中期考核-聚磷菌的分离鉴定及其聚磷特性的研究

聚磷菌介绍
聚磷菌：是活性污泥工艺中的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超量地 将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过细菌体内含磷量的数倍.
当聚磷菌生活在营养丰富的环境中，在将进入对数生长期时，为大 量分裂作准备，细胞能从废水中大量摄取溶解态的正磷酸盐，在细胞内 合成多聚磷酸盐，并加以积累，供下阶段对数生长时期合成核酸所需的 磷元素。
参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》。 采用试剂盒法提取总DNA。 16S rDNA的通用引物： 27F（5’-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3’）
1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’） PCR反应体系（25μ l）：模板2μ l， 引物1492R 0.5μ l，引物27F 0.5μ l 2*Taq酶混合液（包含Mg2+) 12.5μ l 补无菌水到25μ l。 扩增程序：94℃预变性10min；然后94℃变性40s，55℃复性 30s，72℃ 延伸90s进行30个循环；最后于72℃ 延伸10min。 采用琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用PCR纯化试剂盒（上海博彩生物科技有限公 司），将PCR纯化产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序进行检 测。最后根据所得的16S rDNA 基因核苷酸序列，输入GenBank 数据库，进行 Blast比对，获取16S rDNA基因序列相似度高的菌种。
（1）当培养基含磷量为20mg/L时，三株菌的除磷 率都达到大约80%，X-24还超过90%。 （2）但是当环境中的磷浓度逐渐增加时，聚磷效 果明显降低，这由细菌体内最多含磷量多少（摄 磷率）决定。
聚磷特性研究
（1） MA-2,MA-5在8-16h是对数生长期、比X-24较早进入生 长期，但是也相对的较早进入衰亡期。 （2）MA-2,MA-5的稳定期较长，X-24很快出现细胞衰亡的情 况。 （3）X-24生长较慢，进入对数期要12h才达到稳定期。 （4）随着菌体生长，培养基中磷含量下降，菌体中的磷含量 增加，开始除磷。 （5）当细菌进入衰亡期，由于细胞失活聚磷效果明显下降。
16S rDNA电泳图和系统发育数
↑↑ ↑↑
↑↑
MA-2 红细菌属
X-24
MA-5 MA-2
MA-5 微杆菌属
X-24 节杆菌属
聚磷培养条件优化
种子液：经过试管培养24h，分别对对培养温度、培养时间、起始pH、 碳源、氮源、接种量进行优化，通过正交试验获得最佳培养的条件。
1%-8%接种量接到 装有100mL加磷的 LB液体培养基（平行 三个）,然后放到37 度下静置培养24h,测 定OD600。
聚磷菌的分离鉴定及其聚磷特性的研究
汇报人： 导 师： 企业导师： 研究方向:
主要内容
（1）污水处理研究背景 （2）课题研究意义 （3）生物除磷机理 （4）聚磷菌的分离纯化筛选 （5）影响因素及条件优化 （6）菌种的聚磷特性 （7）全基因组测序及其聚磷基因研究 （8）展望
氮、磷、钾等元素排 入到地表水体，使藻类等 水生生物大量地生长繁殖， 水体中有机物积蓄，破坏 水生生态平衡的过程，造 成水体富营养化。
பைடு நூலகம்
PAM-TBO培养基褪色法
PAM-TBO培养基褪色原理:
甲苯胺蓝带正电荷，异染粒带负 电荷，亲和结合。
利用甲苯胺蓝颜色易观察，且吸 附后颜色变化明显。细菌体内多 聚磷酸盐被染色，离心后，颜色 变淡。
菌名 空白 WS-6 WS-16 WS-16-2 HS-2 HS-5 HS-12
染色率 0
0.425 0.457 0.553 0.538 0.75 0.693
（4）在线比对 构建进化树
展望
（1） 通过科学的、有效的培养、筛选方法得到高效聚磷菌对 污水处理起到更显著的效果。
（2）今后对聚磷菌的分离与筛选研究中，要适当地对培养方法 进行改进和改良。
（3）探讨对环境样品中微生物的有效分离方法，使分离微生物 的覆盖面更广。
（4）更深层次的研究聚磷菌的聚磷机理，对聚磷菌的除磷效率 有清晰的把握。
MA-5
杆状 圆形 平滑 湿润 凸起 白色 5% 运动
生理生化鉴定
菌种 试验 革兰染色 氧化酶试验 接触酶试验 甲基红试验 反硝化试验 柠檬酸试验
明胶液化试验
X-24
＋ － ＋ ＋ － － ＋
淀粉水解试验
－
MA-2 － ＋ ＋ ＋ － ＋ ＋
－
MA-5 － － ＋ ＋ － ＋ －
＋
生理生化特性鉴定-16SrDNA
若环境中的磷源仍有剩余时，仍能从外界吸收磷元素，这种对磷的 积累作用大大超过微生物正常生长所需的磷量，可达细胞重量的6％-8 ％。以多聚磷酸盐的形式积累于细胞内作为贮存物质。
生物除磷—聚磷菌除磷机理
聚磷菌的放磷（厌氧）
聚磷菌细胞原生质 内的Poly-P分解
废水中
水
解
Q ＋ ATP
水中易降解的有机物
菌株聚磷能力的比较
03
将菌体在缺磷培养液培养，将离心过的湿菌体悬浮于
富磷培养基培养，比较各菌株的聚磷能力 。
聚磷特性研究
OD700
0.6
吸 光
0.5
度 0.4
值
0.3
聚磷标准曲线
y = 0.43517x + 0.00542 R2 = 0.99973
0.2
0.1
0
0
0.5
1
1.5
磷浓度 ug/ml
聚磷特性研究
种子液培养24h,按照获得最佳接种量接种，接到装100ml
含磷LB液体培养基（平行三个）,然后放到28度下静置培养，
分别测下培养时间分别每隔4h测量对应菌的OD600，并绘制生
长曲线和随时间变化培养液pH值的变化、PO4-3-P量。
02
菌体含磷量的测定
测菌体干重并将湿菌体溶解于无菌水中，过硫酸 钾消解，测菌体总磷。（依据国标法检测）
（如脂肪酸）
合成
正磷酸盐
（类脂粒PHB、糖原） 等贮能物质
生物除磷—聚磷菌除磷机理
聚磷菌过量吸磷（好氧）
细胞内的（聚β -羟基 丁酸）PHB分解
废水中
Q
正磷酸盐
摄取
ATP+多聚磷酸盐Poly-P 储存在细胞内
生物法除磷的原 理是细菌交替地 处于厌氧与好氧 条件下，好氧时 吸收的磷大大的 超过了厌氧时释 放的磷，将剩余 污泥排出系统， 达到除磷的目的。
不同初始pH下菌体的生长情况
MA-2 MA-5
1.5
X-24
吸 光
1
度
值 0.5
0 3 4 5 6 7 8 9 10 11
发酵液初始pH值
OD600
吸 光 度
不同温度值
培养温度
OD600
吸
吸
光
光
度 值
度
OD600
OD600
转速r
Nacl浓度
菌种的聚磷特性
菌种生长曲线、培养基中PO4-3-P含量
01
污废水样本采集
（1）淮安第二污水处理厂沉淀池活性污泥 （2）黄海海边化工厂旁的沙泥
聚磷菌的筛选
YG培养基
污水样品
PAM-TBO培 养基培养
细菌贮存PolyP能力
染色 率试 验
聚磷 率试
验
稀释 涂布
分离纯化
筛选出20+16 株菌株
类脂粒（PHB） 异染粒（Poly-P）染色
复筛
驯化培养
生理生化 鉴定
接种量
培养基 起始pH
最适接种量、发酵时间， 培养温度在不同PH值下 进行培养24h，然后分 别测定所对应菌的 OD60。
最适接种量和最适的 发酵时间，不同温度 下进行培养分别测定 OD600。
发酵温 度
碳源
氮源
分别接入不同C/N条 件下培养，然后分别 测定所对应菌的 OD600。
聚磷培养条件优化
聚磷菌全基因组测序及其聚磷 基因比对研究
（1） 全基因组测序
上海生物生工有限公司
(2 ）聚磷 相关 功能 基 因序列的比对分析
通 过 primer5.0 、 DNAMAN、SPDBViewer 等生物信息学软件完 成基因序列及结构分 析
（3）聚磷关键基因 的序列及结构分析 通过SOPMA对序列的 二级结构进行分析
水体富营养化已经成 为世界性的环境污染问题。
矿化作用 同化作用
污水固处氮作理用研究背景
（蓝藻补充自身氮量）
物理除磷
电解法、结晶
法吸附法（粒状复
合铁铝除磷吸附剂）
化学除磷 生物除磷
化学沉淀法（混
凝剂作用下，磷酸根和某 些阳离子(如Fe2+,Fe3+和 Al3+)进行化学反应,生成不 溶于水的沉淀）
?
课题研究意义
聚磷率 0
0.341 0.374 0.432 0.506 0.775 0.685
表1 初始聚磷率和染色率
生理生化鉴定
观察菌落的形态 、形状、大小、颜色、干湿、边缘、光泽和透明度、 菌落高度、褶皱 、质地和培养基的颜色等。革兰氏染色、芽孢观察和运动 性观察
生理生化特性鉴定：
过氧化氢酶实验：鉴别大多产生过氧化氢酶的好氧和兼性厌氧菌。含有过氧化氢酶的
聚磷特性研 究
聚磷最佳 条件优化
全基因组 测序及其 聚磷基因
研究
初筛-染色与褪色实验
（1） 染色实验
类脂粒PHB（聚β -羟基丁酸）染色
苏丹黑对脂类溶解度高，类 脂粒易染色，便于观察。 番红复染，细菌底色淡红色。
异染粒-多聚磷酸盐（Poly-P）染色
异染粒是以无机偏磷酸盐聚合物 为主要成分的一种无机磷的贮备物。 异染颗粒嗜碱性或嗜中性较强,用蓝色 染料 ( 如甲苯胺蓝或甲烯蓝 ) 染色后 不呈蓝色而呈紫红色,故称异染颗粒。 孔雀绿复染，易染颗粒呈蓝黑色，菌 体呈绿色或浅绿色
细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。
淀粉水解实验：检测细菌能否产生淀粉酶和利用淀粉的能力；
（有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶.淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和 葡萄糖,淀粉水解后遇碘不再变蓝色。）
V-P试验、甲基红实验：糖发酵后形成丙酮酸后的不同代谢途径；
硝酸盐试验：鉴别返硝化细菌；
（5）研究多聚磷酸盐，了解其理化性质，并对其进行初步的分 离纯化，可以从分子方面对聚磷菌进行认知。
（6）人工构建的工程菌仍然存在质粒容易丢失、关键酶蛋白易 形成包涵体、聚磷效果不够稳定、对生长环境适应力较差等问 题。所以，提高聚磷工程菌的稳定性也是生物除磷的一个重要 研究方向。
谢谢！
明胶液化：细菌把明胶分解成液状的现象，明胶是在热水中溶解胶原而成的蛋白质，可
由产生于体外的蛋白酶进行分解的；
糖发酵、柠檬酸、氧化酶试验等。
生理生化鉴定
菌体形态
菌体形状 菌落形状 褶皱度 湿润度 凸起程度
颜色 耐盐度 运动形态
X-24
杆状 圆形 平滑 湿润 凸起 黄色 5% 运动
MA-2
球状 圆形 平滑 湿润 凸起 乳黄色 10% 运动