嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质

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一种嗜热芽孢杆菌所产耐高温纤维素酶的特性

０１ｇＬＣＣ２０２ｇＬｐ值７０．／，ａｌ．／，Ｈ．。培养温度为６ ℃ ，５
１０ｒｍｎ振荡培养２。２ｉ／４ｈ
ＥＴ十二烷基苯磺酸钠（Ａ）进行酶促反应，ＤＡ、ＬＳ，测定各种离
子及有机物对酶活性的影响。１６酶促降解纤维素产物鉴定．利用Ｇ硅胶薄板层析，乙酸乙酯、在甲醇、乙酸和水（２：３：）１３：１配成的溶剂中展层，１ｇＬ葡萄糖和１ｓＬ以／／麦芽糖为标准样，待测样为ＣＭＣ酶解产物和滤纸酶解产物。操作步骤参照文献［１。１］
研究其酶学特性。
１材料方法
１１材料．
１５２ｐ．．Ｈ值对纤维素酶活性的影响配制ｐＨ值２０～．
１．３０的０２ｍｌＬ柠檬酸一Ｎ２Ｐ缓冲液。用纯化的纤维．ｏ／ａＨＯ素酶，在不同ｐ，Ｈ缓冲液中反应，反应温度７０℃ ，测定ＣＭＣ酶活力。
滤纯化，２Ｌｈ速度洗脱，以０ｍ／每管收集１ｍ，Ｌ测各管的２０ｎ８ｍ吸光度及酶活力。
１４纤维素酶活力测定．
’
２１耐高温纤维素酶的分离纯化．
酶活力测定参照参考文献［４—９。按ＤＳ法绘制葡萄］Ｎ糖标准曲线，然后分别测样品的ＣＣ酶活力和分解滤纸酶活Ｍ
柠檬酸一ａＨＯ缓冲液（Ｈ值７Ｏ中分别加入１ｍｌＬＮ：Ｐｐ．）ｍｏ／
的ＣＳ４・ＨＯ、ｅ（０）、Ｓ４’ ＨＯ、ｎ１、ａ１、ｕＯ５２Ｆ２Ｓ４３ＭｎＯ４２ＺＣ２ＣＣ２ＭｇＯ７２５ｍｏＬＮＣ、Ｃ，．５（量体积比）Ｓ・ＨＯ，ｍｌａ１Ｋ１００％质／

一种嗜热芽孢杆菌所产耐高温纤维素酶的特性

一种嗜热芽孢杆菌所产耐高温纤维素酶的特性
王鹏;贺芸;杨军方;李大力
【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2012(040)009
【摘要】筛选得到了产耐高温纤维素酶的嗜热芽孢杆菌,发酵获得了耐热纤维素酶,试验结果显示该酶最适温度为70℃,最适pH值为7.0,Km值为5.0×10-3
g/mL,Fe3+对酶有强烈毒害作用,十二烷基苯磺酸钠对酶活性有促进作用.酶促降解纤维素主要产物为葡萄糖.
【总页数】3页(P348-350)
【作者】王鹏;贺芸;杨军方;李大力
【作者单位】南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094;南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094;南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094;南京理工大学环境与生物工程学院,江苏南京210094
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.严格厌氧嗜热纤维梭状芽孢杆菌产纤维素酶条件的优化 [J], 章亭洲; 朱廷恒; 王腾浩; 赵艳; 沈炜
2.红树林生境产嗜热纤维素酶芽孢杆菌的筛选及其活性分析 [J], 胡芮;孙晓晖;杨淼森;唐旭;徐长安;贾若琨
3.红树林生境产嗜热纤维素酶芽孢杆菌的筛选
及其活性分析 [J], 胡芮;孙晓晖;杨淼森;唐旭;徐长安;贾若琨
4.嗜碱芽孢杆菌产碱性纤维素酶研究概况 [J], 郭成栓;崔堂兵;郭勇
5.嗜热脂肪土芽孢杆菌CHB1产蛋白酶特性 [J], 林新坚;任香芸;陈济琛;蔡海松因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理以嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理为标题，本文将探讨嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理及其应用。

嗜热脂肪芽孢杆菌是一种厌氧芽孢杆菌，广泛存在于土壤、水体和动植物体内。

该菌对高温环境适应能力强，能够在70°C至80°C的温度下存活生长。

由于其在高温环境下的生长特性，嗜热脂肪芽孢杆菌常被用作指示剂，用于检测高温灭菌过程中的杀菌效果。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的原理是基于该菌在高温下的存活特性。

在制备指示剂时，嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子会被固定在载体上，如滤纸或玻璃片。

制备完成的指示剂会呈现为白色或黄色，这是由于固定的嗜热脂肪芽孢杆菌孢子的存在。

在高温灭菌过程中，如果灭菌条件不足或操作不当，嗜热脂肪芽孢杆菌孢子会存活下来。

为了检测灭菌的效果，可以将嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂放置在被灭菌物品的不同位置，如内部和外部。

经过灭菌过程后，若指示剂上的孢子仍然存活并呈现白色或黄色，则说明灭菌过程存在问题，杀菌效果不理想。

相反，如果指示剂上的孢子变为黑色，则表明灭菌过程有效，杀菌效果良好。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂的应用范围广泛。

它常被用于医疗机构、实验室、食品加工厂等场所进行高温灭菌过程的监测。

通过使用指示剂，可以及时发现灭菌设备是否正常运行以及灭菌效果是否达标，帮助保障工作环境的安全和产品的质量。

除了在高温灭菌过程中的应用，嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂还可用于研究嗜热脂肪芽孢杆菌的生态学特性和抗菌机制。

通过对指示剂上存活的孢子进行分离和培养，可以进一步研究嗜热脂肪芽孢杆菌的生长条件和生理代谢特点。

此外，还可以利用嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂进行抗菌药物的敏感性测试，评估不同抗菌药物对嗜热脂肪芽孢杆菌的抑菌效果。

嗜热脂肪芽孢杆菌孢子指示剂是一种基于嗜热脂肪芽孢杆菌在高温环境下存活特性的指示剂。

它广泛应用于高温灭菌过程的监测，可以及时发现灭菌问题并保障工作环境的安全和产品的质量。

嗜热芽孢杆菌XJT—9503高温中性蛋白酶的研究　Ⅱ.酶的提纯及酶学特性研究

嗜热芽孢杆菌XJT—9503高温中性蛋白酶的研究Ⅱ.酶的
提纯及酶学特性研究
活泼;潘惠霞;王志方;冯蕾;石玉瑚
【期刊名称】《生物技术》
【年(卷),期】1997(7)3
【摘要】嗜热芽孢杆菌XJT—9503菌的发酵液经硫酸铵和丙酮分级沉淀分离纯化得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的高温中性蛋白酶制品。

SDS—PAGE测得酶分子量为3000。

当以酪蛋白为底物时，酶反应最适温度为65℃，最适pH为7．在
PH6．5—9范围内稳定。

在65℃、0、02MpH7．5的磷酸缓冲液中的半衰期为54min。

金属离子铜、汞、铝强烈抑制酶活，钙离子，镁离子对酶活有促进作用。

【总页数】4页(P18-21)
【关键词】嗜热芽孢杆菌;高温中性;蛋白酶;提纯;酶学性质
【作者】活泼;潘惠霞;王志方;冯蕾;石玉瑚
【作者单位】新疆农业科学院微生物研究所
【正文语种】中文
【中图分类】Q939.124
【相关文献】
1.耐热芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶的中试发酵工艺 [J], 活泼;茆军;石玉瑚
2.嗜热脂肪芽孢杆菌HY—69耐热中性蛋白酶的性质研究 [J], 金城;杨寿钧
3.嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质 [J], 唐兵;周林峰;陈向东;戴玄;彭珍荣
4.嗜热芽孢杆菌XJT9503高温中性蛋白酶的研究──Ⅰ．XJT9503菌的特性 [J], 活泼;潘惠霞;冯蕾;王志方;石玉瑚
5.含XJT-9503高温中性蛋白酶基因Gp1重组菌B-pGp1表达条件的研究 [J], 冯蕾;古丽努尔;杨新平
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芽孢杆菌耐高温的原因

芽孢杆菌耐高温的原因
芽孢杆菌一般是指嗜热脂肪芽孢杆菌。

通常情况下，嗜热脂肪芽孢杆菌耐高温，并且耐热性比较强。

具体情况分析如下：嗜热脂肪芽孢杆菌为嗜热性需氧芽孢杆菌，但兼有厌氧的特性，耐热性是非常强的，在经过高温之后，也可能会残留一部分，是造成食品腐坏和变质的主要微生物之一，在食品保存方法不正确或者是存放的时间比较长时，可能会导致里面滋生很多嗜热脂肪芽孢杆菌，而且经过高温的烹饪之后，也不能达到完全杀灭的效果，可能会导致人体出现急性胃肠炎、食物中毒等不良反应，表现为呕吐、腹泻、腹痛等。

建议滋生了嗜热脂肪芽孢杆菌的食物即使加热也不要再吃，不利于身体健康。

嗜热菌P4的筛选、鉴定及其高温蛋白酶性质研究

酪蛋向之前先加０４ｍｏＬ氯乙酸２ｍＬ．］／，使酶失活，再加入酪蛋自．最后，跟据酪氨酸标准曲线汁
算酶活力Ｊ．
酶活单位定义（Ｊ：在一定的温度和ｐＩ）Ｈ条件下，ｌｎ水解酪素产生１ｇ氨酸为一个酶活力ｍｉ酪单位．
２结果与分析
０
２１热菌的筛选．嗜本实验分离到嗜热菌（长温度大于生
５５Ｃ）１株，其中在蛋白酶筛选平板上产透ｏ９明圈的嗜热菌ｌ，埘其中透明圈较大的８０株株菌进彳蛋白酶活力的初步测定（图１．＝ｊ了见）
达９％．同时，其部分生理生化特征与《９伯杰氏细菌鉴定手册》１４１中嗜热芽孢杆菌（ａｉｕｓａ — Ｂｃｌｅｒｌｓｔｏｔｅｍｐｉｓｈｒｏｈｌ）一致（表２，因此，初步确定该菌株为嗜热脂肪地芽孢杆菌（ｅｂｃｌｓｔｒｔｒｕ见）Ｇｏａｉｕｅｏｅ— ｌｓａｈｍｐｉｓ．『：嗜热芽孢杆菌（ａｉｕｓａｏｅｏｈｕ）为嗜热脂肪地芽孢杆菌（ｅｂｃｌｅ— ｏｈｕ）注ｌＢｃｌｅｒｈｒｐｉｓｌｓｔｔｍｌＧｏａｉｕｓａｌｓｔｒｔｅｍｏｈｌｓｏｈｒｐｉ）的别名．ｕ１
中，６水浴２ｍｉ，再加入预热好的２０ｎ％酪蛋白溶液１，摇匀后于６：ｍＬ０ｃ水浴１ｌ．反成完毕后【０ｌｉＩｎ加入０４ｍｏＬ＝氯乙酸２ｍ．ｌ／Ｌ终止反应．０ｍｎ心５ｍｎ１００ｒｉ离０／ｉ，取七清，加入（４ｍ１酸钠５ｍｌ）ｏ／碳．ＩＪ，再加入１福林试剂，摇匀置于水浴锅中，继续保温发色２ｉ，测定Ｏ … 另外，空ｒ对照在加ｍＬ０ｒｎａＤＩ

嗜热脂肪芽孢杆菌中耐热蛋白酶基因的克隆

嗜热脂肪芽孢杆菌中耐热蛋白酶基因的克隆
杨庆云;江行娟
【期刊名称】《生物工程学报》
【年(卷),期】1991(007)003
【摘要】用鸟枪法把嗜热脂肪芽孢杆菌313-1(供体菌)染色体上的蛋白酶基因克隆到质粒pPL603上,并在枯草杆菌中得到表达。

此基因位于6.6kb的EcoRI酶切片段上,带有重组质粒的枯草杆菌所产生的蛋白酶活性比供体菌株约提高30倍左右。

该酶的最适反应温度为75℃,最适pH为7.0左右,是一个中性蛋白酶,在80℃作用30min后仍保留85%以上的酶活。

【总页数】6页(P207-212)
【作者】杨庆云;江行娟
【作者单位】不详;不详
【正文语种】中文
【中图分类】Q785
【相关文献】
1.嗜热脂肪芽孢杆菌α—淀粉酶基因的亚克隆和表达 [J], 张德玉;狄冽
2.嗜热脂肪芽孢杆菌HY—69耐热金属蛋白酶基因表达产物的纯化及性质研究 [J], 孙超;金城
3.嗜热脂肪土芽孢杆菌GL-1 Hsp33基因的克隆及结构分析 [J], 高丽梅; 高金秀; 梁蔓蔓; 刘妍; 姚淑敏
4.嗜热脂肪芽孢杆菌耐热α-淀粉酶基因在大肠杆菌中的克隆和表达 [J],
N.Tsukagoshi;李尔炀
5.嗜热脂肪芽孢杆菌孢子在四种介质中的耐热性 [J], 熊海元
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嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶

嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus），是一种广泛存在于自然环境中的细菌，其特点是喜好生长于高温环境，并且具有较高的耐热性。

淀粉酶是嗜热脂肪芽孢杆菌产生的一种酶类物质，具有重要的应用价值。

淀粉酶是一类在淀粉颗粒水解过程中起关键作用的酶类。

它能够催化淀粉分子内部的α-1,4-葡萄糖键断裂，从而将淀粉分解为较低聚的糊精、麦芽糊精和麦芽糖等产物。

由于淀粉是一种常见的多糖类物质，在食品工业、饲料工业和生物技术等领域具有广泛的应用前景。

嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶具有多种优点，使其在工业上得到了广泛的应用。

首先，嗜热脂肪芽孢杆菌的生长温度适应范围较宽，能够在较高的温度下生长，从而提高了淀粉酶的生产效率。

其次，嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶在高温下仍保持较高的活性，能够在高温条件下进行淀粉的水解反应，提高了工业生产的温度范围。

此外，嗜热脂肪芽孢杆菌产生的淀粉酶对底物的亲和力较高，能够高效地水解淀粉颗粒，提高酶的利用率。

淀粉酶的应用领域非常广泛。

在食品工业中，淀粉酶可以用于面包、饼干、饼子等面点制品的生产中，通过调控面团中淀粉的水解程度，改善产品的质地和口感。

在饲料工业中，淀粉酶可以用于动物饲料的加工中，通过降低饲料中的淀粉含量，提高饲料的消化率和营养价值。

在生物技术领域，淀粉酶可以用于生物燃料的生产中，通过将淀粉转化为可发酵的糖类物质，为生物燃料的产生提供原料。

除了在工业应用中，淀粉酶还具有一定的医学价值。

研究发现，淀粉酶对人体消化系统中的淀粉消化起到重要的作用。

通过补充淀粉酶，可以改善人体对淀粉的消化吸收，从而缓解消化不良等相关问题。

总结来说，嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶是一种具有重要应用价值的酶类物质。

它在工业生产中具有广泛的应用前景，在食品工业、饲料工业和生物技术领域发挥着重要作用。

同时，淀粉酶在医学领域也具有一定的价值。

未来的研究和应用将进一步拓展淀粉酶的应用领域，为人类的生产和生活带来更多的便利和效益。

嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质

3武汉市晨光计划资助项目(985003077)1现在工作地址:四川涪陵师范学院生物系;2通讯作者作者简介:唐　兵(1968-),男,山东省济南市人,武汉大学生命科学学院副教授,博士,主要从事微生物生理及应用微生物学研究收稿日期:1998205208,修回日期:1998210219嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质3唐　兵　周林峰　陈向东　戴　玄1　彭珍荣2(武汉大学生命科学学院　武汉　430072)摘　要:对嗜热脂肪芽孢杆菌(B acillus stearothermophilis )WF146的产蛋白酶的条件进行了研究,在58℃条件下,WF146在p H 值为715的Fd 培养基中振荡发酵培养48h 后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL 以上。

对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD ,最适作用p H 为810,最适作用温度为80℃,具有良好的p H 稳定性及热稳定性。

Ca 2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF 、DFP 及IAA 能强烈抑制酶活力,而DTT 对该蛋白酶活力无影响。

关键词:嗜热脂肪芽孢杆菌WF146,高温蛋白酶,性质中图分类号:Q936 文献标识码:A 文章编号:0001-6209(2000)02-0188-92蛋白酶是一类广泛应用于食品、医药、洗涤剂、纺织及皮革处理等方面的重要工业用酶。

而高温蛋白酶具有耐热、耐变性剂、耐有机溶剂等优点,有重要应用价值。

不仅如此,对高温蛋白酶的耐热机制的阐明还可以为人们利用蛋白质工程技术改造天然酶,从而提高其稳定性提供理论依据。

人们已经从许多嗜热细菌中分离到高温蛋白酶[1～3],其中嗜热解朊芽孢杆菌(B acill us thermoproteolyticus )生产的嗜热蛋白酶(thermolysin )已在工业上用来生产二肽甜味剂(aspartame )[4]。

但是,高温蛋白酶一般酶产量低、生产成本高。

我们筛选到一株高温蛋白酶的高产菌株嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophil us )WF146[5],对其产酶条件及一些酶性质进行了研究。

嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达_纯化及其酶学性质的研究.kdh

中国科学C辑:生命科学 2008年第38卷第2期: 166~172 166 《中国科学》杂志社SCIENCE IN CHINA PRESS嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究张敏①②, 赵丛①, 杜连祥①, 路福平①*, 高晨③①天津科技大学生物工程学院, 天津 300457;②沈阳农业大学工程学院, 沈阳 110161;③南开大学生命科学学院, 天津 300071* 联系人, E-mail: lfp@收稿日期: 2007-07-08; 接受日期: 2007-10-13国家高技术研究发展计划(批准号: 2007AA02Z212)资助项目摘要本文中嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)的高温中性蛋白酶基因在sacB基因启动子的调控下, 以蛋白酶自身或sacB基因的序列为信号肽, 分别实现了在枯草芽孢杆菌DB104中的高效表达. 表达产物经纯化后, 酶的比活力可达16530 U/mg, 纯化倍数达到3.8倍, 分子量约为35 kD. 对酶学性质的研究结果表明, 此酶的最适反应温度为65,℃最适作用pH为7.5, 在65℃下反应1 h后, 仍可保留约80%的活力. 关键词枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) 高温中性蛋白酶表达纯化酶学性质工业用酶约占世界酶总量的60%, 而蛋白酶是工业用酶中最重要的组成部分[1], 它能够催化蛋白质水解. 枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)可以分泌大量的胞外酶, 这些酶被广泛地应用于洗涤剂、食品、制药、皮革和化工等行业[2,3].许多种嗜热菌可以产生热稳定性高的胞外蛋白酶, 例如Bacillus stearothermophilus[4], Thermos aqua-ticus[5], Bacillus licheniformis[6], Bacillus pumilus[7]和Thermoanaerobacter yonseiensis[8]等, 其中有些种类在工业生产中具有非常重要的作用. 由于它们具有高的反应温度和良好的热稳定性, 因此能够加快催化反应速率, 提高非气态底物和产物的溶解性, 从而降低染菌的几率. 在嗜热蛋白酶中, 高温中性蛋白酶得到了广泛地研究[9∼11]. 例如, Fujii等人[12]报道了嗜热脂肪芽孢杆菌(B. stearothermophilus)高温中性蛋白酶基因的克隆与表达, 实验表明蛋白酶的作用pH呈中性, 于65℃下反应30 min后仍可保留约80%的活力. 同时, Huang等人[13]也报道了对嗜热枯草杆菌HS08高温中性蛋白酶的纯化及酶学性质的研究, 所得蛋白酶在40~65℃间均具有较好的热稳定性, 于65℃下反应1 h后仍可保留75%的酶活力.本研究室从土壤中得到了一株高产高温中性蛋白酶的B. stearothermophilus, 将该菌于46℃下培养60 h并纯化后, 蛋白酶的比活力可达11240 U/mg, 蛋白酶表达产物的分子量约为35 kD, 最适作用温度和pH分别为65℃和7.5, 将该酶于65℃下反应1 h后仍可保留80%的酶活力. 但是, 由于 B. stearothermo-philus的培养温度较高, 限制了其大规模的生产, 因此有必要来构建一个能够在中温下进行表达的系统. 同时, 枯草芽孢杆菌表达系统是一种较为理想的异中国科学 C 辑: 生命科学 2008年第38卷第2期167源蛋白表达系统[14], 其优点在于可以高效地表达具有生物学活性的异源蛋白并将其分泌至培养基中[15], 而且枯草芽孢杆菌也具有较高的生物安全性.因此, 本文将高温中性蛋白酶基因克隆入B. sub-tilis , 来构建一个对高温中性蛋白酶基因进行诱导表达的系统, 使该基因处于sacB 基因启动子的调控下, 并分别以自身或sacB 基因的序列作为信号肽. 同时, 对高温中性蛋白酶的纯化及酶学性质也进行了研究.1 材料与方法1.1 菌种、质粒和培养条件B. subtilis DB104是双蛋白酶缺陷型菌株, 作为蛋白酶的表达宿主[16]; 大肠杆菌(E. coli ) JM109是基因操作的克隆宿主[17], 2个菌株均于37℃下LB 培养基中进行培养. 重组大肠杆菌用LB 培养基(含30 µg/mL 氯霉素(Cm))进行培养和筛选, 而重组枯草芽孢杆菌用LB 培养基(含5 µg/mL 红霉素(Em))进行培养和筛选.pBSAT 质粒上含有sacB 基因, 由本研究室构建. 质粒pHP13PS 是由pHP13载体(E. coli -B. subtilis 穿梭载体)构建而来的, 其上含有sacB 基因的启动子和信号肽序列; 质粒pHP13P 也是由pHP13载体构建而来的, 但其仅含有sacB 基因的启动子序列.1.2 DNA 的操作本实验所采用的限制性内切酶、T4 DNA 连接酶和Taq DNA 聚合酶均购自TaKaRa 公司; DNA 片段的分离纯化、酶切反应、琼脂糖凝胶电泳、DNA 连接以及对大肠杆菌的转化等操作均参照分子克隆实验指南[17].1.3 高温中性蛋白酶序列的克隆根据已发表的高温中性蛋白酶基因的全序列, 设计用于扩增高温中性蛋白酶基因(nprT )的一对引物, 此基因包括信号肽、前肽和成熟肽序列. 两个引物序列分别为5′-CCGGTCGACGGGAAAATTGGAAAA- TGAAAAGG-3′(Sal Ⅰ)和5′-CCGAATTCACATCAG- TGGAGGAAAAAATCCCCCA-3′(Eco R Ⅰ). PCR 反应条件: 94℃, 5 min; 94℃, 1 min, 55℃, 1 min, 72℃, 2 min, 35个循环; 72℃, 10 min.根据nprT 基因序列, 设计用于扩增nprT"的2个引物, nprT"基因不包含信号肽序列. 2个引物序列分别为: 5′-CCCCCGGGGCCCAAGTATTTTTACCTTAC- AAT-3′(Sma Ⅰ)和5′-CCGAATTCACATCAGTGGAG- GAAAAAATCCCCCA-3′(Eco R Ⅰ). 扩增的产物利用琼脂糖凝胶进行分离纯化, 并通过DNA 测序进行验证.1.4 诱导型表达载体的构建将用Sal Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后大小为1725 bp 的nprT 基因片段, 克隆入同样用Sal Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切的pHP13P 载体上, 得到质粒pHP13PN, 该质粒上nprT 基因处于sacB 基因的启动子和自身信号肽序列的调控下(图1(a)); 将用Sma Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切后大小为1651 bp 的nprT"基因片段, 克隆入同样用Sma Ⅰ和Eco R Ⅰ双酶切的pHP13PS 载体上, 得到质粒pHP13PSN, 该质粒上npr T"基因处于sacB 基因的启动子和信号肽序列的调控下(图1(b)).1.5 高温中性蛋白酶基因的诱导表达将质粒pHP13PN 和pHP13PSN 按照Chang 等人[18]的方法转化入B. subtilis DB104中, 分别得到重组子DB104/pHP13PN 和DB104/pHP13PSN. 再将重组子接入LB 培养基(含5 µg/mL 红霉素(Em)中, 于37℃, 200 r/min 的条件下培养2 h 后, 加入2%的蔗糖溶液诱导高温中性蛋白酶基因的表达, 以未加蔗糖溶液的作为对照; 继续培养50 h, 将培养液于4℃, 14000× g 离心15 min 后收集上清以测定其酶活力. 同时, 用SDS- PAGE 法来检测高温中性蛋白酶基因的表达情况.1.6 高温中性蛋白酶(NprT)的纯化将培养物上清液用饱和度为80%的硫酸铵溶液进行沉淀后, 再加入20 mL 的Tris-HCl 缓冲液 (50 mmol/L, pH 7.5)溶解沉淀, 并于4℃下用同样的缓冲液透析12 h, 透析得到的溶液经DEAE-Sephadex A25柱层析后收集含有NprT 的部分, 再次用80%饱和度的硫酸铵溶液进行沉淀后, 以0.3 mL/min 的速率用DEAE-Sephadex A50柱进行洗脱.1.7 蛋白酶NprT 酶活力的测定蛋白酶活力的测定是将1 mL 1%的酪素溶液(pH 7.5)与1 mL 的酶稀释液混匀, 于65℃下反应10 min张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究168图1 质粒的构建图谱(a) 质粒pHP13PN包含由sacB基因启动子和自身信号肽序列调控的nprT基因; (b) 质粒pHP13PSN包含由sacB基因启动子和信号肽序列调控的nprT"基因. Cm和Em分别为E. coli和B. subtilis中的筛选标记后, 加入2 mL 10%的三氯乙酸溶液(TCA), 充分振荡后于14000×g下离心20 min, 取1 mL上清液采用Folin酚法测定酪氨酸的含量[19]. 蛋白酶活力单位定义为: l mL液体酶在65℃和pH 7.5的条件下, l min水解酪素产生l µg酪氨酸为1个酶活力单位.1.8温度和pH对NprT酶活力的影响将溶于Tris-HCl 缓冲液(50 mmol/L, pH 7.5) 的NprT分别于40~75℃下进行反应, 以测定纯化后NprT的最适反应温度. 纯化NprT的最适作用pH于65℃下分别在不同的缓冲体系中进行测定, 3种缓冲液分别为50 mmol/L乙酸钠溶液(pH 4.0~5.5)、50 mmol/L磷酸钠溶液(pH 6.0~7.0)和50 mmol/L Tris- HCl溶液(pH 7.5~9.0). 为测定NprT的热稳定性, 将溶于50 mmol/L Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)的纯酶于65℃下作用不同的时间后, 测定其剩余的酶活力.2结果与分析2.1质粒pHP13PSN和pHP13PN的构建通过PCR扩增分别得到nprT和nprT"基因, nprT 基因包括信号肽序列(1~57 bp)、前肽序列(58~708 bp)和成熟肽序列(709~1656 bp)(图2)[20]. 为研究高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中的表达, 构建了2个不同的表达载体. 其中, 质粒pHP13PN包含sacB 基因的启动子和nprT基因的信号肽序列(图1(a)), 而质粒pHP13PSN包含nprT"基因以及位于其上游的sacB基因的启动子和信号肽序列(图1(b)). 利用含Em的LB平板来筛选重组子, 每次筛选大约有20~30个转化子, 然后通过酶切和PCR扩增来验证插入基因片段的正确性.为确认质粒pHP13PSN和pHP13PN中sacB基因序列与高温中性蛋白酶基因序列之间的可读框连接正确, 我们分别测定了整个基因序列. 结果表明, 两个连接处的读码框均正确, 并且本实验克隆的高温中性蛋白酶基因序列与已报道的基因序列有99%的同源性(GenBank登录号: M21663).2.2高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中的表达将构建的重组质粒pHP13PSN和pHP13PN分别转化B. subtilis DB104后, 向培养液中分别加入蔗糖溶液来诱导高温中性蛋白酶基因的表达, 利用12% SDS-PAGE来进行检测. 电泳结果表明, NprT存在于培养物上清液中, 同时也表明NprT被成功地分泌到胞外(图3).在培养过程中, 定时取样测定上清液中NprT的酶活力(图4). 结果显示, 重组子pHP13PN/DB104培养物上清液中的NprT酶活力达7020 U/mL, 而重组子pHP13PSN/DB104培养物上清液中的NprT酶活力高达13580 U/mL, 表明sacB基因的信号肽序列对于nprT基因的表达效果更显著. 对含有NprT的粗酶液进行纯化(表1), 当纯化倍数为3.8时, 其比活力可达中国科学C辑: 生命科学 2008年第38卷第2期图2 nprT基因的核苷酸和氨基酸序列169张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究170图3 高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中表达产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析M: 分子量标记; 1: pHP13/DB104培养物的上清液(对照组); 2: pHP13PN/DB104培养物的上清液; 3: pHP13PSN/DB104培养物的上清液图4 高温中性蛋白酶基因在B. subtilis DB104中表达情况的比较■: 质粒pHP13PN上含有nprT基因和自身的信号肽序列; ▲: 质粒pHP13PSN上含有nprT"基因和sacB基因的信号肽序列; ×: 质粒pHP13上未插入外源基因16530 U/mg, 提高了13.4%, 而Huang等人[13]的研究表明NprT的比活力仅为13172 U/mg, 提高 5.1%. SDS-PAGE分析的结果表明(图5), 有一分子量约为35 kD的特征蛋白带出现, 大小与出发菌株的一致.图5 NprT纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析M: 分子量标记; 1: 纯化NprT2.3温度和pH对NprT酶活力的影响将纯化的NprT分别于40~75℃温度下反应, 测定NprT酶活力. 结果表明(图6(a)), 酶的最适反应温度为65℃, 当反应温度超过65℃以后, 酶活力迅速下降; NprT的作用温度范围较宽, 为55~75℃, 并且在40~ 65℃之间, NprT具有较好的热稳定性; 在65℃下反应1 h后仍可保留约80%的酶活力, 因此, NprT可被定义为嗜热酶. 研究不同pH对NprT酶活力的影响, 结果表明(图6(b)), 当pH<5.5时, 酶活力较低, 当pH>5.5时, 酶活力迅速升高; NprT作用的最适pH为7.5, 在pH 6.5~9.0范围内均有较高的酶活力.3讨论由于 B. subtilis向胞外分泌高浓度的蛋白酶[21],中国科学 C 辑: 生命科学 2008年第38卷第2期171表1 NprT 的纯化结果步骤体积/mL 总蛋白/mg 总酶活力/×104U 比活力/U·mg -1回收率/% 纯化倍数粗酶液 500 525.5 228.6 4350 100 1 (NH 4)2SO 4盐析 300 387.2 195.1 5040 85.3 1.15 DEAE-Sepharose A25 167 74.4 92.6 12450 40.5 2.86 DEAE-Sepharose A5093 18.5 30.6 16530 13.4 3.8图6 温度(a)和pH(b)对高温中性蛋白酶活力的影响以致影响了表达产物的稳定性, 而B. subtilis DB104是双蛋白酶缺陷型菌株, 有助于提高分泌蛋白的稳定性. 同时在枯草杆菌表达系统中使用诱导启动子系统, 可以使外源基因在加入诱导剂之前并不表达, 从而不会影响到宿主菌的生长; 当加入诱导剂后, 就可以使外源基因得到表达, 从而保证了外源蛋白的稳定性和高产量. 蔗糖诱导系统是B. subtilis 两大天然诱导系统之一, 由sacA 和sacB 两个基因组成. 其中, sacB 基因编码果聚糖蔗糖酶, 是一种受蔗糖诱导的胞外酶, 既具有蔗糖诱导表达所需要的诱导区域, 也具有使蛋白有效分泌的信号肽序列.对于中温菌 B. subtilis 的培养比高温菌 B. stearothermophilus 要容易得多, 将B. subtilis 作为高温中性蛋白酶基因的表达宿主会对酶的应用提供一个很有前景的方式. 本文中高温中性蛋白酶基因在 B. subtilis DB104中成功地实现了表达, 酶的比活力较出发菌株有所提高, 可达16530 U/mg. 实验结果表明, sacB 基因的信号肽序列在引导高温中性蛋白酶进行分泌时所起的作用要优于蛋白酶自身的信号肽序列. 纯化酶的最适作用pH 和反应温度分别为7.5和65, ℃在65℃下反应1 h 后, 仍可保留约80%的活力. 实验结果也表明, 重组酶的性质与出发菌株的相同, 有必要对高温中性蛋白酶的动力学性质进行分析, 以确定蛋白酶的种类.本文首次利用sacB 诱导基因来构建一个对高温中性蛋白酶基因进行高效诱导表达的系统, sacB 基因的表达不仅可以利用蔗糖来诱导, 其表达水平也可以通过一些多效调控基因来得到提高, 例如degQ , degU 和degS 基因[22∼24]. 目前, 本研究室正在构建含有多效调控基因的重组质粒, 这样将会使高温中性蛋白酶基因的诱导表达水平有更大的提高.张敏等: 嗜热脂肪芽孢杆菌高温中性蛋白酶在枯草芽孢杆菌中的表达、纯化及其酶学性质的研究参考文献1 Nascimento W C A, Martins M L L. 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发酵综合实验实验报告

目录摘要.................................... 错误！未定义书签。

1 引言 (4)2材料与方法 ............................ 错误！未定义书签。

3 结果与讨论............................ 错误！未定义书签。

4 总结.................................. 错误！未定义书签。

5 心得体会.............................. 错误！未定义书签。

参考文献................................ 错误！未定义书签。

蛋白酶的发酵工艺研究摘要中性蛋白酶是最早被发现并广泛应用于工业化生产的蛋白酶制剂，可用于皮革脱毛、软化、畜禽血液蛋白质水解、果酒、啤酒和饮料的澄清以及医学治疗等应用领域中。

本文对一株产中性蛋白酶枯草芽孢杆菌（AS1.398）的发酵条件进行了研究，考察不同因素条件下对产酶的影响。

通过摇瓶培养研究碳源浓度，不同接种量对蛋白酶产量的影响。

利用酪蛋白培养基的平板实验观察蛋白酶的性质。

利用发酵罐培养观察时间对产酶的影响.结果表明:豆饼粉3.0g/100ml，玉米粉4.0g/100ml，麸皮粉2.5g/100ml，磷酸氢二钠0.4g/100ml，磷酸二氢钾0.03g/100ml，pH 7.2-7.4为最适宜培养基组分。

并且发酵罐培养的产酶活性高于摇瓶培养。

关键词：中性蛋白酶；枯草芽孢杆菌；摇瓶培养；发酵罐The Fermentation Process Research of Protease Abstract Neutral protease is the first to be discovered and widely used in industrial production of the protease preparation ,which can be used for leather hair removal, softening, animal blood protein hydrolysis, wine, beer and beverage clarification, and in applications such as medical treatment.The fermentation conditions of a Bacillus Subtilis （AS1.398） which can produce neutral protease were studied in this paper. Under the condition of different factors to examine the influence of enzyme production.This study discussed concentration of carbon source, different inoculum on protease yield by shake flask. Casein petri dishes has been used in the observation of the nature of the protease. Fermentation tanks culture was used for observing time's effection on the production of enzymes. the results showed that soybean meal 3.0g/100ml, corn flour 4.0g/100ml,wheat bran powder 2.5g/100ml,disodium hydrogen phosphate 0.4g/100ml,potassium dihydrogen phosphate 0.03g/100ml, pH 7.2-7.4 was the most appropriate medium composition. Enzyme production activity of Fermentation tanks culture was higher than shaking culture. Keywords: Neutral protease；Bacillus subtilis；Shaking culture；Fermentation1 引言1.1 自然界中有大量产泌外蛋白酶微生物，其中以微生物的产酶活性最优。

嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究

嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究赵淑琴;杨孝朴;刘霞;杨学山【摘要】对获得的嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶进行了酶学性质测定.结果表明：普鲁兰酶最适温度为60℃,此温度下处理90 min,残存酶活在70%以上,70℃酶的半衰期大于50 min；最适pH 5.6,在pH 4.5~6.0的范围50℃保温24 h仍具有较高活性；Km为0.036μmol/L,Vmax为20.16μmol/min；Mn2+、Mg2+和 Ca2+对酶有激活作用,其中以Mn2+的激活作用最强,而Cu2+和Zn2+则有抑制作用.研究表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶,对底物有较强亲合力和催化活性,在淀粉糖化工业中有良好的应用前景.%A study was conducted on the enzymatic properties of pullulanase which obtained from Ba-cillus stearothermophilus.The results showed that the optimum temperature was 60 ℃,about 70% of re-sidual activity was still sustained after treatment for 90 min at 60 ℃.The half-life was longer than 50 min at 70 ℃.Optimum pH was 5.6.The enzyme kept a higher activity in the range of pH 4.5 to 6.0 for 24 h at 50 ℃.Km was 0.036μmol/L,Vmax was 20.16μmol/min;Mn2+,Mg2+ and Ca2+ activated the enzyme activi-ty,among them Mn2+ had the most activation.Cu2+ and Zn2+ inhibited the enzyme activity.It is suggested that the pullulanase obtained from B.stearothermophilus belongs to high-temperature acidic enzymes,can be used in starch processing industry.【期刊名称】《甘肃农业大学学报》【年(卷),期】2014(000)003【总页数】5页(P130-133,140)【关键词】嗜热脂肪芽孢杆菌;普鲁兰酶;酶学性质【作者】赵淑琴;杨孝朴;刘霞;杨学山【作者单位】甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070;甘肃农业大学生命科学技术学院，甘肃兰州 730070【正文语种】中文【中图分类】TS235.1工业上使用的谷类淀粉是由直链淀粉和支链淀粉构成，且支链淀粉一般占75%～85%.支链淀粉中除主要的α-1，4糖苷键外，还有5%～6%存在于分支点的α-1，6糖苷键.淀粉工业上常用的α-淀粉酶和β-淀粉酶，只作用淀粉中α-1，4糖苷键，对α-1，6糖苷键不起作用，不利于淀粉的充分利用.1961年Bender和Wallenfals首次在Aerobacteraerogenes中发现普鲁兰酶，由于该酶具有切割α-1，6糖苷键的作用而倍受关注.国外作了大量研究，发现不少类似的具有相同功能的新酶［1］.我国早在20世纪70年代就筛选到了产普鲁兰酶的菌株，但由于该菌株所产的普鲁兰酶最适pH为5.5～6.0，与糖化酶的最适pH不符，且在pH ＜5时易失活，所以没有得到广泛应用［2］.为了改变这一现状，本研究对嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillusstearothermophilus）中的普鲁兰酶（Pullulanase）经分离纯化、电泳检查后，对其酶学性质进行研究，主要包括最适温度、最适pH 值、热稳定性、酸稳定性、金属离子依赖性和酶促反应动力学常数等，旨在为该酶在生产实践中的应用提供参考数据.1.1 试验材料1.1.1 菌种嗜热脂肪芽孢杆菌（Geobacillus stearothermophilus）购自中科院微生物研究所，菌种编号1.1923；普鲁兰酶为从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离纯化的胞内普鲁兰酶，配制成0.05mg／mL的酶溶液.1.1.2 主要试剂普鲁兰（Pullulan）购自Fluka公司；其他化学试剂均为国产分析纯.1.1.3 主要仪器 TU-1800PC紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），HH-601超级恒温水浴箱（常州菲普实验仪器厂），HH-6数显恒温水浴锅（南京莱步科技实业有限公司），HPSJ-3F酸度计（上海精密仪器仪表有限公司）.1.2 试验方法1.2.1 普鲁兰酶的最适作用温度在恒定pH值条件下，测定不同温度对酶活性的影响［3］.具体方法参照淀粉酶的标准测量法［4］，不同温度试验管平行3份，取其平均OD540nm值，查葡萄糖标准曲线，计算酶相对活性，以活性最高者为100%.1.2.2 普鲁兰酶的最适作用pH值在恒定反应温度条件下，测定不同pH值对酶活性的影响［2，5－6］.不同pH值试验管平行3份，取其平均OD540nm值，查葡萄糖标准曲线，计算酶相对活性，以活性最高者为100%.1.2.3 普鲁兰酶的热稳定性将酶液分别在50、60、70、80℃恒温水浴箱中保温，间隔10、20、30、40、50、60、70、80、90min分别取样，在50℃和pH 6.0条件下参照上述方法测定残存酶活力，以未保温酶液活力为100%［3，7］.1.2.4 普鲁兰酶的酸稳定性将酶与不同pH值3.6、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲液混合（缓冲体系为0.2mol／L醋酸缓冲液和0.2mol／L磷酸缓冲液），50℃保温，在1h和24h分别取样［3，8］，于在50℃和pH 6.0条件下参照上述方法测定残存酶活力，以pH 6.0保温1h酶液活力为100%.1.2.5 金属离子对普鲁兰酶活性的影响在酶反应系统中分别添加终浓度为10mmol／L的Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋、Cu2＋，以去离子水代替缓冲液［1，9－10］（避免金属离子与缓冲液相互作用），于50℃和pH 6.0条件下参照上述方法测定酶活性，以不添加金属离子的反应体系酶活性为100%.1.2.6 普鲁兰酶动力学参数的测定在确定普鲁兰酶作用的最适温度和最适pH的基础上，取8支试管，依次加入浓度为0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24μmol／L普鲁兰糖溶液1.0mL和最适pH缓冲液1.0mL，最适温度预热5min，再各加1.0mL普鲁兰酶液（各管的底物终浓度依次为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08μmol／L），反应5min.空白管为对应的不同浓度的底物1.0mL＋缓冲液1.0mL＋蒸馏水1.0mL，同时最适温度下进行反应［11］.沸水浴终止反应后，参照上述方法测定还原糖量，计算不同底物浓度时的初速度（葡萄糖μmol／min），用双倒数作图法求出酶的Km值.2.1 酶的最适作用温度和pH值以最高酶活性为100%，计算各温度条件下酶的相对活性.以酶相对活性为纵坐标，温度为横坐标，绘制出的温度-酶相对活性曲线见图1.从图中可以看出，该酶在50～65℃范围内均有较强活性，最适温度为60℃.以最高酶活性为100%，计算不同pH条件下酶的相对活性，绘制出的pH值-酶相对活性曲线见图2.该普鲁兰酶在酸性pH值范围内具有较强活性，最适作用pH 值为5.6.2.2 酶的热稳定性将酶液分别在50、60、70、80℃恒温水浴箱中保温，间隔10、20、30、40、50、60、70、80、90min分别取样测定酶活性，未经热处理的酶活性为100%，计算酶相对活性，结果见图3.该普鲁兰酶具有较好的热稳定性，50℃处理90min，仍保持酶活在90%以上，60℃处理90min，残存酶活在70%以上，但在70℃和80℃酶的半衰期分别小于60min和10min.2.3 酶的酸稳定性将酶液分别与等体积pH3.6、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0缓冲液混合，50℃恒温水浴锅中保温，在1h和24h分别测定残存酶活力，以pH 6.0保温1h酶液活力为100%，计算酶的相对活性，结果见表1.在pH 4.5～6.0的范围内酶具有较好的稳定好，在此范围内50℃保温24h与pH 6.0保温1h相比，酶仍残存75%以上的活性.2.4 金属离子对酶活性的影响在酶反应系统中分别添加终浓度为10mmol／L的Na＋、Ca2＋、Mg2＋、Zn2＋、Mn2＋、Cu2＋，于50℃和pH 6.0条件下测定酶相对活性，以不添加金属离子酶活性为100%，计算酶的相对活性，结果见表2.Mn2＋、Mg2＋和Ca2＋对普鲁兰酶有激活作用，其中以Mn2＋的激活作用最强；Cu2＋和Zn2＋对普鲁兰酶有抑制作用；Na＋对普鲁兰酶的作用不明显.2.5 酶的Km值和Vmax值在普鲁兰酶作用最适温度（60℃）和最适pH值（pH 5.6）条件下，以反应体系中底物（普鲁兰糖）终浓度为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08μmol／L，测定酶促反应的初速度（葡萄糖μmol／min），绘制v-［S］动力学曲线图，并用双倒数作图（图5）法求出酶的Km值和Vmax值.由图4可以看出，普鲁兰酶催化反应的初速度与底物浓度呈典型的双曲线关系，说明该酶催化普鲁兰糖的反应遵循米氏方程.根据双倒数图的y＝0.001 8x＋0.049 6，即1／v＝0.0018.1／［S］＋0.049 6，得知1／Vmax＝0.049 6，Km／Vmax＝0.001 8，故酶的最大速度Vmax＝20.16μmol／min，Km＝0.036μmol／L.普鲁兰酶主要用于食品工业生产中，将α-淀粉酶、β-淀粉酶所不能水解的支链淀粉彻底水解，提高淀粉的转化率，这不仅要求酶活性要强，而且作用的最适温度相对较高，最适pH相对较低，酸热稳定性要好.从嗜热脂肪芽孢杆菌中分离纯化的普鲁兰酶经测定，最适作用温度为60℃，与文献报道的嗜酸性普鲁兰糖芽孢杆菌普鲁兰酶（Promozyme）的最适温度相同［12－13］，而低于WQBG2-3普鲁兰酶的最适温度（75℃）［14］，但热稳定性好，60℃处理90min，残存酶活在70%以上，70℃的半衰期大于50min.而市场上销售的Promozyme在60℃下60min仅有20%的原酶活力［15］.嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶作用的最适pH 5.6，高于Promozyme的最适pH 4.5，而与WQBG2-3普鲁兰酶的最适pH 5.5相近，但酸稳定性较好，在pH 4.5～6.0的范围50℃保温24h仍具有较高活性.这表明嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶能够耐受酸热.嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶催化普鲁兰糖反应的初速度与底物浓度呈典型的双曲线关系，说明该酶是典型的米氏动力学酶.本试验测定出其Km为0.036μmol／L （Vmax为20.16μmol／min），与WQBG2-3普鲁兰酶相近（0.035），而小于其他一些普鲁兰酶［16］.这表明，嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶和WQBG2-3普鲁兰酶与底物（普鲁兰糖）的亲合力及活性相当，均优于其他一些普鲁兰酶.Mn2＋、Mg2＋和Ca2＋对嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶有激活作用，其中以Mn2＋的激活作用最强，而Cu2＋和Zn2＋对普鲁兰酶有抑制作用.这与文献报道的普鲁兰酶的特性是一致的［14－15］.因此，嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶是高温酸性酶，对底物有较强亲合力和催化活性，针对食品工作中淀粉糖化的生产条件，以及要采用各种不同的灭菌条件和防止杂菌污染，具有较好应用前景.【相关文献】［1］马晓军，张晓君，王锐，等.碱性普鲁兰酶产生菌选育和发酵条件的研究［J］，西北植物学报，2002，22（4）：883-888［2］唐宝英.耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选及发酵条件的研究［J］.微生物学通报，2001，28（1）：39-43［3］杜先锋，薛正莲.普鲁兰酶的纯化及其性质［J］.安徽机电学院学报，1999，14（1）：6-30 ［4］唐兵，周林峰，陈向东.嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质［J］.微生物学报，2000，40（2）：188-192［5］ Plant A R，Morgan H W，Daniel R M.A highly stable pullulanase fromThermusaquaticusYT-1［J］.Enzyme Microb Techno1，1986，8：668-720［6］陈金全.产耐酸耐热普鲁兰酶菌株的筛选鉴定及其酶学性质初探［D］.昆明：云南师范大学，2005［7］夏子芳，王正祥.Thermotogamaritima普鲁兰酶的基因克隆与酶学性质研究［J］.食品与发酵工业，2007，33（14）：19-22［8］刘维全.动物生物化学实验指导［M］.北京：中国农业出版社，2008［9］周瑞芳，英恒龙，彭风鼎.稻米中普鲁兰酶的纯化与性质的研究［J］.中国粮油学报，1994，9（1）：11-15［10］孙国政，甘伯中，艾对元.牦牛乳酥油源白地霉S122产脂肪酶培养基的优化［J］.甘肃农业大学学报，2013，48（1）：135-139［11］ Kunamneni，Singh S A.Improved high thermal stability of pullulanase from a newly isolated thermophilicBacillussp.AN-7［J］.EnzMicrobial Technol，2006，39：1399-1404［12］程池.普鲁兰酶Promozyme 200L及其生产菌种［J］.食品与发酵工业，1992（6）：72-76［13］陆健，金冲，顾国贤.普鲁兰酶及其生产菌种［J］.酿酒，1998（5）：1-6［14］唐嘉.云南温泉亚栖热菌产耐热普鲁兰酶的研究［D］.昆明：昆明理工大学，2007 ［15］沃尔夫冈.埃拉.工业酶的制备与应用［M］.2版.杨胜利，译.北京：化学工业出版社，2006 ［16］ Yuzuru Suzuki，Masaharu Chishiro.Production of extracellular thermostable pullulance by an amylolytic obligately thermophilic soil bacterium［J］.European J Appl Microbiol Biotechnol，1983，17：24-29。

嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质

嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶的产生条件及酶学性质
唐兵;周林峰;陈向东;戴玄;彭珍荣
【期刊名称】《微生物学报》
【年(卷),期】2000(040)002
【摘要】对嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilis)WF146的产蛋白酶的条件进行了研究,在58℃条件下,WF146在pH值为7.5的Fd培养基中振荡发酵培养48h后,发酵液中高温蛋白酶产量可达600u/mL以上.对该酶性质的研究表明,酶分子量为34kD,最适作用pH为8.0,最适作用温度为80℃,具有良好的pH稳定性及热稳定性.Ca2+对该酶的稳定性具有重要影响,PMSF、DFP及IAA能强烈抑制酶活力,而DTT对该蛋白酶活力无影响.
【总页数】5页(P188-192)
【作者】唐兵;周林峰;陈向东;戴玄;彭珍荣
【作者单位】武汉大学生命科学学院,武汉,430072;武汉大学生命科学学院,武汉,430072;武汉大学生命科学学院,武汉,430072;四川涪陵师范学院生物系;武汉大学生命科学学院,武汉,430072
【正文语种】中文
【中图分类】Q936
【相关文献】
1.嗜热脂肪芽孢杆菌普鲁兰酶酶学性质研究 [J], 赵淑琴;杨孝朴;刘霞;杨学山
2.嗜热脂肪芽孢杆菌木聚糖酶A的H297F定点突变、表达及酶学性质变化 [J],
李婵娟;石慧;王曼玥;王婧
3.表面活性剂对嗜热脂肪芽孢杆菌产高温蛋白酶的影响 [J], 刘军;陈向东;戴玄;唐兵;彭珍荣
4.嗜热脂肪地芽孢杆菌NAD激酶克隆表达及酶学性质研究 [J], 侯堃;李红梅;侯立琪
5.嗜热脂肪芽孢杆菌高温蛋白酶分解毛发角蛋白的研究 [J], 刘军;陈向东;戴玄;唐兵;彭珍荣
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高温芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵条件及酶性质研究

高温芽孢杆菌碱性蛋白酶发酵条件及酶性质研究舒丹;李宏;严建华;陈金瑞;李晖;刘成君【期刊名称】《四川大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2004(041)004【摘要】从西藏尼木卡如林温泉附近土样中分离到一个碱性蛋白酶产生菌株SD-142.该菌株经初步鉴定为芽孢杆菌.在50℃条件下,以10%的接种量接种于发酵培养基中振荡培养48h后,发酵液中碱性蛋白酶活可达516U/mL.发酵培养基的组成成分为麦芽糖6%、豆饼粉3%、麸皮3%、Na2HPO4 0.4%、MgSO4 0.02%、CaCl2 0.02%,pH自然.对该酶的性质研究表明,其最适作用pH为9.5,最适反应温度为60℃,具有良好的pH稳定性和热稳定性,并且显示了与去污剂良好的相容性.【总页数】5页(P856-860)【作者】舒丹;李宏;严建华;陈金瑞;李晖;刘成君【作者单位】四川大学生命科学学院,成都,610064;四川大学生命科学学院,成都,610064;四川大学生命科学学院,成都,610064;西藏自治区高原生物研究所,拉萨,850001;西藏自治区高原生物研究所,拉萨,850001;四川大学生命科学学院,成都,610064【正文语种】中文【中图分类】Q814【相关文献】1.耐高温α-淀粉酶产生菌的分离鉴定及发酵条件与酶性质研究 [J], 张强;刘成君;蒋芳;李晖;陈金瑞2.高温碱性蛋白酶菌株的选育及酶性质研究 [J], 李宏;刘成君;王兰3.嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究 [J], 苑琳;戚薇;路福平;杜连祥4.嗜碱性芽孢杆菌产高碱碱性蛋白酶发酵培养基及发酵条件的研究 [J], 苑琳5.嗜碱性芽孢杆菌碱性蛋白酶的研究——Ⅰ.菌种分离、筛选及发酵条件的研究 [J], 邱秀宝;程秀兰;袁影因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂变色原理

嗜热脂肪芽孢杆菌生物指示剂变色原理1. 嗜热脂肪芽孢杆菌的基本概念在咱们聊这玩意儿之前，得先来个开门见山的介绍。

嗜热脂肪芽孢杆菌，听起来就像个高大上的名字，其实它就像那种总是爱在你身边的朋友，虽然不起眼，却能在关键时刻帮你一把。

这种菌儿可不是普通的细菌，它们特别耐热，能在高温下安然无恙地生存。

就好比在火锅里浸泡的豆腐，虽然被煮得咕噜咕噜的，但它还是屹立不倒。

它们常被用作生物指示剂，主要是帮助咱们检测消毒过程是否彻底，尤其是在高温高压的灭菌环境中。

1.1 嗜热脂肪芽孢杆菌的特性说到嗜热脂肪芽孢杆菌，它们可真是个小能手，耐热性一流，能在121℃的高温下存活，这可不是随便什么细菌都能做到的。

想象一下，咱们在锅里煮东西，往往要调好火候，确保食物熟透。

可是，这小家伙偏偏能在火焰中如鱼得水，真是“火中取栗”的典型代表！这就让它成为了灭菌过程的“守护神”，帮助检测那些细菌杀不死的地方。

1.2 生物指示剂的作用提到生物指示剂，很多人可能会想，这到底是个什么神奇的东西？其实，它就是用来验证消毒或灭菌是否成功的一种工具。

就好比咱们用牙签戳蛋糕，戳出来没粘东西就说明熟了，戳出来粘乎乎的就得再烤一会儿。

而这嗜热脂肪芽孢杆菌就是这个“牙签”，通过观察它的变色来判断灭菌是否到位。

简单点说，它的变色就像是在给你发信号，“嘿，灭菌成功了，咱们可以放心用了！”2. 变色原理揭秘接下来，让我们揭开这神秘的变色原理吧。

这就像是一场化学魔法秀，究竟是怎样的“魔法”让这些小家伙在高温中变得五光十色的呢？2.1 pH变化引发的变色嗜热脂肪芽孢杆菌在高温下发酵时，会产生一些代谢产物，尤其是酸性物质。

这些酸性物质一旦进入培养基，就会导致培养基的pH值发生变化。

大家都知道，pH值就像是食物的酸甜口感，变化了自然就会影响颜色。

就像调料多了，菜的味道瞬间变了样，变得酸酸甜甜，特别美味。

而在我们的灭菌过程中，若pH值变了，培养基的颜色也会跟着变化。

这一变化就像是在向你招手，“灭菌成功，大家可以吃好料了！”2.2 颜色变化的信号说到颜色变化，真是让人兴奋。

一株嗜热地衣芽孢杆菌及其产高温淀粉酶的初步研究

一株嗜热地衣芽孢杆菌及其产高温淀粉酶的初步研究李秋鹏;季秀玲;林连兵;魏云林【期刊名称】《工业微生物》【年(卷),期】2010(0)3【摘要】从云南腾冲热海热泉中分离到23株产高温淀粉酶的菌株,选取酶活最高的一株菌株进行生长特征、16S rRNA基因测序及系统进化分析表明,该菌株为嗜热的地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis),并命名为B.1icheniformis Tamy6.该菌株生长范围为37～70 ℃,最适生长温度为55 ℃.对该菌所产高温淀粉酶的性质研究表明:该酶在70 ℃具有最高催化效率,在98 ℃保温30 min,仍有45%的活力,其最适反应pH为5.0.通过Native-PAGE酶谱分析表明菌株Tamy6的粗酶液中含有一种类型的淀粉酶.通过TLC分析水解淀粉产物表明,其产物主要为葡萄糖、麦芽糖及3～5个葡萄糖基的寡糖,说明菌株Tamy6所产淀粉酶为高温α-淀粉酶.【总页数】5页(P34-38)【作者】李秋鹏;季秀玲;林连兵;魏云林【作者单位】昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明,650224;昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明,650224;昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明,650224;昆明理工大学生物工程技术研究中心,昆明,650224【正文语种】中文【相关文献】1.一株产α-淀粉酶嗜热菌的分离鉴定及其产酶条件的优化 [J], 吕美云;刘紫英;耿丽媛2.一株新型产淀粉酶中度嗜热菌的分离鉴定及酶学性质研究 [J], 王治宾;薛蓓;杜丽琴;庞宗文;黄日波;韦宇拓3.一株产α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌的分离和筛选 [J], 蒋若天;宋航;陈松;蒲宗耀;刘成君;卢涛4.一株α-高温淀粉酶的地衣芽孢杆菌产酶培养基的优化 [J], 蒋若天;卢涛;宋航;张楠;陈松5.浓香型酒醅中一株耐热地衣芽孢杆菌产淀粉酶和蛋白酶培养条件的优化 [J], 杨磊;陈良因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

嗜热菌高温下存活的原因

嗜热菌高温下存活的原因嗜热菌为什么在高温下仍然能够不失活性并进行正常生长呢？目前的研究工作认为有如下几方面的原因：（1）类脂的敏感作用嗜热菌细胞质膜的化学成分，随环境温度的升高不仅类脂总含量增加，而且细胞中的高熔点饱和脂肪酸也增加，即长链饱和脂肪酸增加，不饱和脂肪酸减少。

脂肪酸熔点的高低和热稳定性呈如下顺序：直链饱和脂肪酸＞带支链饱和脂肪酸＞不饱和脂肪酸。

另外，饱和脂肪酸比不饱和脂肪酸能形成更多的疏水键，从而进一步增加膜的稳定性。

众所周知，细胞膜由双层类脂构成，但古细菌中嗜热菌其双层类脂进行了共价交联，成为两面都是水基的单层脂（如图①所示），并且保持了完整的疏水层，这种结沟，极大地增强了其耐热性。

（2）重要代谢产物的迅速再合成嗜热菌中tRNA的周转率大于中温菌的周转率；并且，其DNA中的G－C含量高于中温菌的G－C含量。

一般中温菌的G－C含量为44.9mol％，而嗜热芽饱杆菌DNA中的G－C含量为53.2mol％。

G －C含量越高，DNA分子的解链温度也越高。

嗜热菌在高温下不但热稳定性高，而且代谢快，其速率等于或大于热不稳定代谢物的转化，因此，重要代谢产物能够迅速再合成。

（3）蛋白质的热稳定性目前科学家已从嗜热菌中分离出多种蛋白质，其中包括许多重要的酶类，它们的热稳定性高于中温型细菌的类似蛋白，而且，在细胞内生活状况下二这种差别更加明显。

也就是说嗜热菌蛋白质的热稳定性取决于两个方面：一方面，其蛋白质的天然结构更加稳定；另一方面，嗜热菌细胞内存在着促进热稳定性的因素。

买验证明，蛋白质一级结构中个别氨基酸的改变，就可导致其热稳定性的改变。

嗜热菌蛋白质天然结构的稳定性，可能就是由于其中个别氨基酸的细微改变而引起的，至于究竟有哪些改变，还有待科学家的进一步研究。

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