慢病毒转染增强剂说明书
Lenti-Pac
Lenti-Pac™ HIV Expression Packaging Kit1. 培养包装细胞在进行转染前，提前两天将1.3-1.5×106的293T a细胞(或其它具有同等活力的包装细胞)移入10厘米细胞板进行培养，板内加入10 m l含10%热灭活胎牛血清的DMEM培养基，使细胞在进行转染时达到70-80%融合率。
置5% CO2，37℃培养细胞。
NOTE：进行转染的两天前铺板培养包装细胞，可明显提高慢病毒滴度。
需使用热灭活的胎牛血清，56℃振荡培养冻融血清30min。
2. 准备DNA/EndoFectin慢病毒混合物往无菌EP管加入慢病毒 ORF/shRNA表达质粒和5.0 μl LentiPac HIV混合试剂，以Opti-MEM I稀释至200 μl（A液）。
在另一无菌EP管内，以Opti-MEM I稀释15 μlEndoFectin转染试剂（B液）。
边轻柔进行涡旋，边往A液中滴加B液。
不可颠倒添加顺序。
如体系较大，可使用圆底离心管。
室温培养该溶液10-25分钟，使DNA-EndoFectin混合物产生。
NOTE：即使该混合物在含有蛋白（如10%血清）的环境下可转染细胞，但混合物必须在无蛋白的环境下产生。
Opti-MEM I可用于同时溶解DNA和EndoFectin慢病毒试剂。
不添加血清的DMEM可代替Opti-MEM I在此步骤使用，但其转染效率较Opti-MEM I低。
每1μg质粒添加3.0 μl EndoFectin慢病毒试剂为最佳比例。
继续提高试剂浓度，将不再提高转染效率。
3. 转染包装细胞将DNA-EndoFectin复合物加入细胞板，轻柔涡旋平板使复合物分散。
细胞在5%CO2，37℃条件下过夜培养（8-14小时），以加入2-5%热灭活胎牛血清、青霉素和链霉素的新鲜DMEM培养基更换旧培养基，培养基中加入1/500体积的TiterBoost试剂并继续在5%CO2，37℃条件下继续培养。
takara T100B说明书
takaraT100B说明书
使用造血细胞和其他悬浮细胞的研究在一定程度上受到将基因转移（转导和转染）到这些细胞类型的效率低下的限制。
RetroNectin试剂促进慢病毒或逆转录病毒与靶细胞的共定位，从而显着提高转导效率。
因此，RetroNectin试剂现在是逆转录病毒/慢病毒基因转移到造血细胞的金标准转导增强剂，在临床应用中具有广阔的前景，已用于40多项临床试验。
RetroNectin是重组人纤维连接片断，包括细胞结合域，肝磷脂结合域和CS1位点三个功能区域。
它由574个氨基酸组成，分子量63kDa。
RetroNectin能够大幅地提高逆转录病毒感染哺乳动物细胞的感染效率，其作用原理是：细胞表面VLA-4及VLA-5可分别与RetroNectin上的CS-1位点及细胞结合域结合，逆转录病毒载体可以与肝磷脂结合域结合。
在经RetroNectin包被的培养容器表面，细胞与病毒载体以高浓度共存，从而提高基因转染效率。
慢病毒使用手册
慢病毒使用手册慢病毒（Lentivirus）是一类非常常见的病毒，它属于逆转录病毒家族。
与其他病毒相比，慢病毒具有一些特殊的特征，使其在生物研究领域和基因治疗等应用中变得非常重要。
本文将介绍慢病毒的基本特征、制备和使用方法，以及慢病毒在基因转染、基因表达和基因治疗中的应用。
一、慢病毒的基本特征慢病毒是一类具有外包膜的病毒，其基因组由一条单链正义RNA组成。
慢病毒具有较大的基因载量能力，可携带长达9kb的外源DNA序列。
另外，慢病毒具有高度的细胞性选择性，能够感染多种哺乳动物细胞，并将外源基因稳定地集成到细胞基因组中。
二、慢病毒的制备方法慢病毒的制备包括构建慢病毒载体和包装慢病毒。
构建慢病毒载体通常采用三元质粒系统，其中包括基因载体、包装载体和包衣载体。
基因载体负责携带外源基因序列，而包装载体负责表达与慢病毒复制有关的基因，如gag、pol和env等。
包衣载体则负责表达包衣蛋白，使慢病毒能够正常装配和释放。
包装慢病毒的方法通常采用转染细胞的方式。
将构建好的慢病毒载体与包装载体和包衣载体一同转染到特定的细胞中，通过包装载体表达的基因来启动慢病毒的复制和包装过程。
经过适当的培养和处理后，可以获得高效包装的慢病毒颗粒。
三、慢病毒的使用方法慢病毒主要通过基因转染、基因表达和基因治疗等方式应用于生物研究和医学领域。
1. 基因转染：慢病毒可以用于将外源基因导入到细胞中，实现基因转染。
通过选择性的感染特定细胞或细胞系，可以研究和探索特定基因的功能和调控机制。
2. 基因表达：慢病毒可以被用作基因表达工具。
外源基因在细胞内被稳定地整合到基因组中，从而实现长期稳定的基因表达。
慢病毒可以用于产生稳定的细胞株，并通过基因敲入或敲除等方法研究基因功能。
3. 基因治疗：慢病毒在基因治疗中的应用非常广泛。
通过将修正后的基因导入到患者体内的细胞中，可以实现对某些慢病毒引起的遗传疾病的基因治疗。
此外，慢病毒载体还可以用于制备疫苗和用于癌症免疫治疗等领域。
慢病毒使用操作指南
慢使用操作指南操作指南：慢使用1、简介1.1 背景介绍1.2 慢的定义1.3 慢的应用领域2、仪器与材料2.1 实验室安全设备2.2 实验室试剂和材料2.3 慢载体和质粒3、慢的生产3.1 慢生产细胞系的选择3.2 质粒构建与筛选3.3 慢包装细胞的构建与筛选3.4 慢的生产与扩增4、慢的感染4.1 细胞培养与准备4.2 慢感染的条件优化4.3 慢感染的时间和浓度控制5、慢的转染5.1 细胞转染前的处理5.2 转染的操作条件5.3 考虑的转染效率和细胞毒性问题6、实验细胞系的维护6.1 细胞的培养和传代6.2 细胞的冻存与恢复6.3 实验细胞系的检测和验证7、实验数据记录与分析7.1 实验数据的记录和整理7.2 数据分析方法与软件使用7.3 结果的展示和解释8、安全注意事项8.1 实验操作安全措施8.2 废液处理及废弃物管理8.3 慢实验室传播的预防措施9、附件9.1 相关实验记录表格9.2 质粒和慢载体序列信息法律名词及注释：1、载体：在基因工程中，指用来携带或传递目标基因的DNA或RNA分子。
2、质粒：指自主复制的独立DNA分子，可被插入或移除目标基因，用于基因克隆、表达和操控等实验。
3、细胞培养：通过体外培养细胞的技术，提供实验所需的可控环境和条件。
4、转染：将外源DNA或RNA导入细胞内，使其表达或转录的过程。
5、传代：将细胞从一个培养器转移到另一个培养器，以维持细胞系的生长。
6、冻存：将细胞以特定的方法冷冻保存，以备将来使用。
7、废液处理：对实验过程中产生的含有有害或感染性物质的废液进行妥善处理，避免对环境和人体造成危害。
8、废弃物管理：对实验中产生的废弃物进行分类、包装和处理，符合相关法规和标准。
本文档涉及附件：1、慢生产记录表2、慢感染实验记录表3、细胞培养和传代记录表4、实验数据分析表格本文所涉及的法律名词及注释：载体、质粒、细胞培养、转染、传代、冻存、废液处理、废弃物管理。
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。
基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。
操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。
(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。
(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清(或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。
英格恩entranster转染试剂说明书
英格恩entranster转染试剂说明书一、产品概述英格恩 Entanster 转染试剂是一种用于转染外源 DNA/RNA 到细胞内的试剂。
它是经过优化的化学试剂组合，可以将外源 DNA/RNA 高效地传递到各种细胞中，并促进其定向表达。
本试剂适用于体外转染实验和基因工程研究，具有高转染效率、低细胞毒性、简单易用等优点。
二、试剂成分英格恩 Entanster 转染试剂主要成分包括转染缓冲液和转染增强剂。
转染缓冲液中包含有机溶剂、非离子表面活性剂等，用于稳定 DNA/RNA与转染剂的结合。
转染增强剂含有具有阴离子表面活性剂、脂质、蛋白质等物质，可以提高细胞膜通透性和转染效率。
三、使用说明1.储存和稀释：试剂应储存于-20℃的冰箱中，保持干燥和避光。
使用前需要将试剂溶解在适当体积的转染缓冲液中，最佳稀释比例为1：9、溶液需充分混匀，离心并去除任何沉淀物。
2.样品准备：在转染前，将目标DNA/RNA溶解在适当的缓冲液中，浓度通常在0.1-1μg/μL最佳。
确保样品充分溶解并无明显沉淀。
3.转染操作：对于已经培养至适当倍数的细胞，将细胞用预先暖和的转染缓冲液洗涤一次，并去除缓冲液。
将转染缓冲液和溶解好的目标DNA/RNA混合，稍微搅拌均匀。
与此同时，将适量的转染增强剂加入到混合物中，充分混合。
然后将混合物直接滴加到细胞上，并轻轻摇晃培养板以确保混合物均匀分布。
4.培养和检测：将含有转染混合物的培养板放回恒温培养箱中，保持恒定的温度和CO2浓度。
培养时间和温度根据需要进行调整，通常在24-48小时后可以进行下一步实验或观察。
四、注意事项1.试剂需保存在干燥、阴凉、避光的环境中，避免结冰或暴露在高温环境中。
2.操作中需佩戴手套并遵循生物安全实验操作规范。
3.使用前需充分摇匀试剂瓶，确保所有试剂成分充分混合均匀。
4.转染缓冲液中的有机溶剂可能对一些细胞有毒性，因此在选择试剂时应参考相关文献或尝试不同的浓度和时间，以确定最佳条件。
上海吉玛制药技术 吉玛重组慢病毒 说明书
1、 通常在转移载体中最大能够插入多大的目的基因序列？ 基于 HIV 基因骨架的原因，通常插入的目的基因序列要小于 4kb， 否则会影响病毒滴度甚至基因表达。
2、 Lentivirus 对目的细胞的感染效率很低，如何提高病毒的感染效率？ 一般，我们通过提高 MOI 值来提高病毒的转染效率，必要时以在 培养基中加入 Polybrene（4-8µg/ml）来提高病毒的感染效率。同时， 目的细胞良好的生长状态是获得正常感染效率的保证。
同实验室测得滴度数值会有所差异（1~5 倍），但基本不会影响正常实验 流程； （3）病毒滴度(BT = TU/ml, transducing units)计算公式： TU/μl = (P × N / 100 × V) ×1/DF， P = % GFP+ cells， N = 转染时的细胞数，V =每孔加 入病毒稀释液体积（μl），DF =稀释因子（dilution factor）= 1 (undiluted)、 10–1 (diluted 1/10)、 10–2 (diluted 1/100)。
生物安全
1、安全性 （1）删除了全部 HIV-1 的编码基因，在介导目的基因的表达时，没有任 何 HIV-1 蛋白的表达； （2）对 5’和 3’ LTR 分别进行了删除改造，5’LTR 缺失 U3，换上 RSV enhancer/promoter，使载体的复制不再依赖 Tat；3’LTR 删除 U3，使其不 再具有启动/增强活性，成为自灭活（self-inactivating, SIN）载体； （3）病毒包装必需的 3 个蛋白 Gag/Pol、Rev、VSV-G（代替 HIV-1 的 Env）分别独立放置在 3 个质粒上（pGag/Pol、pRev、pVSV-G），且互相 之间没有任何同源序列，大大降低了复制型慢病毒（RCL）的产生几率； （4）与 MuLV 等逆转录病毒载体相比，慢病毒载体的整合更偏向于宿主 细胞基因组的基因表达活跃区，激活沉默的原癌基因的几率可能比逆转 录病毒载体低； （5）慢病毒载体未发现有致肿瘤活性，全世界有 4 千万人感染了 HIV-1，
慢病毒专用转染试剂说明书
慢病毒专用转染试剂LentiFit TM使用说明书产品简介：LentiFit TM脂质体转染试剂是一种高效的阳离子脂质体转染试剂。
与其他脂质体转染试剂相比，汉恒生物独立研发的LentiFit TM脂质体转染试剂具有转染效率高，重复性好，操作简单，无明显细胞毒性，抗血清干扰等优点。
对于大多数细胞，用LentiFit TM转染后72小时内不更换培养液无明显细胞毒性。
同时，血清的存在不影响LentiFit TM的转染效率，这样可以减小无血清对细胞的损伤。
基于以上优点，LentiFit TM常用做慢病毒包装的转染试剂。
包装清单以及储存条件：试剂名货号储存条件规格有效期LentiFit TM转染试剂Let10004℃保存 1 mL12个月使用方法：1.细胞培养：以1个10 cm培养皿转染293T细胞为例，转染前一天接种细胞(20-24小时)，接种细胞约3.5×106，接种体积10 mL，确保第二天转染时细胞汇合度（confluent）能达到约50%~70%。
2.在进行转染步骤前，把10 cm培养皿中的培养液更换成新鲜细胞培养液，培养液的体积为5 mL，放回培养箱中继续培养，并准备转染体系（步骤3-6）。
3. 把LentiFit TM脂质体转染试剂轻轻混匀。
4. 对于待转染的10 cm培养皿中的细胞，取一只洁净无菌离心管，加入24 µg质粒（目的质粒和辅助质粒的比例根据不同包装系统进行调整）到500 µL DMEM溶液，用枪轻轻吹打混匀。
5. 取另一只洁净无菌离心管，加入500 µL DMEM溶液，再加入40 µL LentiFit TM，用枪轻轻吹打混匀,室温放置5分钟。
6. 将步骤4与5中的质粒溶液与LentiFit TM溶液混合，用枪轻轻吹打混匀。
不可V ortex 或离心。
室温孵育20分钟。
有可能出现絮状沉淀物，属正常现象，不会影响转染效率。
7. 将转染复合物逐滴加入到培养皿中，轻轻“8”字形摇晃混匀后，放回培养箱继续培养。
慢病毒转染手册
慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基础发展起来的基因治疗载体。
区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
基本概述慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。
慢病毒的应用目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。
由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。
采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。
在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚合酶Ⅲ有明确的起始和终止序列，而且合成的RNA不会带poly A尾。
当RNA聚合酶Ⅲ遇到连续4个或5个T时，它指导的转录就会停止，在转录产物3’端形成1~4个U。
U6和H1 RNA启动子是两种RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子，其特点是启动子自身元素均位于转录区的上游，适合于表达～21ntRNA和～50ntRNA茎环结构（stem loop）。
在siRNA表达载体中，构成siRNA的正义与反义链，可由各自的启动子分别转录,然后两条链互补结合形成siRNA；也可由载体直接表达小发卡状RNA(small hairpin RNA, shRNA), 载体包含位于RNA聚合酶Ⅲ启动子和4～5T转录终止位点之间的茎环结构序列，转录后即可折叠成具有1~4 个U 3 ’ 突出端的茎环结构，在细胞内进一步加工成siRNA。
慢病毒转染操作
一、慢病毒转染贴壁细胞实验方法
1、慢病毒转染前18-24小时，将贴壁细胞以1×10^5/孔铺到24孔板中。
使细胞在慢病毒转染时的数量为2×10^5/孔左右。
2、第二天，用含有6 μg/ml polybrene的2ml新鲜培养基替换原培养基，加入适量病毒悬液。
37℃孵育。
3、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后加入2ml新鲜培养基以稀释polybrene。
4、继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基。
5、继续培养。
如果慢病毒含有荧光蛋白，一般转染48小时后可见明显荧光表达，72小时后更加明显。
如需FACS检测转染效率，可在转染后72-96小时进行。
如果慢病毒含有抗性基因并且需要加药筛选，可以在转染3-4天后开始加药。
二、慢病毒转染悬浮细胞实验方法
1、在2×10^5/ml悬浮细胞中加入polybrene至6 μg/ml和适量病毒，充分混匀。
37℃孵育。
或者150g室温离心4小时(选作，部分难转染的细胞系采用此步骤可以提高转染效率)。
2、(对polybrene毒性敏感的细胞选作此步骤)4小时后(或离心结束后)加入等体积新鲜培养基以稀释polybrene。
3、继续培养3-4天。
中间视细胞生长情况可传代或换液。
慢病毒转染增强剂说明书
慢病毒转染增强剂说明书产品描述:Polybre ne （聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA专染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂）, 常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试［1］。
基本属性：另U 名：1,5-dimethyl-1,5-diaza un decamethyle ne polymethobromideCAS No.: 28728-55-4纯度：》94% （titration）溶解方法：溶于水，溶解能力高达10% 0.9%Nacl溶液配制1mg/mL的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8 C保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8 C, 至少一年保持稳定。
操作步骤(仅作参考)：实验1逆转录病毒感染(Retroviral Infection )(1)重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基(5%血清) 加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45卩m滤器过滤。
(2)待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5X 105/盘。
(3)病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清 (或将病毒原液稀释到2ml)感染细胞，polybrene 的终浓度为5卩g-10卩g/ml。
37° C孵育3-6h。
慢病毒包装及质粒转染手册
使用Fugene进行慢病毒包埋步骤
注意：所有操作必须在BSL-2实验室环境进行
第一节：制作慢病毒存储液
293FT细胞的培养：细胞每周按照1:4 - 1:6的比例传代3次，保持其融合度在50%以下
第1天293FT铺板
以30%融合度左右进行10cm皿铺板，37°C, 5% CO 2条件下培养24小时
第2天转染
本实验中pcmv△R8.91:PLP-VSVG :DNA=2:2:2, Total DNA:PEI=1:3
2. 试管2：对每管的转染试剂，加入570ul Opti-MEM,将30ul Fugene加入试管正中
心，避免接触任何管壁，轻轻振荡（不能使用移液器），室温下孵育5min.
3. 将加入Opti-MEM- Fugene混合液加入试管1(DNA)，轻轻震荡混匀。
4．短暂离心使管壁液体流下。
5.室温下孵育15分钟
6. 15分钟后，将Optimem/DNA/Fugene加入细胞，摇动培养皿混匀。
7. 37°C, 5% CO 2培养过夜（12-16小时）
第3天换液
第4天。
lentivirusgeneration慢病毒转染手册
Generation o f L entivirusReagents•293T: ATCC•Fugene 6 transfection reagent: Roche cat# 11814443001•FBS: Invitrogen cat# 16000-044•DMEM: Invitrogen cat# 11965-118•Pen/strep: Invitrogen cat# 15140-155•L-glutamine: Invitrogen cat# 25030-156•Non essential amino acid (NEAA): Invitrogen cat# 11140-050•Amicon Ultra Ultracel 100K: Millipore: cat# UFC910024•Beckman centrifuge tubes: Beckman: cat# 344058293T/fibroblast media (500 mls):DMEM (450 ml)10% FBS (50 ml)Pen/strep (5ml)L-glutamine (5ml)NEAA (5 ml)Reagent setupLentiviral vectors:Prepare all vector plasmids with Qiagen Maxiprep kits, including lentiviral packaging vectors and lentiviral transfer vectorsA. Production of Virus1. Seed 2x106 293T cells on a 100-cm tissue culture dish and incubate overnight until cellsreach ~70% confluence (~1-2 days). Replace with 10 ml of fresh media 2 hours before transfection.2. Mix lentiviral transfer vector and packaging vectors in 600 ul of DMEM in an eppendorftube. Add 50 ul of Fugene6 directly to the DNA mixture, making sure Fugene6 does not come in contact with the plastic. Gently vortex tube containing transfection mixture and incubate at RT for 20 min.Second generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMD2.G 5 ugpsPAX2 5 ugThird generation packaging systemTransfer vector 10 ugpMDL g/pRRE 5 ugpRSV-Rev 2.5 ugpMD2.G 2.5 ug3. Add transfection mixture dropwise to cells; incubate 4 hrs to overnight (16 hours) andreplace with fresh medium.4. Collect virus-containing medium 48 hours after transfection and replace with freshmedium. Collect virus every 12 hours for up to 3 times total. Keep all viral media at 4Cuntil all collections are done. Pass viral media through a 0.45uM low protein-binding filter.At this point, the viral supernatant can be used to infect cells, frozen at -80C orconcentrated.Concentration using Amicon Ultra Centrifugal Filters:Transfer viral supernatnat to Amicon Filter and spin filter in tabletop centrifuge at 3000 rpm for 10-20 min at 4C. Concentrated virus can be aliquoted and stored at -80C. Thaw analiquot on ice before use; do not refreeze.Concentration by ultracentrifugation:1. Transfer viral supernatant to 33ml Beckman ultracentrifugation tubes and spin for 2hrs at 24,000 rpm using SW32Ti or SW28Ti.2. Pour off supernatant carefully and resuspend viral pellet using 100-ul pipette tip withappropriate amount of DMEM to concentrate virus 100x. It may take 30 min toovernight at 4C for the pellet to completely dissolve.3. Store virus in aliquots at -80C. Thaw an aliquot on ice before each use; do notrefreeze.。
金拓思慢病毒产品说明书
金拓思慢病毒产品说明书一、产品简介慢病毒载体是一类重组逆转录病毒载体，由于其结构和功能的特点，慢病毒载体作为一种重要的基因转移工具应用于基因治疗和细胞分子生物学研究领域。
区别于一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。
该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。
在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型细胞，达到良好的基因治疗效果。
我公司生产的重组慢病毒均以国际通用的第三代载体四质粒体系生产，通过重组改造后将含有目的基因的慢病毒骨架及其相应的作用元件组合为新质粒，并通过辅助质粒将病毒包装的元件组成重组病毒。
通过自我灭活的方式，阻止病毒自我复制。
保证了慢病毒使用过程中的良好生物安全性。
二、重要说明2.1安全操作说明1.应在Ⅱ级及以上级别生物安全柜中使用慢病毒产品。
2.虽经过改造后病毒安全性极大提高，操作中仍需佩戴口罩、手套等安全防护措施以免产生潜在危害。
3.操作中所有接触慢病毒试剂的样品、耗材、器皿等均需通过84消毒液（1:20）浸泡后，高温121℃灭活15min以上。
4.实验过程中有病毒液洒落的情况时，应用纸巾将病毒液吸干后喷洒70乙醇，并将擦干的纸巾一并高温处理以免造成其它伤害、污染环境。
2.2使用注意事项所有慢病毒产品均通过干冰低温运输，请收到产品后立即转入-80℃冰箱保存。
每次使用时提前取出病毒液放置在4℃冰箱待融化，并保存于4℃冰箱。
每次融化后请尽快使用，病毒液应尽量避免反复冻融降低病毒滴度。
三、慢病毒制备与使用3.1实验材料细胞：人贴壁细胞293T培养基：高糖DMEM培养基血清：胎牛血清抗生素：青链霉素转染试剂：Transfection-mate增强剂：Polybrene3.2病毒制备方法3.2.1细胞准备细胞复苏：1.将液氮保存细胞取出后，迅速放入37℃水浴锅内，应及时轻柔摇动加快解冻速度。
2.将完全溶解的细胞离心，1500rpm，3min。
汉恒生物-慢病毒生产及使用操作手册第二版
转染后 6h 换新鲜培液。
注：LipofiterTM 转染试剂为汉恒生物产品，使用说明参考 LipofiterTM 说明书。
（四）病毒收集
转染后 48 和 72h 分别两次收集病毒上清(24h 收集后置换新鲜培液)，收集
后以 0.45 μm 滤器过滤,于 40 mL 超速离心管中，4℃，72000g/min 离心 120 分
Tel：021-51296258
实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路 720 弄张江药谷孵化器 1 号楼 314
用途 过表达 干扰
其他载体
慢病毒载体构建及包装操作手册
慢病毒载体 pHBLV-CMVIE-IRES-ZsGreen、 pHBLV CMVIE-Puro pHBLV-U6-ZsGreen、 pHBLV-U6-puro 还有其他荧光标记和启动子混搭载体，以及 tet-on 系统高表达/干扰系列载体，详情可咨询公 司分子生物学技术工程师。
2） 包装质粒信息如下： PSPAX2 及 PMD2G 载体图谱和序列信息 (购自 addgene)
2、细胞株 293T，慢病毒的包装细胞，为贴壁依赖型成上皮样细胞，生长培养 基为 DMEM(含 10% FBS)。贴壁细胞经培养生长增殖形成单层细胞。 3、菌株 大肠杆菌菌株 DH5α。用于扩增慢病毒载体和辅助包装载体质粒。
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公司地址：上海市徐汇区斜土路 1175 号 15 楼
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Tel：021-51296258
实验室地址：上海市张江高科技园区蔡伦路 720 弄张江药谷孵化器 1 号楼 314
慢病毒载体构建及包装操作手册
管中，加入 450ul 10％ DMEM，即为 10 倍稀释，混匀，取 10ul 细胞于计数板中
慢病毒包装试剂盒说明书
YRGene 慢病毒包装试剂盒说明书产品编号：LPK010 产品规格：10个10cm 皿 产品简介：赢润生物的慢病毒包装试剂盒包括如下成分：（1） 优化配比的慢病毒包装辅助质粒混合物，可兼容大多数慢病毒表达载体。
（2） 高效转染试剂（Invitrogen Lip2000原装产品分装，293T 细胞转染效率接近 100%）。
（3 ）高效率的慢病毒浓缩液，无需超速离心，也不需要价格昂贵的过滤柱，快速富集病毒粒子，其优 势在于操作安全简单，对设备要求低，产毒效率高，能够快速、高效地收获高滴度病毒。
产品组成：1. 转染前，传代 293FT 细胞于10cm 培养皿中（例如，接种 1 x 107细胞于10cm 培养皿中，使用完全 培养基DMEM+10%FBS培养），当细胞密度能够达到 90-95%即可进行转染。
Tips :培养基里面不要添加抗生素。
2. 转染前1-3小时，更换培养基，加入7ml 新鲜的完全培养基（DMEM+10%FBS ）,注意不要添加抗生素。
3. 准备转染。
在5ml 离心管中，分别配制 A 管与B 管试剂（Tube A and Tube B ）配好后，放置5min ，然后将A 管缓慢加入B 管，混合均匀。
室温放置20min ，使得脂质体-DNA 混合物形成。
Tips :混合后可能会出现淡淡的乳白状，不会影响转染。
然后将混合液逐滴均匀加入 10cm 培养皿，轻微混匀。
置于37C, 5% CO ?培养箱中培养过夜。
4. 第三天，更换培养基，加入 10ml 的完全培养基，同样注意不要加抗生素。
5. 转染后48-72h 后收取上清，转移至 15ml 离心管。
Tips :上清里面含有病毒，请小心操作。
6. 3000rpm 在4C 离心15min ，去除沉淀。
7. 上清液用0.45卩m 滤器过滤后转移到新的离心管中。
慢病毒浓缩：1. 每10ml 过滤后的病毒初始液，加入 Concen Solution 3ml ，每20-30min 混合一次，共进行 3-5次。
慢病毒操作资料说明
慢病毒操作资料说明慢病毒操作资料说明1、Hexadimethrine bromide.pdf：这是Hexadimethrine bromide（别名Polybrene）的说明书，该试剂用于提高慢病毒的感染效率，在病毒滴度测定和病毒感染实验中均需使用；2、Lenti-X™ Concentrator.pdf：这是Lenti-X Concentrator的说明书，该试剂用于病毒粒子的浓缩纯化；3、Lenti-X™ Lentiviral Expression Systems User Manual.pdf：这是过表达慢病毒（用于基因过表达）的操作说明书4、Lenti-X™ shRNA Expression Systems User Manual.pdf：这是干扰慢病毒（用于基因干扰）的操作说明书5、pLVX-shRNA1 Vector Information.pdf：pLVX-shRNA1慢病毒干扰载体说明书6、pLVX-IRES-Neo Vector Information.pdf：pLVX-IRES-Neo 慢病毒过表达载体说明书7、慢病毒（Lentivirus）载体.pdf：慢病毒载体介绍8、Lenti-X™ Lentiviral Packaging Systems FAQs.pdf：慢病包装系统常见问题介绍9、病毒纯化-PEG6000.doc：病毒纯化方法10、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒；11、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒；12、Production, concentration and titration of pseudotyped HIV-1-based lentiviral vectors.pdf：慢病毒包装、纯化、滴度测定操作指南，供理论学习；13、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；14、慢病毒实验方法.doc：慢病毒包装报告单；15、慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染.doc：慢病毒包装、纯化、滴度测定及感染操作指南；。
慢病毒使用操作手册
慢病毒使用操作手册简介：慢病毒（Lentivirus）是一种常用于生命科学研究中的病毒载体，其具有较强的基因转染能力和稳定的基因表达特性。
本操作手册旨在向研究者提供一个详细的慢病毒使用指南，帮助他们顺利进行慢病毒基因转染实验并获得准确可靠的研究结果。
一、慢病毒基本原理慢病毒属于反转录病毒，其基因组为单链RNA。
慢病毒在寄主细胞内通过逆转录过程将RNA转录为DNA，随后将DNA插入宿主基因组中。
这使得慢病毒成为将外源基因稳定集成到宿主基因组中的理想工具。
二、慢病毒使用前准备1. 实验室条件准备：确保工作台面干净整洁，并准备好所需的培养物、培养器具和试剂。
2. 慢病毒载体制备：根据实验需要，选择合适的慢病毒载体，并通过慢病毒包装系统将目标基因插入载体中。
三、慢病毒转染实验步骤1. 细胞培养：将目标细胞接种在培养皿中，并选择合适的培养基进行细胞培养。
2. 慢病毒感染：将预制的慢病毒悬液加入培养皿中，控制感染浓度和时间，以实现最佳的感染效果。
3. 筛选标记：根据实验需要，在感染后适当的时间点添加筛选标记物，如抗生素或荧光标记剂。
4. 选择和扩增：将受筛选标记影响的细胞单克隆分离，扩增和保存。
5. 验证表达：使用合适的实验方法，如western blot或PCR等，来确认目标基因的表达情况。
6. 结果分析：对实验结果进行统计学分析，并绘制适当的图表。
四、注意事项和常见问题解决方案1. 实验前应认真阅读文献，了解慢病毒的基本原理和实验操作流程。
2. 制备慢病毒载体时，应仔细验证目标基因的序列和正确插入。
3. 慢病毒感染时应注意控制感染浓度和时间，避免细胞毒性和非特异性感染。
4. 筛选标记物的选择应根据实验需要和细胞类型进行合理选择。
5. 实验过程中，注意严格遵守实验室安全和生物安全操作规范。
6. 常见问题解决方案：如遇到感染效率低或细胞毒性问题，可以尝试优化感染条件或调整细胞培养条件。
如果基因表达不稳定，可以尝试选择合适的筛选标记物或优化基因载体。
慢病毒使用手册
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Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
E． 用显微镜观察细胞感染情况时应遵从以下步骤：拧紧培养瓶或盖紧培养板， 用 70%乙醇清理培养瓶外壁后拍照，离开显微镜实验台之前，用 70%乙 醇清理显微镜载物台。
F． 废弃的含过病毒的培养基中加入 84 消毒液（1:20 左右），浸泡一天后丢 弃。接触过病毒的枪头，离心管，培养板等其他物品可用 84 消毒液稀释 液处理，也可以用煮沸处理半小时或常规灭菌（121℃，20 min）。
2. 目的细胞感染预实验
实验材料： 96 孔板一块，20-200 µl 移液枪，1-10 µl 移液枪，10 µl 和 200 µl 枪头，1.5Ep
管，Polybrene、ENi.S.，废液缸，口罩，手套等 说明： MOI：是“multiplicity of infection”的缩写，中文为感染复数或者复感染指数，含
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Lentiviral Vector Particle 使用操作手册
Medium
TU/ml 1x108 1x107 1x106
表 1．感染预实验中的实验组和感染条件
Complete Medium
Complete Medium + 5 µg/ml Polybrene
Eni.S
上海吉凯基因化学技术有限公司
中国上海张江高科技园区爱迪生路 328 号 2 楼 邮编 201203 电话：（86）21 51320189 传真：（86）21 51370635
Shanghai GeneChem Co.,Ltd
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慢病毒使用手册
1.慢病毒使用操作手册1.1 慢病毒的储存与稀释:1.1.1 病毒的储存：如果用户收到病毒液后在很短时间内即使用慢病毒进行实验，可以将病毒暂时放置于4 ℃保存；如需长期保存请放置于-80 ℃冰箱（病毒置于冻存管，并使用封口膜封口）。
A．病毒可以-80 ℃保存6个月，滴度不会明显下降；但如果病毒储存时间超过6个月，我们建议在使用前需要重新滴定病毒滴度。
B．反复冻融会降低病毒滴度：每次冻融会降低病毒滴度10%；因此在病毒使用过程中应仅尽量避免反复冻融，为避免反复冻融我们强烈建议客户收到病毒后按照每次的使用量进行分装。
1.1.2 病毒的稀释：用户需要稀释病毒时，请将病毒取出置于冰上融解后，使用培养目的细胞用PBS或无血清培养基(含血清或含双抗不影响病毒感染)混匀分装后4 ℃保存(请尽量在三天内用完) 。
1.2 慢病毒用于体外（In Vitro）实验：感染培养原代细胞和细胞建系1.2.1 慢病毒对各种细胞和组织的亲嗜性不同，用户使用慢病毒之前可以通过查阅相关文献，了解慢病毒对您的目的细胞的亲嗜性，感染复数（MOI 值）以及在体（In Vivo）注射所需要的病毒量。
如果没有相关文献支持，可以通过感染预实验得到合适的感染复数（MOI 值）（使用细胞培养板，如96孔板、24孔板等等检测病毒对目的细胞的亲嗜性）1.2.2 慢病毒感染目的细胞预实验1.2.2.1 慢病毒感染目的细胞预实验注意事项A.测定慢病毒对目的细胞的亲嗜性时，需要同时设置对慢病毒亲嗜性较高的细胞(HEK293T，Hela）作为平行实验的对照细胞。
B.在进行慢病毒感染实验时,可以用完全培养基（培养目的细胞用）稀释；理论上，含有血清，双抗或者其他营养因子的完全培养基不影响慢病毒的感染效率。
C.我们提供的病毒单位为TU/ml, 即每毫升中含有具有生物活性的病毒颗粒数。
如：病毒滴度为1E8TU/ml 即每毫升病毒液中至少含有1E8个具有生物活性的慢病毒颗粒。
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慢病毒转染增强剂说明书
产品描述：
Polybrene（聚凝胺）是一种多聚阳离子聚合物，常用于哺乳动物细胞的DNA转染实验以增强脂质体的转染效率。
Polybrene目前广泛用于逆转录病毒介导的基因转染，慢病毒介导的基因转染，作用机理可能是通过中和细胞表面唾液酸与病毒颗粒之间的静电排斥从而促进吸附作用。
Polybrene也是一种有名的抗肝素剂（肝素拮抗剂），常用来生产非特异性凝集的红细胞。
另外Polybrene也多用于蛋白测序，因为小剂量的Polybrene在自动测序分析可明显改善多肽的降解现象。
PVDF膜加入polybrene还能提高膜的亲和性。
注：Polybrene对某些细胞（如末端分化的神经元，DC细胞）毒性较大，初次应用建议先做毒性测试[1]。
基本属性：
别名：1,5-dimethyl-1,5-diazaundecamethylene polymethobromide
CAS No.：28728-55-4
纯度：≥94% (titration)
溶解方法：溶于水，溶解能力高达10%。
0.9%Nacl溶液配制1mg/mL 的储存液，可以滤膜除菌或高压灭菌。
保存与稳定性：粉末2-8℃保存，避免潮湿。
1mg/mL储存液2-8℃，至少一年保持稳定。
操作步骤（仅作参考）：
实验1：逆转录病毒感染（Retroviral Infection）
（1）重组逆转录病毒原液的制备：取5ml生长培养基（5%血清）加入约含单层转染逆转录包装细胞的100mm培养盘内。
孵育24h后，吸去培养液并用0.45μm滤器过滤。
（2）待感染细胞的培养：100mm培养盘内加入10ml完全培养基，细胞密度为5×105/盘。
（3）病毒感染：细胞培养24h后，吸去完全培养液。
用含polybrene 的2ml病毒上清（或将病毒原液稀释到2ml）感染细胞，polybrene 的终浓度为5μg-10μg/ml。
37°C孵育3-6h。
（4）收集病毒颗粒：加入8ml完全培养基。
感染3天后，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
实验2：转染
（1）完全生长培养基培养细胞,培养细胞密度约50%；
（2）孵育细胞18-24h后准备DNA-培养基-Polybrene混合液，按如下操作制备混合液：①添加完全培养基（60mm培养皿2ml，100mm 培养皿3ml），37°C预热；②添加10ng~10µg质粒轻轻混匀；③加入Polybrene至终浓度为5μg-10μg/ml。
轻轻混匀。
以上每个成分需要按顺序加入。
（3）去除培养基，在细胞中加入DNA-培养基-Polybrene溶液，在37°C孵育细胞6-20h。
细胞培养的前6h内约每1.5h轻柔混匀。
（4）去除DNA-培养基-Polybrene溶液。
用DMSO shock solution
（15%DMSO in1X HBSS）轻轻盖住细胞（60mm培养
（5）立即去除DMSO shock solution，用完全生长培养基轻轻清洗细胞2次。
对于60mm培养皿每次用5ml培养液清洗，100mm培养皿每次用10ml培养液清洗。
皿3ml，100mm培养皿4ml）。
每次加入溶液时用手轻晃培养盘10s，使得液体均匀分布。
然后37°C孵育细胞4min。
（6）加入完全培养基到细胞中；
（7）稳定转化：去除生长培养基，按照1:5的比例用选择培养基裂解细胞。
瞬时表达：去除生长培养基，加入新鲜的生长培养基。
24-72h后收获细胞。
使用浓度（详细步骤见文献）：
Polybrene的具体使用浓度依据细胞种类，转染方法等影响，以下使用浓度仅作参考。
（1）为提高腺病毒转染效率和LacZ转基因表达，使用6μg/ml Polybrene处理病毒载体后转入BHK-21细胞（MOI为100），转染率提高到95%，没有用Polybrene处理的只有2.3%转染率[2]。
（2）在KSHV(Kaposi’s sarcoma-associated herpesvirus)纯化和转染实验中，浓缩的病毒与8μg/ml Polybrene加到BCBL-1细胞中37℃下孵育2h[3]。
（3)在逆转录病毒构建研究中，用v-rasHa逆转录病毒转染角质细胞（Keratinocytes）后在含有4μg/ml Polybrene培养基中培养3
天，病毒滴度为1×107virus/ml，MOI为1[4]。
（4)在shRNA编码的慢病毒载体的转染研究中，病毒上清中加入8μg/ml Polybrene，转染到HEK293细胞中[5]。
（5)在慢病毒shRNA转染研究中，将含有6μg/ml Polybrene的新鲜培养基加入到培养24h的RCC10细胞中，用慢病毒颗粒转染细胞[6]。