利用尼龙毛柱法分离野生型小鼠脾脏T细胞

利用尼龙毛柱法分离野生型小鼠脾脏T细胞：

1, 取脾脏，冰上剪碎研磨，PBS冲洗

2，吸取冲洗液,离心1000r5min，去上清重悬1ml 3，裂红：1乘裂红液（10：1）加入细胞悬液中，室温10分钟，离心去上清，重悬5ml

4，尼龙毛柱：取1.5g尼龙毛装入20ml注射器内，填料的体积控制在15毫升左右,加入含血清培养基37度孵育一小时，打开液体流出后夹闭，加细胞悬液,加培养基，37度一小时，打开弹簧夹控制流速在3-4 mL/min，收集20ml左右，pbs冲洗，重悬，加标记

原代T细胞分离

（1）单个核细胞分离

1）切取新鲜的人或小鼠肿瘤组织浸入磷酸盐缓冲液(phosphate-buffered saline, PBS)中，并记录肿瘤组织的体积。

2）随后，将组织剪碎并研磨通过100 µm孔径的细胞筛网(BD Biosciences)进入50 ml Falcon(BD)离心管。

3）同时，收集10ml HCC病人或健康志愿者的外周血，使用红细胞裂解缓冲液(BioLegend)将红细胞裂解清除。

4）在上述两组单细胞悬液中缓慢加入Ficoll-Paque淋巴细胞分离液(GE Healthcare)，置入20°C的离心机中，以400×g的转速离心30m in。离心结束自然减速，即加速度为零。

5）根据产品制造商提供的操作说明小心地吸取被淋巴细胞分离液分隔开的单个核细胞层。

脾脏T细胞分离只需过筛、裂红即可进入下一步骤。

（2）T细胞分离（尼龙毛柱法）

1）在无菌生物安全柜中关闭尼龙毛柱(Polysciences)下端滤过孔，垂直固定，加入大量PBS平衡柱子。

2）打开尼龙毛柱滤过开关，调节流速控制在3~4ml/min，下接50 ml Falcon(BD)离心管。

3）加入3~4倍柱体体积预热至37度的无血清培养基，随后加入相同体积预热的含血清1640培养基，最后等培养基液面填满尼龙毛时，关闭滤过开关。

4）将单个核细胞悬液浓度调整为5×108/ml，上样量控制在1/3-1/5柱体积。样品加入之后，再加入少量培养基，然后关闭滤过开关。

5）关闭尼龙毛柱上端，移置于细胞培养箱中，37度孵育1小时。此过程中柱子必须要保持垂直状态。

6）取回并打开柱子上端，加入15 ml经37度预热的培养基，打开滤过开关控制流速在3~4ml/min，待流出培养液基不透明，收集后面部分含T细胞培养基。

7）通过CD3抗体标记染色，检测所得T细胞纯度（方法见流式细胞试验部分）。