核酸的分离提取44页PPT
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核酸的分离纯化PPT课件
三、核酸的鉴定与保存
2、纯度鉴定 ⑴ 紫 外 分 光 光 度 法 ： 该 法 主 要 通 过 A260 与 A280
的比值来判定有无蛋白质的污染，比值升 高与
降低均提示不纯。 在TE缓冲液中，纯DNA的A260/A280
纯RN第A25的页/共A12562页0/A280比值为
三、核酸的鉴定与保存
1. DNA或RNA的定量 OD260相当于 50μg/ml双链DNA 40μg/ml单链DNA（或RNA） 20μg/ml寡核苷酸
三、核酸的鉴定与保存
• 完整或降解很少的总RNA电泳图谱中，三条带 荧光强度积分应呈特定的比值，沉降系数大的 核酸区带，电泳迁移低，荧光强度积分高；反 之，分子量小，电泳迁移率高，荧光强度积分 低。
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三、核酸的鉴定与保存
• 一般而言，28S（23S）RNA的荧光强度约为 18S（16S）RNA的2倍，否则提示有RNA的降 解。若 在点样孔附近有着色条带，则说明存在DNA 的污染。
75%的乙醇洗涤去除
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三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 （二）核酸的保存
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三、核酸的鉴定与保存
（一）核酸的鉴定 1、浓度鉴定 2、纯度鉴定 3、完整性鉴定
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三、核酸的鉴定与保存
1、浓度鉴定 ⑴ 紫外分光光度法：该法是基于核酸分子 中的碱基具有共轭双键结构因而可以吸 收 紫外线，其最大吸收波长为260nm。
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第五章 核酸的分离纯化
核酸分离纯化的原则 一、 保持核酸一级结构的完整性 二 、尽可能提高核酸制品的纯度
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提取DNA总的原则
核酸的提取PPT课件
SDS
异硫氰酸胍
Rnase
mRNA
rRNA tRNA
Proteinase K 酚/氯仿
DNA
Dnase Mg2+
protein
.
1）防止和抑制内源 Dnase对DNA的降解； 只需加入一定浓度的 螯合剂如EDTA，因 为几乎所有Dnase 都 需要Mg2+或Mn2+为 辅助因子。
2）尽量减少对溶液 中DNA的机械剪切 破坏。在操作过程 中尽量减弱溶液的 涡旋，动作要轻柔， 进行DNA溶液转移 时用大口吸管。
CTAB（hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基溴化铵），是一种 阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸 形成复合物。
该复合物在高盐溶液（ Nacl ＞0.7mol/L ）是 可溶的，通过有机溶剂抽提，去除蛋白， 多糖，酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使 核酸分离出来。
32
SDS法DNA提取缓冲液
.
33
（2）SDS法流程图（以动物组织为例）
.
34
三、基因组DNA-其他方法
• 根据细胞裂解方式的不同有： • 物理方式：玻璃珠法、超声波法、研磨法、
冻融法。 • 化学方式：异硫氰酸胍法、碱裂解法。 • 生物方式：酶法。
.
35
根据核酸分离纯化方式的不同有：
• 吸附材料结合法： • 硅质材料 高盐低PH值结合膜，低盐高PH
•
对于DNA，抑制DNase活力很容易，但
防止机械张力拉断则更重要。
•
对于RNA，因分子较小，不易被机械张
力拉断，但抑制RNase活力较难，故在RNA提取
中设法抑制RNase更重要。
.
《核酸分离检测》PPT课件
∆∆CT -0.65 -1.39 -1.36 -2.45 -3.44 -3.25
0
小鼠肺发育不同阶段P311 mRNA的表达
P311 表达相对倍数
12
10
86Leabharlann 420E14.5 E16.5 E18.5 P5
P11
P14
P30
Bio-Rad iQ5TM荧光定量PCR仪
ABI Prism 7500型荧光定量PCR仪
具用0.1%二乙基焦碳酸盐〔diethyl pyrocarbonate, DEPC〕处理. 加强的蛋白变性剂如硫氰酸胍、异硫氰酸胍等. 加核糖核酸酶阻抑蛋白〔RNasin〕等RNase的抑 制剂.
质粒DNA的提取——碱裂解法
• 溶液I：50 mM葡萄糖, 25 ,10 mM EDTA,pH 8.0— — Tris-Cl→ pH；葡萄糖→大肠杆菌悬浮；EDTA →金属离子螯合剂.
常用于测序〕
核酸样品的保存
DNA： DNA样品溶于pH8.0的TE,4 ℃或-20 ℃保存； 长期保存样品中可加入1滴氯仿. RNA： RNA样品溶于0.3 mol/L NaAc <pH5.2>或双蒸灭菌
水中,-70 ℃保存; 长期保存可以沉淀形式贮于乙醇中; 在RNA溶液中,加1滴0.2 mol/L VRC<氧钒核糖核苷
➢ 化学作用：一定p H 和变性条件下,细胞破裂,蛋白变性 沉淀,核酸→水相.变性条件：加热、表面活性剂<SDS、 Triton X-100 、Tween 20 、NP-40 等> 、强离子剂<异 硫氰酸胍、盐酸胍等> .p H 环境：强碱<NaOH> 或缓 冲液 < TE、STE 等>. 金属离子螯合剂< EDTA 等> 螯 合Mg2+ 、Ca2+,抑制核酸酶活性.
《核酸的分离纯化》PPT课件
2.3.3 核酸沉淀的温度和时间
一般强调，核酸沉淀在低温长时间下进行。 低温长时间沉淀，易导致盐与DNA共沉淀， 影响以后的实验。一般使用0℃冰水，1015min， DNA样品足可达到实验要求。
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2.4 核酸的浓度测定
2.4.1 紫外分光光度法测DNA和RNA的含量
前提：核酸样品要较纯，无显著蛋白质、酚、 琼脂糖及其他核酸污染。测定浓度应大于0.25 μg/ml 。 结论：在波长260nm紫外光下，1 OD值的吸光度 相当于双链DNA浓度为50μg/ml；单链DNA为37 μg/ml；RNA为40 ug/ml。
沉淀是浓缩核酸最常用的方法。 优点：
①改变核酸的溶解缓冲液； ②重新调整核酸的浓度； ③去除溶液中某些盐离子与杂质。
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2.3.1 核酸沉淀的盐类及浓度
当核酸溶液的pH值大于4时，核酸分子呈多聚阴离子 状态，它与1价或2价阳离子形成的盐在许多有机溶剂中 不溶解，也不会被有机溶课剂变性。
盐
MgCl2 NaAc KAc NH4Ac NaCl LiCl
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1.2.2 RNA酶（RNAase)抑制 剂
RNAase分布广泛，极易污染样品，而且 耐高温、耐酸、耐碱，不宜失活。
(1) 皂土（bentonite ）
作用机制：皂土带负电荷，能吸附RNase， 使其失活。
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(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H； 2）控制pH值范围(pH值5-9); 3）保持一定离子强度; 4）减少物理因素对核酸的机械剪切力.
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1.2 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核酸链 中的磷酸二酯键，破坏核酸一级结构。
核酸的分离纯化优秀课件
前言
核酸（nucleic acid）是遗传信息的携带者， 是基因表达的物质基础。
无论是进行核酸结构还是功能研究，首先 需要对核酸进行分离和纯化。
核酸样品质量将直接关系到实验的成败。
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核酸的分离纯化优秀课件
一、核酸分离、纯化原则
（一）保持核酸分子一级结构的完整性
1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中，核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其 他生物大分子结合的方式。
核酸的分离纯化优秀课件
General process of gene engineering
1. 从生物有机体基因组中， 分离出带有目的基因的DNA片 段。
2. 将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号 的载体分子上，形成重组DNA分子。
3. 将重组DNA分子转移到适当的受体 细胞（亦称寄主细胞）并与之一起增 殖。 4. 从大量的细胞繁殖群体中，筛选出 获得了重组DNA分子的受体细胞，并筛 核酸的分离纯选化出优秀已课件经得到扩增的目的基因。
1952年Hershey和Chase证实噬菌体DNA 侵染细菌实验
核酸的分离纯化优秀课件
2. 50年代揭示了DNA分子的双螺旋结构模型和半 保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交 替问题；
Rosalind Franklin拍出 了第一张 能反映DNA美丽双螺旋结构的X
射线照片
X-ray source
（3) 肝素 （4）复合硅酸盐（Macaloid) （5）RNase阻抑蛋白（RNasin） （6）氧钒核糖核苷复合物 (Vanadyl-
Ribonucleoside Complex, VRC)
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核酸的分离纯化优秀课件
核酸提取原理及方法课件
选择提取方法
根据提取方法选择合适的试剂和材料，如缓冲液、裂解液、硅胶膜、磁珠等。
确定试剂和材料
根据所选的提取方法和试剂材料，设计具体的操作流程，包括样本处理、裂解、吸附、洗脱等步骤。
设计操作流程
实验过程中需注意生物安全问题，如使用含有病毒或细菌的样本时，应采取相应的防护措施。
生物安全
实验室安全
操作安全
对记录的数据进行处理，如计算核酸浓度和纯度等。
根据实验目的对数据进行进一步分析，如基因组学和表达谱分析等。
将分析结果以图表或表格的形式展示出来，以便更好地呈现数据变化和规律。
THANKS
感谢您的观看。
03
CHAPTER
核酸纯化方法
步骤
将DNA样品与凝胶介质混合，置于电泳槽中，施加电场。DNA分子在电场作用下通过凝胶介质，迁移至不同位置，根据其大小分离。
原理
凝胶电泳利用DNA分子在电场中的迁移率差异进行分离。不同大小的DNA分子通过凝胶介质时受到的阻力不同，迁移率随之改变，从而实现分离。
应用
凝胶电泳纯化适用于小量DNA分子的分离和纯化，如PCR产物、克隆DNA等。
在临床诊断中，核酸提取也是检测病毒、细菌等病原体感染的重要步骤。
02
CHAPTER
核酸提取方法
酚/氯仿提取法是一种常用的核酸提取方法，利用酚和氯仿对DNA和蛋白质的溶解度不同，将DNA从蛋白质和其他杂质中分离出来。
原理
将细胞裂解液加入酚/氯仿混合液，剧烈振荡后离心，水相和有机相即刻分离，水相中包含DNA。
应用
离子交换色谱纯化适用于大量DNA分子的分离和纯化，如基因组DNA、质粒DNA等。
04
CHAPTER
核酸定量方法
根据提取方法选择合适的试剂和材料，如缓冲液、裂解液、硅胶膜、磁珠等。
确定试剂和材料
根据所选的提取方法和试剂材料，设计具体的操作流程，包括样本处理、裂解、吸附、洗脱等步骤。
设计操作流程
实验过程中需注意生物安全问题，如使用含有病毒或细菌的样本时，应采取相应的防护措施。
生物安全
实验室安全
操作安全
对记录的数据进行处理，如计算核酸浓度和纯度等。
根据实验目的对数据进行进一步分析，如基因组学和表达谱分析等。
将分析结果以图表或表格的形式展示出来，以便更好地呈现数据变化和规律。
THANKS
感谢您的观看。
03
CHAPTER
核酸纯化方法
步骤
将DNA样品与凝胶介质混合，置于电泳槽中，施加电场。DNA分子在电场作用下通过凝胶介质，迁移至不同位置，根据其大小分离。
原理
凝胶电泳利用DNA分子在电场中的迁移率差异进行分离。不同大小的DNA分子通过凝胶介质时受到的阻力不同，迁移率随之改变，从而实现分离。
应用
凝胶电泳纯化适用于小量DNA分子的分离和纯化，如PCR产物、克隆DNA等。
在临床诊断中，核酸提取也是检测病毒、细菌等病原体感染的重要步骤。
02
CHAPTER
核酸提取方法
酚/氯仿提取法是一种常用的核酸提取方法，利用酚和氯仿对DNA和蛋白质的溶解度不同，将DNA从蛋白质和其他杂质中分离出来。
原理
将细胞裂解液加入酚/氯仿混合液，剧烈振荡后离心，水相和有机相即刻分离，水相中包含DNA。
应用
离子交换色谱纯化适用于大量DNA分子的分离和纯化，如基因组DNA、质粒DNA等。
04
CHAPTER
核酸定量方法
核酸的分离与纯化ppt课件
核酸提取方法——分离与纯化
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
——盐析法
产量较低，但方法简单，比较酚氯仿方法无化学危害；
同样不适合大规模自动化提取。
提取好的DNA用蛋白酶处理纯度会提高。
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核酸提取方法——分离与纯化
每一步骤又可由多种不同的方法单独或 联合实现。
为深入学习习近平新时代中国特色社 会主义 思想和 党的十 九大精 神,贯彻 全国教 育大会 精神,充 分发挥 中小学 图书室 育人功 能
核酸提取方法——细胞裂解
细胞裂解可通过以下几种方法实现：
物理作用 化学作用 酶作用 （生物作用）
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碱性pH环境：强碱(NaOH) 或碱性缓冲液 ( TE、
STE 等)
在一定的p H 环境下,表面活性剂或强离子剂可使细胞裂解、蛋 白质和多糖沉淀,核酸释放到水相；某些缓冲液中的一些金属离 子螯合剂( EDTA 等) 可螯合对核酸酶活性所必须的金属离子 Mg2+ 、Ca2+ ,从而抑制核酸酶的活性,保护核酸不被降解。
核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
产量较低，纯度很好； 也能造成大片段核酸的损伤； 对极小片段核酸提取不够好； 简单方便，可进行自动化处理。
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核酸提取方法——分离与纯化
——硅胶吸附法
1、细胞裂解和酶处理同前述；
核酸分离提取技术46页PPT
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❖ 知识就是财富 ❖ 丰富你的人生
71、既然我已经踏上这条道路，那么，任何东西都不应妨碍我沿着这条路走下去。——康德 72、家庭成为快乐的种子在外也不致成为障碍物但在旅行之际却是夜间的伴侣。——西塞罗 73、坚持意志伟大的事业需要始终不渝的精神。——伏尔泰 74、路漫漫其修道远，吾将上下而求索。——屈原 75、内外相应，言行相称。——韩非
核酸分离提取技术
16ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ自己选择的路、跪着也要把它走 完。 17、一般情况下)不想三年以后的事， 只想现 在的事 。现在 有成就 ，以后 才能更 辉煌。
18、敢于向黑暗宣战的人，心里必须 充满光 明。 19、学习的关键--重复。
20、懦弱的人只会裹足不前，莽撞的 人只能 引为烧 身，只 有真正 勇敢的 人才能 所向披 靡。
核酸提取和鉴定PPT讲稿
纯化：使核酸与其它杂质彻底分离，如 蛋白质、盐等
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染。
鉴定：浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）
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（一）样品预处理（获取分散细胞） 1、植物样品
新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗；
14）加入50μl DEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的
多少加DEPC处理水）
15）-80℃冰箱保存。
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组织匀浆
当前你正在浏览到的事第三十五页PPTT，共五十三页。
（二）mRNA的提取
从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条件
化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复 合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机
溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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（二）提取用具预处理
1、DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶 处理。
2、RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。
RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温
，提取条件要求严格。
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（3）培养细胞： 离心，弃细胞培养液；
总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；
②排除其它分子的污染。
鉴定：浓度、纯度、分子量、测序 （技术：分光光度技术、凝胶电泳技术等）
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（一）样品预处理（获取分散细胞） 1、植物样品
新鲜组织先用无菌生理盐水洗； 干药材除去霉点，无菌水浸洗；
14）加入50μl DEPC处理水溶解（可以根据管底的白色沉淀判断RNA量的
多少加DEPC处理水）
15）-80℃冰箱保存。
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组织匀浆
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（二）mRNA的提取
从总RNA中分离mRNA， 用Oligo（dT）层析柱。 mRNA含polyA，在高盐浓度条件
化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复 合物。
➢ 该复合物在高盐溶液中（>0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机
溶剂抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸 分离出来。
注：CTAB溶液在低于15℃ 时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。
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（二）提取用具预处理
1、DNA提取用具的处理
要求无菌；试剂、器材高压干燥等进行无DNA酶 处理。
2、RNA提取用具的处理
要求无菌，防止二次污染。
RNA易被RNase水解，RNase无处不在且耐高温
，提取条件要求严格。
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（3）培养细胞： 离心，弃细胞培养液；
实验一核酸的提取ppt课件
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
如何创造一个无RNase的环境 ？
RNA分离的关键因素是： ➢ 尽量减少RNA酶的污染！ ➢极力避免外源RNase的污染：主要来源于
开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状 结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA， 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
而RNA酶，不但分布广泛、极易污染样品， 而且耐高温、耐酸、耐碱，不易失活，所以生 物降解是RNA提取过程中的主要危害因素。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
二、真核细胞染色体DNA的制备
1. 真核细胞的破碎 （1）物理方式:超声波法、匀浆法、液氮
破碎法、Al2O3粉研磨法等。这些物理操作均可 导致DNA链的断裂。
（2）为了获得大分子量的DNA，一般采用 蛋白酶K和去污剂温和处理法。
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
采用PP管及配件：根据给水设计图配 置好PP管及配 件，用 管件在 管材垂 直角切 断管材 ，边剪 边旋转 ，以保 证切口 面的圆 度，保 持熔接 部位干 净无污 物
核酸的分离提取共46页文档
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核酸的分离提取
46、法律有权打破平静。——马·格林 47、在一千磅法律里，没有一盎司仁 爱。— —英国
48、法律一多，公正就少。——托·富 勒 49、犯罪总是以惩罚相补偿；只ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ处 罚才能 使犯罪 得到偿 还。— —达雷 尔
50、弱者比强者更能得到法律的保护 。—— 威·厄尔
61、奢侈是舒适的，否则就不是奢侈 。——CocoCha nel 62、少而好学，如日出之阳；壮而好学 ，如日 中之光 ；志而 好学， 如炳烛 之光。 ——刘 向 63、三军可夺帅也，匹夫不可夺志也。 ——孔 丘 64、人生就是学校。在那里，与其说好 的教师 是幸福 ，不如 说好的 教师是 不幸。 ——海 贝尔 65、接受挑战，就可以享受胜利的喜悦 。——杰纳勒 尔·乔治·S·巴顿