第8章 酶分子的化学修饰
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1. 酶与修饰剂的分子比例 2. 反应体系的溶剂性质、盐浓度、pH条件
3. 反应温度及时间
四、 修饰反应的一般程序
注意事项
修饰后需进行总的氨基酸分析 各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基
进行确定 注意缓冲液成分或修饰副产物对修饰部位和
修饰程度及对酶活性的影响 修饰后酶性质的改变
• 应用实例：
1）酶原激活 a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
2）提高酶活力：
天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰。从羧基端切除10个 氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5 倍左右。
3）消除抗原性：（抗原性还与分子大小有关）
木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其 肽链的2/3，该酶的活力基本保持。其抗原性却大大 降低。
8.4 分子侧链基团修饰
侧链基团修饰
采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的 侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和 功能的修饰方法
酶侧链基团
• 酶的化学修饰（chemical modification）
通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共 价结构发生改变。
• 广义：凡涉及共价或部分共价键的形成或 破坏，从而改变酶学性质均可看作是酶分 子的化学修饰。
• 酶选择性化学修饰：在较温和的条件下， 以可以控制的方式使一种蛋白质同某些化 学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸 残基或其功能基发生共价的化学改变。
核酸类酶
侧链基团：磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶 碱基上的氨基和羟基(酮基)等
8.4 分子侧链基团修饰
一、 化学修饰剂 二、 几种重要的修饰反应 三、 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
化学修饰剂
五、改变酶学性质
绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度并没有发生改 变。 但是有些酶在修饰后，米氏常数Km会增大。
空间障碍影响酶与底物的结合。 抵挡各种失活因子能力增强和体内半衰期的延长。
8.2 酶分子化学修饰的方法学
方法很多，充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特征，或
直接或间接与酶分子上的某种氨基酸残基进行化学反应。 一、充分认识酶分子的特性
的活性部位。
酶抑制剂是通过作用于酶活性部位来降低酶催化能力的。 酶共价交联上大分子修饰剂后，大分子修饰剂产生的空间 障碍阻挡抑制剂，“遮盖”酶活性部位，增强了酶抗抑制 剂能力。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶 接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破 坏。
2. 酶分子上许多敏感基团交ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ上修饰剂后，减 少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化， 维持酶活性部位微环境相对稳定。
1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件
（热稳定性、pH稳定性、最适pH、温度）
3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、 修饰剂的选择
1）首先要与氨基酸反应残基发生化学反 应，形成紧密的共价链接。
2）与某一特定的氨基酸残基侧链基团特 异反应。
三、反应条件的选择
允许修饰能顺利进行；不造成蛋白质的不可逆变性；有利于 专一性修饰蛋白。
• 酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋 白酶或肽酶为修饰剂）。
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种：
• 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 • 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 • 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部
位，酶活力提高。
利用肽链的水解，可以使酶的空间结构发生某 些精细的变化，从而改变酶的特性和功能的方法， 称为肽链的有限水解修饰。
3）消除抗原性。 4）产生新的催化能力。
8.1 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个活性反应基团，
可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产 生“刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间
障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶
酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。
酶的活性中心的存在就是通过酶化学修饰来证实的
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。 1）提高酶的生物活性（酶活力）
1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合后酶活力提高30%
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）
治疗血栓有显著疗效的尿激酶在体内的半衰期只有2～20min,用PEG、右旋糖 酐修饰后，血液中的半衰期从6min提高到35h。
第8章 酶分子的化学修饰
酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)反应条件严苛； 3)具有抗原性。
2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子化学修饰的方法来改变已分 离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。有氨 基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、 羟基、胍基、甲硫基等
作用
研究各基团的作用及其对酶的结构、特性和 功能的影响 (研究酶活性中心的必需基团)
改变酶分子性质，提高实用价值 测定某一基团在酶分子中的数量 获得新酶种
类别
蛋白类酶
五、 测定修饰程度和修饰部位
修饰反应的评价因素
1、 有多少修饰剂已结合到酶分子上
2、 哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少 3、 有多少种不同形式的修饰剂－酶分子耦合物，
每种各有多少
8.3 肽链有限水解修饰
肽链有限水解修饰
• 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结 构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性 和功能的方法。
3. 反应温度及时间
四、 修饰反应的一般程序
注意事项
修饰后需进行总的氨基酸分析 各种酶分子，修饰后均需对每个氨基酸残基
进行确定 注意缓冲液成分或修饰副产物对修饰部位和
修饰程度及对酶活性的影响 修饰后酶性质的改变
• 应用实例：
1）酶原激活 a、胃蛋白酶原的激活
胃蛋白酶原
HCl pH1.5～2
胃蛋白酶（从N端失去44个氨基酸残基）
自身激活
b、胰蛋白酶原（trypsinogen）的激活
c、胰凝乳蛋白酶原（chymotrypsinogen）的激活
2）提高酶活力：
天冬氨酸酶通过胰蛋白酶修饰。从羧基端切除10个 氨基酸残基的肽段，可以使天冬氨酸酶的活力提高5 倍左右。
3）消除抗原性：（抗原性还与分子大小有关）
木瓜蛋白酶用亮氨酸氨肽酶进行有限水解，除去其 肽链的2/3，该酶的活力基本保持。其抗原性却大大 降低。
8.4 分子侧链基团修饰
侧链基团修饰
采用一定的方法(一般为化学法)使酶分子的 侧链基团发生改变，从而改变酶分子的特性和 功能的修饰方法
酶侧链基团
• 酶的化学修饰（chemical modification）
通过化学基团的引入或除去，使蛋白质共 价结构发生改变。
• 广义：凡涉及共价或部分共价键的形成或 破坏，从而改变酶学性质均可看作是酶分 子的化学修饰。
• 酶选择性化学修饰：在较温和的条件下， 以可以控制的方式使一种蛋白质同某些化 学试剂起特异反应，从而引起单个氨基酸 残基或其功能基发生共价的化学改变。
核酸类酶
侧链基团：磷酸基，核糖上的羟基，嘌呤、嘧啶 碱基上的氨基和羟基(酮基)等
8.4 分子侧链基团修饰
一、 化学修饰剂 二、 几种重要的修饰反应 三、 特定氨基酸残基侧链基团的化学修饰
化学修饰剂
五、改变酶学性质
绝大多数酶经过修饰后，最大反应速度并没有发生改 变。 但是有些酶在修饰后，米氏常数Km会增大。
空间障碍影响酶与底物的结合。 抵挡各种失活因子能力增强和体内半衰期的延长。
8.2 酶分子化学修饰的方法学
方法很多，充分利用修饰剂所具有的各类化学基团的特征，或
直接或间接与酶分子上的某种氨基酸残基进行化学反应。 一、充分认识酶分子的特性
的活性部位。
酶抑制剂是通过作用于酶活性部位来降低酶催化能力的。 酶共价交联上大分子修饰剂后，大分子修饰剂产生的空间 障碍阻挡抑制剂，“遮盖”酶活性部位，增强了酶抗抑制 剂能力。
三、如何维持酶功能结构的完整性与抗蛋白水解 酶
酶化学修饰后通过两种途径抗蛋白水解酶：
1. 大分子修饰剂产生空间障碍阻挡蛋白水解酶 接近酶分子。“遮盖”酶分子上敏感键免遭破 坏。
2. 酶分子上许多敏感基团交ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ上修饰剂后，减 少了受蛋白水解酶破坏的可能性。
四、如何消除酶的抗原性及稳定酶的微环境
1. 酶蛋白氨基酸组成的抗原决定簇，与修饰剂形成 了共价键。
破坏了抗原决定簇——抗原性降低乃至消除 “遮盖”了抗原决定簇——阻碍抗原、抗体结合 2. 大分子修饰剂本身是多聚电荷体，能在酶分子表 面形成“缓冲外壳”，抵御外界环境的极性变化， 维持酶活性部位微环境相对稳定。
1. 活性部位情况 2. 稳定条件及反应最佳条件
（热稳定性、pH稳定性、最适pH、温度）
3. 侧链基团的化学性质及反应活泼性
二、 修饰剂的选择
1）首先要与氨基酸反应残基发生化学反 应，形成紧密的共价链接。
2）与某一特定的氨基酸残基侧链基团特 异反应。
三、反应条件的选择
允许修饰能顺利进行；不造成蛋白质的不可逆变性；有利于 专一性修饰蛋白。
• 酶蛋白主链修饰通常采用酶法（用专一性较强的蛋 白酶或肽酶为修饰剂）。
酶蛋白的肽链被水解后，可能出现以下三种情况中 的一种：
• 引起酶活性中心的破坏，酶失去催化功能。 • 仍维持活性中心的完整构象，保持酶活力。 • 有利于活性中心与底物结合并形成准确的催化部
位，酶活力提高。
利用肽链的水解，可以使酶的空间结构发生某 些精细的变化，从而改变酶的特性和功能的方法， 称为肽链的有限水解修饰。
3）消除抗原性。 4）产生新的催化能力。
8.1 酶化学修饰的原理
一、如何增强酶天然构象的稳定性与耐热性 修饰剂分子存在多个活性反应基团，
可与酶形成多点交联。使酶的天然构象产 生“刚性”结构。
二、如何保护酶活性部位与抗抑制剂 大分子修饰剂与酶结合后，产生的空间
障碍或静电斥力阻挡抑制剂，“遮盖”了酶
酶化学修饰的目的
1. 研究酶的结构与功能的关系。
酶的活性中心的存在就是通过酶化学修饰来证实的
2. 人为改变天然酶的某些性质，扩大酶的应用范围。 1）提高酶的生物活性（酶活力）
1分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合后酶活力提高30%
2）增强酶的稳定性（热稳定性、体内半衰期）
治疗血栓有显著疗效的尿激酶在体内的半衰期只有2～20min,用PEG、右旋糖 酐修饰后，血液中的半衰期从6min提高到35h。
第8章 酶分子的化学修饰
酶化学修饰及修饰目的
一、酶化学修饰 1.限制酶大规模应用的原因： 1)细胞外稳定性差； 2)反应条件严苛； 3)具有抗原性。
2. 改变酶特性有两种主要的方法：
1)通过分子化学修饰的方法来改变已分 离出来的天然酶的活性。
2)通过基因工程方法改变编码酶分子的 基因而达到改造酶的目的。
组成蛋白质的氨基酸残基上的功能团。有氨 基、羧基、巯基、咪唑基、吲哚基、酚羟基、 羟基、胍基、甲硫基等
作用
研究各基团的作用及其对酶的结构、特性和 功能的影响 (研究酶活性中心的必需基团)
改变酶分子性质，提高实用价值 测定某一基团在酶分子中的数量 获得新酶种
类别
蛋白类酶
五、 测定修饰程度和修饰部位
修饰反应的评价因素
1、 有多少修饰剂已结合到酶分子上
2、 哪些氨基酸被修饰，修饰度是多少 3、 有多少种不同形式的修饰剂－酶分子耦合物，
每种各有多少
8.3 肽链有限水解修饰
肽链有限水解修饰
• 利用酶分子主链的切断和连接，使酶分子的化学结 构及其空间结构发生某些改变，从而改变酶的特性 和功能的方法。