转化酶的测定

转化酶的测定

转化酶又称蔗糖酶，是一种水解酶，植物体的库组织中，一般含有较高活性的转化酶，它能将植物体内的主要同化产物——蔗糖不可逆的水解为葡萄糖和果糖，为细胞的可溶性糖贮库提供可利用六碳糖，以用于细胞壁、贮藏多糖及果聚糖的生物合成，并通过与呼吸作用偶联的氧化磷酸化产生能量，所以，转化酶与植物组织的生长有密切关系，是衡量同化产物的转化和利用、植物细胞代谢及生长强度的指标。

试剂：1、10%蔗糖溶液

2、葡萄糖标准液（500μg/ml）

3、0.05mol/l的磷酸缓冲液

4、（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l NaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中，再加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即按3，5二硝基水杨酸法测定还原糖的含量。以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照。

3、还原糖标准曲线的制作及还原糖含量的测定

①标准曲线：取6支20ml刻度试管，编号，按下表配置不同浓度的葡萄糖标准液：

管号 1 2 3 4 5 6

葡萄糖原液量（ml）0 0.4 0.8 1.2 1.6 2.0

加蒸馏水量（ml） 2.0 1.6 1.2 0.8 0.4 0

葡萄糖浓度（μg/ml）0 100 200 300 400 500 在上述各管中分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟，取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温，加蒸馏水定容至20ml，混匀，以1号管为空白，测540nm 波长下的OD值。以OD值为纵坐标，葡萄糖浓度为横坐标，绘制标准曲线。

②酶反应液中还原糖的含量的测定：吸取2ml反应液，加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度。

4、结果计算：

A=(N-N’)*V/(T*W*1000)

A：转化酶的活性(mg/gfw/h) N：酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)

N’：钝化酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml) V：酶反应液的总体积

T：反应时间W：材料鲜重

转化酶的测定

方法：1、酶的提取：1g样品剪碎后，用预冷的蒸馏水在冰浴中研磨成匀浆，定容至100ml，在冰箱中浸提3小时，4000转离心15分钟，上清液即为酶的粗提液。

2、酶活性的测定：吸酶液2ml，放入试管中（以煮沸酶液10分钟钝化酶的试管作对照），加入pH6.0的缓冲液5ml及10%蔗糖溶液1ml，在37度水浴中保温30分钟，取出后立即吸取2ml加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，沸水浴中煮沸5分钟，冷却定容至20ml ，测定540nm 波长下的OD值，查标准曲线得酶反应液中还原糖的浓度：Y（μg/ml ）=744.63*OD值

3、结果计算：

A=Y*V/(T*W*1000)（一般范围14~40mg/g/fw//h）

A：转化酶的活性(mg/gfw/h) Y：上式计算得酶反应液中还原糖的浓度(μg/ml)

V：酶反应液的总体积100ml

T：反应时间0.5h W：材料鲜重（fw）

一个处理3次重复所需试验台仪器：容量瓶(100ml)

刻度试管（20mlx4，1个对照），移液管（5mlx1，2mlx1，1 ml x1），研钵

试剂：10%(w/v)蔗糖溶液现用现配：称取10g加入用蒸馏水定容至100ml.。

葡萄糖标准液（500μg/ml）： 80度烘干葡萄糖0.05克蒸馏水定容100ml。

PH=5.4,5%的磷酸缓冲液: Na2HPO4·12.H2O0.448125g, NaH2PO4·2H2O 3.731125g,加水溶解定容至250ml..

（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l 或20.96gNaOH溶液，加到500ml含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚（即苯酚）和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

预冷蒸馏水1000ml.

转化酶的测定

（一个处理，3次重复）

1g左右样品1份，剪碎

预冷的蒸馏水研磨成匀浆

蒸馏水定容至100ml

冰箱中浸提至少3小时

混均，倒入4个离心管，在 4000转离心15分钟

分别吸2ml上清液，放入4个试管

其中任选1个试管煮沸至少10分钟作对照，

此后（包括煮沸10分钟的对照试管）各试管加pH6.0的缓冲液5ml，10%蔗糖溶液1m

37度水浴中保温30分钟

取出后分别加入1.5ml 3，5二硝基水杨酸试剂，在沸水浴中加热5分钟取出后立即放入盛有冷水的烧杯中冷却至室温

加蒸馏水定容至20ml，

540nm比色（读数即为OD值）

转化酶的测定

10%(w/v)蔗糖溶液现用现配：称取10g加入用蒸馏水定容至100ml

葡萄糖标准液（500μg/ml）：葡萄糖标准液：80度烘干葡萄糖0.05克蒸馏水定容100ml。

PH=5.4,5%的磷酸缓冲液: Na2HPO4·12.H2O0.448125g, NaH2PO4·2H2O 3.731125g,加水溶解定容至250ml..

（DNS）3，5二硝基水杨酸：将6.3g二硝基水杨酸和262 ml 2mol/l 或20.96gNaOH溶液，加到500ml左右含有185g酒石酸钾钠的热水溶液中，再加5g结晶酚（即苯酚）和5g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水定容至1000ml，贮于棕色瓶中备用。

预冷蒸馏水1000ml.