2.3kb
MarkerⅢDNA Ladder
双酶切结果 5.0kb 2.1kb
20
APP WT
A673T
A673V E682K
E693G
E693Q
pcDNA4
重组检验
双酶切验证结果 成功构建5个APP突变基因真核表达载体。野生APP基因约为2.3kb，pcDNA4为 5.1kb，选用内切酶为HindⅢ和XbaⅠ，下图为琼脂糖凝胶电泳结果（酶切后两片段 约为2.1kb和5.0kb）：
2.2.3 转染
2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
脂质体介导 瞬时转染
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染
A+B
C+D
2018/10/20
引物设计
两端引物
APP(F) APP(R) APPA673T(F) APPA673T(R) APPA673V(F) AAACAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTG CCCCGCTAGTCTAGAGTTCTGCATCTGCTCAA GAAGTGAAGATGGATACAGAATTCCGACATGAC GTCATGTCGGAATTCTGTATCCATCTTCACTTC
65-69
70-74
75-79
80-84
85-89
90-94
95-99
年龄 (年)
1906年报道1例51岁女性患者，进行性记忆 和语言能力丧失及识别能力障碍，病情逐渐 恶化、4年半后死亡，病解发现脑萎缩、老 年斑和神经原纤维改变。
4
病理特征：β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau 蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经元纤维缠结。
gaagtgaagatggatgtagaattccgacatgac
APPA673V(R)
APPE682K(F)
gtcatgtcggaattctacatccatcttcacttc
ccgacatgactcaggatacaaagttcatcatcaa ttgatgatgaactttgtatcctgagtcatgtcgg
丙氨酸→苏氨酸 丙氨酸→缬氨酸 谷氨酸→赖氨酸 谷氨酸→甘氨酸 谷氨酸→谷氨酰胺
2018/10/20
内容概要
研究背景
研究思路及核心技术
创新点 展望
2018/10/20
2.1 研究出发点
本课题选取5个APP突变，研究不同APP突变对 Aβ 形成过程的不同作用
表征： APP level C99 level Aβ level
APP C83 非淀粉样途径：被α-分泌酶（→C83）和γ-分泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的产生，被β-分泌酶（670Met～671Asp之间）（→C99） 和γ分泌酶依次切割
2018/10/20
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术
创新点
展望
2018/10/20
3.创新点
目前国内还没有对APP突变的系统研究
28
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术 创新点
展望
2018/10/20
4.展望 系统构建疾病相关突变库
2018/10/20
突变位点
673
氨基酸残基替换
A →T
A→V
突变命名
冰岛人突变
发现时间
2012年Nature
2009年Science 2011年
682
E→K
693
E →G
北极人突变
2001年Nature Neuroscience
1990年Science
E→Q
荷兰人突变
选取理由：2个早期发现突变E693G和E693Q，剩余3个为近些年发现 的突变。对比研究。
2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株
2.2.2 突变构
2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
Fomation of brain oligomeric Aβ or deposition of fibrillar Aβ accumulation
environment al factor
neurodegeneration
APP 淀粉样前体蛋白 Aβ 淀粉样多肽 β- secretase β分泌酶 γ- secretase γ分泌酶
2018/10/20
APP基因序列 重叠延伸法PCR引入突变位点 pcDNA4
2018/10/20
采用具有互补 末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增 反应中通过重叠链 的延伸,将不同来 源的扩增片段重叠 拼接起来的技术。 重叠延伸PCR在 基因的定点突变中 具有重要应用。
淀粉样前体蛋白(APP)的突变在 淀粉样多肽（Aβ）形成过程中作 用研究
王德美 2014.12.1 7
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术 创新点 展望
2018/10/20
内容概要
研究背景
研究思路及核心技术 创新点
2018/10/20
1.1 阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）
Pathogenesis：increased，altered production or reduced clearance of Aβ
6
APP水解途径
APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。
APP C83 非淀粉样途径：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的产生，被β-分泌酶（C99）（670Met～671Asp之间） 和γ分泌酶依次切割
app基因 碱基序列 突变位点
2217 2218 2244 2278 2277
碱基替 换
G→A C→T G→A A→G G→C
APP蛋白氨 基酸序列突 变位点
673 673 682 693 693
密码子改变
氨基酸替 换
A→T A→V E→K E→G E→Q
密码子名称
GCA→ACA GCA→GUA GAA→AAA GAA→GGA GAA→CAA
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构
2.2.4 检测 建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
检测APP、C99和Aβ Western Blot 、 ELlSA 、质谱
2018/10/20
APP水解途径
APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达ห้องสมุดไป่ตู้高。
突变点引物
APPE682K(R)
APPE693G(F)
APPE693G(R) APPE693Q(F) APPE693Q(R) 2018/10/20
ggtgttctttgcaggagatgtgggttcaaac
gtttgaacccacatctcctgcaaagaacacc ggtgttctttgcacaagatgtgggttcaaac gtttgaacccacatcttgtgcaaagaacacc
老年斑
神经元纤维缠结
5
1.2 淀粉样蛋白级联假说
•Amyloid cascade hypothesis
Amyoid precursor protein(APP)
β- secretase γ- secretase
hereditary factor
Aβ（observed in the brain of patients with ADAD and SAD）
自左向右：1为Maker；2、3为APPA673T；4、5为APPA673V;6、7为 APPE682K;8、9为APPE693G;10、11为APPE693Q。其中，2、3、4、 6、7、8、9、10、11为阳性结果。说明成功构建APP突变基因真核表达 系统。
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构
APP水解途径
非淀粉样途径：被α分泌酶（C83）和γ-分 泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的 产生，被β-分泌酶 （C99）和γ分泌酶依 次切割
β分泌酶水解670Met～671Asp之间的肽键，将APP一分为二，生成670个 氨基酸的APP片段和带完整Aβ的跨膜C段。
8
课题选取的5个APP突变
突变及检验
重叠延伸法PCR结果 A673T A673V E682K E693G E693Q 2.3kb
MarkerⅢDNA Ladder
双酶切结果 5.0kb 2.1kb
20
APP WT
A673T
A673V E682K
E693G
E693Q
pcDNA4
重组检验
双酶切验证结果 成功构建5个APP突变基因真核表达载体。野生APP基因约为2.3kb，pcDNA4为 5.1kb，选用内切酶为HindⅢ和XbaⅠ，下图为琼脂糖凝胶电泳结果（酶切后两片段 约为2.1kb和5.0kb）：
2.2.3 转染
2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
脂质体介导 瞬时转染
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染
A+B
C+D
2018/10/20
引物设计
两端引物
APP(F) APP(R) APPA673T(F) APPA673T(R) APPA673V(F) AAACAAGCTTGCCACCATGCTGCCCGGTTTG CCCCGCTAGTCTAGAGTTCTGCATCTGCTCAA GAAGTGAAGATGGATACAGAATTCCGACATGAC GTCATGTCGGAATTCTGTATCCATCTTCACTTC
65-69
70-74
75-79
80-84
85-89
90-94
95-99
年龄 (年)
1906年报道1例51岁女性患者，进行性记忆 和语言能力丧失及识别能力障碍，病情逐渐 恶化、4年半后死亡，病解发现脑萎缩、老 年斑和神经原纤维改变。
4
病理特征：β淀粉样蛋白沉积形成的细胞外老年斑和tau 蛋白过度磷酸化形成的神经细胞内神经元纤维缠结。
gaagtgaagatggatgtagaattccgacatgac
APPA673V(R)
APPE682K(F)
gtcatgtcggaattctacatccatcttcacttc
ccgacatgactcaggatacaaagttcatcatcaa ttgatgatgaactttgtatcctgagtcatgtcgg
丙氨酸→苏氨酸 丙氨酸→缬氨酸 谷氨酸→赖氨酸 谷氨酸→甘氨酸 谷氨酸→谷氨酰胺
2018/10/20
内容概要
研究背景
研究思路及核心技术
创新点 展望
2018/10/20
2.1 研究出发点
本课题选取5个APP突变，研究不同APP突变对 Aβ 形成过程的不同作用
表征： APP level C99 level Aβ level
APP C83 非淀粉样途径：被α-分泌酶（→C83）和γ-分泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的产生，被β-分泌酶（670Met～671Asp之间）（→C99） 和γ分泌酶依次切割
2018/10/20
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术
创新点
展望
2018/10/20
3.创新点
目前国内还没有对APP突变的系统研究
28
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术 创新点
展望
2018/10/20
4.展望 系统构建疾病相关突变库
2018/10/20
突变位点
673
氨基酸残基替换
A →T
A→V
突变命名
冰岛人突变
发现时间
2012年Nature
2009年Science 2011年
682
E→K
693
E →G
北极人突变
2001年Nature Neuroscience
1990年Science
E→Q
荷兰人突变
选取理由：2个早期发现突变E693G和E693Q，剩余3个为近些年发现 的突变。对比研究。
2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株
2.2.2 突变构
2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
Fomation of brain oligomeric Aβ or deposition of fibrillar Aβ accumulation
environment al factor
neurodegeneration
APP 淀粉样前体蛋白 Aβ 淀粉样多肽 β- secretase β分泌酶 γ- secretase γ分泌酶
2018/10/20
APP基因序列 重叠延伸法PCR引入突变位点 pcDNA4
2018/10/20
采用具有互补 末端的引物,使PCR 产物形成了重叠链, 从而在随后的扩增 反应中通过重叠链 的延伸,将不同来 源的扩增片段重叠 拼接起来的技术。 重叠延伸PCR在 基因的定点突变中 具有重要应用。
淀粉样前体蛋白(APP)的突变在 淀粉样多肽（Aβ）形成过程中作 用研究
王德美 2014.12.1 7
内容概要
研究背景 研究思路及核心技术 创新点 展望
2018/10/20
内容概要
研究背景
研究思路及核心技术 创新点
2018/10/20
1.1 阿尔茨海默症（Alzheimer's disease, AD）
Pathogenesis：increased，altered production or reduced clearance of Aβ
6
APP水解途径
APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达最高。
APP C83 非淀粉样途径：被α-分泌酶（C83）和γ-分泌酶连续切割
淀粉样途径 ：Aβ的产生，被β-分泌酶（C99）（670Met～671Asp之间） 和γ分泌酶依次切割
app基因 碱基序列 突变位点
2217 2218 2244 2278 2277
碱基替 换
G→A C→T G→A A→G G→C
APP蛋白氨 基酸序列突 变位点
673 673 682 693 693
密码子改变
氨基酸替 换
A→T A→V E→K E→G E→Q
密码子名称
GCA→ACA GCA→GUA GAA→AAA GAA→GGA GAA→CAA
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构 2.2.3 转染 2.2.4 检测
建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
2018/10/20
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构
2.2.4 检测 建APP突变基因 真核表达载体构建APP突变基因 真核表达载体
2018/10/20
检测APP、C99和Aβ Western Blot 、 ELlSA 、质谱
2018/10/20
APP水解途径
APP是一种跨膜蛋白质,在体内各种组织广泛存在,而在脑组织的表达ห้องสมุดไป่ตู้高。
突变点引物
APPE682K(R)
APPE693G(F)
APPE693G(R) APPE693Q(F) APPE693Q(R) 2018/10/20
ggtgttctttgcaggagatgtgggttcaaac
gtttgaacccacatctcctgcaaagaacacc ggtgttctttgcacaagatgtgggttcaaac gtttgaacccacatcttgtgcaaagaacacc
老年斑
神经元纤维缠结
5
1.2 淀粉样蛋白级联假说
•Amyloid cascade hypothesis
Amyoid precursor protein(APP)
β- secretase γ- secretase
hereditary factor
Aβ（observed in the brain of patients with ADAD and SAD）
自左向右：1为Maker；2、3为APPA673T；4、5为APPA673V;6、7为 APPE682K;8、9为APPE693G;10、11为APPE693Q。其中，2、3、4、 6、7、8、9、10、11为阳性结果。说明成功构建APP突变基因真核表达 系统。
2.2 设计思路及核心技术
2.2.1 构建BACE1 稳转 HEK293 细胞株 2.2.2 突变构