中期考核-聚磷菌的分离鉴定及其聚磷特性的研究

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两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究2009

收稿日期:2008-9-19;修回日期:2008-10-17作者简介:傅宏兵(1970-),男,硕士研究生,专业方向为环境微生物技术;通讯作者:吴　涓(1969-),女,博士,副教授,研究方向为水污染控制及环境生物技术,E 2mail:wujuan@ustc .edu 。

基金项目:安徽省自然科学基金项目资助(070413132)doi ∶10.3969/j 1issn 11008-9632.20091061023两株高效聚磷菌的筛选及其聚磷特性的研究傅宏兵,吴　涓(安徽大学生命科学学院,合肥230039)摘　要:采用梯度驯化及平板分离技术,从巢湖底泥中筛选到两株高效聚磷菌,分别命名为P6与P8。

经过厌氧和好氧两个阶段的处理,两种菌株的聚磷率均达到80%以上。

实验结果表明,P8菌株在10℃～40℃以及pH 值4～11的较宽范围内都显示出稳定的聚磷效果,而P6菌株仅在30℃～35℃以及pH 值4～5的狭窄范围内达到较高的聚磷率。

不同碳氮源的影响实验表明,除了乳糖以外,P8菌株在所考察的多种碳氮源下都能表现出较高的聚磷率,当乙醇浓度为3.75g/L 时,聚磷率可达到92.9%;而P6菌株对碳氮源则有较严格的要求。

关键词:聚磷菌;筛选;生物量;聚磷率中图分类号:Q932335;X172文献标识码:A文章编号:1008-9632(2009)06-0023-04水体富营养化是全球普遍存在的严重环境问题,近些年来,随着工农业生产的高速发展和人们生活水平的不断提高,含磷的化肥、农药、洗涤剂的使用量不断上升。

水体中磷的含量日益增加。

虽然氮磷同为水体生物的重要营养物质,但是在所有的营养元素中,磷被认为是引起水体富营养化的最关键因素[1-3]。

然而,我国现有的污水处理厂主要集中于有机物的去除,对磷等营养物的去除率只达到10%～20%,其结果远达不到国家二级排放标准[4-5]。

因此,有效降低排放废水中的磷含量,已成为防治水体富营养化的重要途径之一。

聚磷菌AP7的筛选及除磷特性研究

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聚磷菌的筛选及除磷特Ｉ研究生
张敬任丽科学学院，四川南充６７０）５０２摘要：从城市污水处理厂好氧池活性污泥中分离获得一株高效聚磷茵Ａ７Ｐ，经形态特征和生理生化初步鉴定该株为恶
臭假单胞菌（ｓｕｏｏａｕｉ）实验表明，菌株Ａ７有典型的厌氧释磷和好氧吸磷的特征，除磷率为７．％。Ｐｅｄｍｎｓｐｔａ。ｄＰ具０１关键词：活性污泥；聚磷菌；鉴定；除磷性能
ＤＩ１．９９Ｊｓｎ１７ —６９．０．５Ｏ７Ｏ：５６／．ｓ．６１５６２１１．００ｉ１
ｌｏａｉｎａａｅｔｒａｉｎｏｏｐｏｕｃｓｌｔｎｄＣｈｒｃｅｉｔｏｆａＰｈｓｈｒｓｏＡｃｕｍｕｌｔｎＢａｔｒａａｉｃｅｉｏ７ｗｉｈＨｉｈＣａａｉｔｆｏｐｏｕｍｏａｔｇｐｂｌｙｏｉＰｈｓｈｒｓＲｅｖｌ
要的作用。但是大多数研究学者主要研究生物除磷工艺的改进和创新，而对聚磷菌聚磷机理研究进展比较缓慢。对
ＺＨＡＮＧｎ，ＲＮＬ．ｉｇＣｌｇｉＥｉｎ，ＨＥｉ．ｕｐＮＩｈａｎ（ｏｌｇｆｉｌｉａＳｉｎｅ．ｈｎ＿ｔｒｌｉｅｓｙＮａｃｏｇＳｃｕｎ６７０）ＣｌｅｏｏｏｉｌｃｃｓＣｉａｅｍａＵｎｖｒｉ，ｎｈｎ，ｉｈａ３０２ｅＢｃｅＷｓＮｏｔ

聚磷真菌的无机磷转化特性研究

聚磷真菌的无机磷转化特性研究磷是植物生长发育的必须营养元素之一,同时也是水体富营养化的关键性限制元素。

因此,磷的生物转化过程不仅是植物生产类专业研究的重点,同时也是环境保护污（废）水生物除磷及污（废）水中磷的回收利用和农业面源污染防控的研究重点。

聚磷菌（Phosphorus Accumulating Organisms,缩写PAOs）是指在好氧条件下能够“过量”吸收磷,在厌氧条件下又能释放磷的一类“特殊”微生物的统称,在生物分类学上分别隶属于细菌、放线菌和真菌。

该类微生物不仅广泛地分布在人工生态系统,如:不同地区、不同污水生物除磷处理工艺的污水处理系统中,而且也广泛地分布在水体、土壤等天然生态系统和植物的根际。

根据聚磷菌的定义及其生态分布,我们可以推测聚磷菌在不同生态系统磷的生物转化,尤其是厌氧与好氧的交替过程中,对环境中磷的溶解性和生物有效性会产生重要影响。

因此,探明聚磷菌在液相体系中对不同无机形态磷的利用能力和在固相体系（土壤）中磷的吸收、释放机制,对在理论上丰富和完善磷素生物地球化学循环过程,实践上不断提高污水处理系统生物除磷的稳定性和农田土壤磷的生物有效性都具有重要意义。

本研究以吉林农业大学微生物实验室分离获得的高效聚磷真菌Penicillium sp.18（缩写为Psp.18菌株）为供试菌株,对其在固、液两相体系中在钙磷、铝磷等无机磷的转化及其影响因素进行了初步研究,以期为深入了解和调控污水处理系统以及农田生态系统土壤中磷的溶解性和生物有效性提供理论和数据参考。

在液相体系的研究结果表明:1、聚磷真菌Psp.18在分别以磷酸钙（Ca3（PO4）2）、磷酸铝（AlPO4）、磷酸铁（FePO4）及磷矿粉四种无机磷为唯一磷源,在NBRIP液体培养基振荡培养7天,菌株Psp.18的菌丝鲜重随着培养时间的延长而增加,且随着培养时间的增加NBRIP培养基中有效磷含量呈增加趋势,pH值逐渐降低。

聚磷菌—JN459的分离和聚磷特性研究

聚磷菌一ＪＮ４５９的分离和聚磷特性研究
钟传青，姜天翼，王静，张春明
（山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南２５０１０１）摘要：聚磷菌ＰＡＯｓ（ｐｈｏｓｐｈａｔｅａｃｃｕｍｕｌａｔｉｏｎｏｒｇａｎｉｓｍｓ）的聚磷特性是生物除磷研究的重要内容。文章针对山东省济南市高新区污水处理厂活性污泥中分离的聚磷菌ＪＮ４５９，经生理生化特征研究及１６ＳｒＤＮＡ分析，将该菌株鉴定为Ｍｉｃｒｏｌｕｎａｔｕｓｐｈｏｓｐｈｏｖｏｒｕｓ，对纯培养条件下聚磷菌ＪＮ４５９菌株聚磷特性进行了序列间歇式反应器ＳＢＲ
ｂｉｏｃｈｅｍｉｃｌａｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓａｎｄ１６ＳｒＤＮＡａｎａｌｙｓｉｓ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＳＢＲｂａｔｃｈｅｘｐｅｉｒｍｅｎｔｓｏｎｐｈｏｓｐｈａｔｅ－
ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆＪＮ４５９ｓｔｒａｉｎｓｈｏｗｔｈａｔｐｈｏｓｐｈａｔｅ — ｒｅｍｏｖｉｎｇｒａｔｅｃａｎａｃｈｉｅｖｅ９３．７％ｉｎ
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＩｔｉｓｏｆｇｒｅａｔｉｍｐｏｒｔａｎｃｅｔｏｓｔｕｄｙｔｈｅｓｐｅｃｉｅｓｏｆＰＡＯｓ，ｔｈｅｉｒｐｈｏｓｐｈａｔｅ — ａｃｃｕｍｕｌａｔｉｎｇ

聚磷菌的快速富集及其除磷特性研究

ｗｉｉｎｉｉｉｌＨａｇｆ７５一．０，ｉｓｌｅｘｇｎ（ｔｎａｎｔｒｎｅｏ．Ｏ７８ｄｓｏｖｄｏｙｅＤ０）ｂｔｅ．－．／ｔ（００－．）℃ ．Ａｃｕｈａｐｅｗｅｎ２０４０ｍｇＬａ２．４０５＿ｃｍｕ
Ｃｌｅｅｏｖｒｎｎａｃｅｃｎｇｎｅｉｇ，ｏｇｉＵｎｖｒｉＳａｇａ００２；．ｚｏｎｔｕｔｎｏｌｇｆＥｎｉｏｍｅｔｌＳｉｎｅａｄＥｎｉｅｒｎＴｎｊｉｅｓｔｙ，ｈｎｈｉ２０９２ＨｕｈｕＣｏｓｒｃｉｏ
摘要在序批式活性污泥反应器（Ｂ中快速富集聚磷菌（ＡＯｓ，ＳＲ）Ｐ）考察ＰＡＯｓ中Ｃｎｉａｕｃｍｕｉａｔｒｐｏｐａｉ以ａｄｄｔｓｕｌｃｅｈｓｈｔｓ（Ａｃｂ
下简称Ａｃｕｌｂｃｅ）群的除磷特性。结果表明，水温（Ｏ００பைடு நூலகம்５ｃｍｕｉａｔｒ种在２． ± ．）℃下控制厌氧初始ｐ为７５～７８，氧段ＤＯ为２０Ｈ．Ｏ．Ｏ好．
Ｅｎｉｅｒｎａｉｕｅｖｓｏｔｔｎ，ｕｈｕＺｈｊａｇ３３０）ｇｎｅｉｇＱｕｌｔＳｐｒｉｉｎＳａｉＨｚｏｅｉｎ１００ｙｏ
ＡｂｔａｔＡｎｅｓｒｃ：ｗｒｐｄｎｒｃｅｍｅｈｏｐｏｙｏｓｈａｅｃｕｕｌｔｎｏｇｎｉｍｓ（ＰＡＯｓｉｓｑｕｎｃｎａｉｅｉｈｍｎｔｔｏｄｆ１ｐｈｐｔａｃｍａｉｇｒａｓ）ｎｅｅｉｇｂｔｈｒａｔ（ＢＲ）ｗａｎｔｏｄｕｅ．ＴｈｅｃｒｃｅｉｔｃｆＣａｎｄａｔｃｕｕｌｂｃｅｏｐｈａｉ（ｃｕｍｕｉａｃｅ）ａｃｅｃｏｒＳｓｉｒｃｄｈａａｔｒｓｉｓｏｄｉｕｓＡｃｍｉａｔｒｐｈｓｔｓＡｃｌｂｔｒｉｈｅｆｅｄｓｏｈｏｓｎｔｉｌｆｐｐｈｏｕｅｏｖｌｕｅｌｅｎｔｎｎｒｂｉ— ｅｏｂｃｃｎｄｉｉａｔｉｄＲｅｕｔｎｃｔｈ，ｒｓｒｍａｎｄｒａｔｒａｉｇａａｅｏｃａｒｉｏｔｏｎｓｗｓｓｕｄｅ．ｓｌｓｉｄｉａｅｔａｔ

高效聚磷菌的分离鉴定及除磷性能分析

第３２卷第５期
Ｖ０１．３２Ｎｏ．５
水
资
源
保
护
２０１６年９月
Ｓｅｐ．２０１６
ＷＡＴＥＲＲＥＳ０ＵＲＣＥＳＰＲＯＴＥＣＴＩＯＮ
ห้องสมุดไป่ตู้
ＤＯＩ：１０．３８８０／ｊ．ｉｓｓｎ．１００４— ６９３３．２０１６．０５．０１３
ｓｈｏｗｔｈａｔｔｈｅｆｏｕｒｓｔｒａｉｎｓｈａｄｈｉｇｈｃａｐａｂｉｌｉｔｉｅｓｏｆｒｅｍｏｖｉｎｇｐｈｏｓｐｈａｔｅｒｆｏｍｔｈｅｗａｓｔｅｗａｔｅｒ，ａｎｄｔｈｅｙｅｘｈｉｂｉｔｅｄｈｉｇｈｌｅｖｅｌｓｏｆｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｒｅｌｅａｓｅｉｎｔｈｅａｎａｅｒｏｂｉｃｓｔａｇｅａｎｄｐｈｏｓｐｈｏｕｓｒａｂｓｏｐｔｒｉｏｎｉｎｔｈｅｏｘｉｃｓｔａｇｅ．Ｐ１ｈａｄｔｈｅｍｏｓｔｓｉｇｎｉｉｆｃａｎｔｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓａｂｓｏｐｔｒｉｏｎａｎｄｒｅｌｅａｓｅｃｈａｒａｃｔｅｉｒｓｔｉｃｓ．ＴｈｅｍａｘｉｍｕｍｐｈｏｓｐｈｏｕｓｒｒｅｍｏｖｌａｒａｔｅｓｏｆＰ１，Ｐ２，Ｐ３，ａｎｄＰ４ｗｅｒｅ７５．５１％，８．７７％，４７．２６％，ａｎｄ３０．１９％，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｒｏｕｇｈｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓｏｆ１６ＳｒＤＮＡ，ｉｔｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｔｈａｔＰ１ａｎｄＰ２ｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏＭｉｃｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍａｎｄＢａｃｉｌｌｕｓ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ａｎｄｂｏｔｈＰ３ａｎｄ

反硝化聚磷菌培养驯化分离方法及菌种特性的研究的开题报告

反硝化聚磷菌培养驯化分离方法及菌种特性的研究的开题
报告
一、研究背景
反硝化聚磷菌是一类重要的微生物资源，能够在低氧环境下利用硝酸盐等氧气供体进行反硝化过程，并且还能够利用无机磷酸盐合成多聚磷酸盐。

多聚磷酸盐是生物体内最重要的无机磷存储形式之一，对于维持生态系统的稳定性和生物循环具有重要的生态学和微生物学意义。

然而，由于反硝化聚磷菌数量较少、分布范围广、分离困难等因素，反硝化聚磷菌的研究受到了很大的限制。

因此，开展反硝化聚磷菌的培养驯化分离研究具有重要的理论和应用价值。

二、研究内容及方法
本研究计划采取以下方法开展反硝化聚磷菌的培养驯化分离及菌种特性研究：
1.采集不同环境样品，如沉积物、底泥等，建立样品库。

2.采用适当的营养基，如混合碳源、氮源、硫源等营养基，培养反硝化聚磷菌。

利用微生物毒性试验等方法筛选出适宜反硝化聚磷菌生长的培养条件。

3.筛选培养出的反硝化聚磷菌，根据形态和生理特性确定其分类和物种。

4.对分离得到的反硝化聚磷菌的多聚磷酸盐合成能力进行实验室研究。

通过测定多聚磷酸盐合成速率、酶活力等参数，分析不同反硝化聚磷菌合成多聚磷酸盐的差异及影响因素。

5.利用PCR技术对分离得到的反硝化聚磷菌的多聚磷酸盐合成相关基因进行克隆和测序，分析多聚磷酸盐合成途径的分子机制。

三、研究意义
本研究的开展将深入探究反硝化聚磷菌的生态学和微生物学特性，对于完善反硝化过程的基础理论和促进生态环境保护具有重要的理论和应用价值。

同时，本研究也可为反硝化聚磷菌资源的开发利用提供技术支持和理论指导。

约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的分离及其聚磷特性的研究

约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)的分离及其聚磷特性的研究连丽丽;姜华;朱昌雄【摘要】采用定性、定量相结合的方法,从城市污水中筛选到一株高效聚磷菌(CH-1),经生理生化特征及16 rDNA序列分析,鉴定该菌株为不动杆菌属的约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii).进行了该菌株的生长曲线、含磷培养液的pH、磷酸盐浓度变化及去磷效果等测定.结果表明:该菌在培养6～8 h时繁殖量达到最大(0.54 mg/L),培养液pH值达到最高(8.88),而磷酸盐浓度降至最低(1.08 mg/L).好氧条件下,含磷培养液培养72h后,培养液中磷浓度由10 mg/L降至3.476 mg/L,去磷率高达65.24%.CH-1菌处理模拟废水的除磷率高达68.88%,具有较强的聚磷能力.【期刊名称】《辽宁农业科学》【年(卷),期】2009(000)002【总页数】4页(P18-21)【关键词】聚磷菌;筛选;聚磷特性【作者】连丽丽;姜华;朱昌雄【作者单位】辽宁师范大学生命科学学院,辽宁,大连,116029;辽宁师范大学生命科学学院,辽宁,大连,116029;中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所,北京,100081【正文语种】中文【中图分类】农业科学辽宁农业科学 2009(2)：18~21 LiaoningAgriculturalSciences文章编号：1002-1728( 2009) 02-0018-04约氏不动杆菌（ Acinetobacterjohnsonii ）的分离及其聚磷特性的研究连丽丽1 ，姜（1 ．辽宁师范大学生命科学学院，辽宁大连 116029 ；京 100081 ）华 1 ，朱昌雄2 2．中国农业科学院农业环境与可持续发展研究所，北摘要：采用定性、定量相结合的方法，从城市污水中筛选到一株高效聚磷菌 (CH-1) ，经生理生化特征及16rDNA 序列分析，鉴定该菌株为不动杆菌属的约氏不动杆菌（ Acinetobacterjohn,sonii ）。

高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析2009

第37卷第10期东　北　林　业　大　学　学　报Vol.37No.10 2009年10月JOURNAL OF NORT HE AST F ORESTRY UN I V ERSI TY Oct.2009高效聚磷菌的筛选及除磷特性分析李　博　赵　敏　李宝赫　刘哲君(东北林业大学,哈尔滨,150040) 摘　要　从运行稳定的S BR反应池好氧末端的活性污泥中分离筛选出1株高效聚磷菌LB4,结合生理生化特征分析和16S r DNA分子生物学技术,鉴定该聚磷菌为鲍曼不动杆菌(A cinetobacter baum annii);以E BPR工艺过程为载体,模拟将来可能采用的含可利用碳源的工业废水作为进水,探讨了不同营养条件下菌株LB4的除磷行为,初步分析了其代谢机理,研究表明:菌株LB4除磷的最佳温度为30℃、最适pH值为7.0,微量元素的有无对该菌株的除磷效能影响不大,提高生物除磷系统除磷效率的关键是提高厌氧释磷量。

关键词　聚磷菌;鉴定;除磷效能;基质代谢分类号　X703Screen i n g of Stra i n L B4w ith H i gh Capab ility of Accu m ul a ti n g Polyphospha te and Its Character isti cs/L i Bo,ZhaoM in,L i Baohe,L iu Zhejun(College of L ife Sciences,Northeast Forestry University,Harbin150040,P.R.China)//Journal of Northeast Forestry University.-2009,37(10).-85～87A strain LB4,with a high capability of accu mulating phos phate,was is olated fr om activated sludge of sequencingbatch react or.The strain was identified as A cinetobacter baum annii in ter m s of its mor phol ogical and physi ol ogical featuresby16S r DNA sequence analysis.The phos phate2accu mulating effects of strain LB4were studied with industrial waste waterunder different nutriti onal conditi ons according t o the enhanced bi ol ogical phos phorus re moval p r ocess,and the metabolicmechanis m of strain LB4was als o analyzed.The op ti m u m pH and temperature for accu mulating polyphos phate were7.0and30degrees C,res pectively.The effect of m icr oele ment on phos phate re moval rate was unobvi ous.The key t o increasethe phos phate re moval capacity is t o i m p r ove the efficiency of phos phorus up take in the bi ol ogical phos phorus re moval sys2te m during the anaer obic stage.Keywords　Polyphos phate2accu mulating organis m s;I dentificati on;Capability of phos phate re moval;Metabolic mechanis m 近年来,由于生物除磷具有低能耗、低成本、少污染和高效率等优点而逐渐成为治理水体磷污染、克服富营养化的研究热点。

1株高效聚磷节杆菌的分离鉴定及其聚磷特性研究

1株高效聚磷节杆菌的分离鉴定及其聚磷特性研究陈燕;杨小龙;曹郁生【摘要】[ Objective ] The aim was to reduce the content of phosphorus in water so as to control the water eutrophication, and select phosphorus accumulating bacteria for biological phosphorus removal. [ Method ] With the phosphorus accumulating capacity as the main index, the bacteria were isolated and selected, their culture conditions were optimized so as to improve their phosphorus accumulating capacity. Then the isolated high-efficient phosphorus accumulating bacteria were identified based on the biochemical characteristics and molecular biological analysis. [ Result ] Among the nine effective phosphorus accumulating bacteria isolated from sludge and sewage, J-12 showed the highest phosphorus accumulating capacity. 16S rDNA sequence analysis indicated that the homology of J-12 and Arthrobacter sp. reached 99％, taking into account its growth characteristics and physiological and chemical properties, it was preliminarily determined that J-12 belonged to one species of Arthrobacter sp. , the Arthrobacter sp. with high-efficient phosphorus accumulating capacity hasnt been reported. The study showed that, after 10 h of culture under 32 ℃, 7.0 of pH and 4 ml addition of trace element solution, J-12 could reduce the total phosphorus content in the synthetic water from 20. 0 mg/L to 0. 1 mg/L, its phosphorus accumulating rate could reach above 95％. [ Conclusion] The selected arthrobacter with high-efficient phosphorus accumulating capacity had potential applicationprospect in sewage treatment and aquaculture.%[目的]为降低水中磷含量以控制水体富营养化,从自然界筛选高活性的聚磷菌,用于生物除磷.[方法]以聚磷效果为主要指标,通过富集分离筛选细菌,并对其培养条件优化,提高其聚磷能力.根据生理生化反应特点以及分子生物学分析,对分离到的高效聚磷菌进行鉴定.[结果]从污水和污泥中分离到9株有效聚磷菌,其中菌株J-12的聚磷能力最强.16S rDNA序列分析显示,J-12与节杆菌属的同源性达99%,结合生长特性、生理生化特性,初步确定该菌株属于节杆菌属的一个种(Arthrobacter sp.),尚未见到具有高效聚磷作用的节杆菌的报道.研究表明,J-12在生长温度32 ℃,pH值7.0,微量元素液添加量为4 ml的条件下,培养10 h,可使合成废水中总磷由20.0 mg/L降至0.1 mg/L,聚磷率达95%以上.[结论]筛选到1株具有高效聚磷菌能力的节杆菌,在污水治理和水产养殖业中有着潜在的应用前景.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)001【总页数】4页(P447-450)【关键词】节杆菌;聚磷特性;同源分析;鉴定【作者】陈燕;杨小龙;曹郁生【作者单位】南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学中德联合研究院,江西南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学中德联合研究院,江西南昌,330047;南昌大学食品科学与技术国家重点实验室,南昌大学中德联合研究院,江西南昌,330047【正文语种】中文【中图分类】Q939水是人类生存不可或缺的物质。

一株聚磷菌的分离、鉴定及其除磷特性分析

基因组学与应用生物学,2020年，第39卷，第12期，第5625-5630页研宄报告Research Report一*株聚憐菌的分罔、鉴定及其除憐特性分析朱荣贵方春玉周健明红梅陈蒙恩姚霞邹月姜秀娟‘四川轻化工大学生物工程学院，自贡,643000*通信作者，******************摘要为了研究聚磷菌的分离、鉴定以及除磷特性，本研宄通过富集培养、分离培养、MOPS(10>〇培养、异染颗粒染色实验，并对CA SS反应器中的活性污泥进行了聚磷菌的初筛和除磷能力复筛，得到一株除磷能力较强的菌株P2。

结合形态学、生理生化试验和分子生物学鉴定试验对P2进行菌种鉴定以及行相关性能试验研究。

结果表明：分离所得的菌株P2是一株柠檬酸杆菌，其除磷率可达到85%;菌株P2的生长迟缓期为 0〜6h，对数生长期为6〜24 h;菌株P2高效除磷的最适p H值为7,温度30°C，时间12 h,微量元素浓度为 2 mL/L。

菌株P2稳定期持续时间长，适应环境能力较强，对于各种环境下废水中磷的去除有较好效果。

关键词聚磷菌，柠檬酸杆菌，除磷特性Analysis of The Isolation and Identification of a Phosphorus-accumulating Bacterium and Its Characteristic of Phosphorus RemovalZhu Ronggui Fang Chunyu Zhou Jian Ming Hongmei Chen Mengen Yao Xia Zou Yue Jiang Xiujuan* Biotechnology Engineering Dept, Sichuan University of Science & Engineering, Zigong, 643000*Correspondingauthor,******************DOI: 10.13417/j.gab.039.005625Abstract In order to study the separation,identification and phosphorus removal characteristics of phosphorus-accumulating,a bacterial strain P2 with strong phosphorus removal ability was obtained by accumulation culture, isolating culture,MOPS(lOx)culture,metachromatic granular dyeing experiment,and primary screening of phosphorus-accumulating and re-screening of phosphorus removal ability from activated sludge in CASS reactor.The bacteria type of P2 was identified and the related properties of P2 were tested by morphology,physiological and biochemistry test and molecular biology identity test.The results showed that the bacterial strain P2 obtained by separation was a Citrobacter with a phosphorus removal rate of85%. The growth lag phase of bacterial strain P2 was0〜6 h,and the logarithmic growth phase was6〜24 h.The optimum pH value for efficient phosphorus removal of bacterial strain P2 was7,the temperature was30 °C,the time was 12 h,and the concentration of trace elements was2 mL/L.Strain P2 has a long stable period and strong adaptability to the environment.It has a good effect on phosphorus removal from wastewater in various environments.Keywords Hosphorus-accumulating bacterium,C i t r o b a c t e r sp.,Characteristic of phosphorus removal磷为水体富营养化的诱发因子的概率高达67%磷量对预防水体富营养化尤为重要。

解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究

解磷菌的分离、筛选、鉴定及解磷能力研究作者：上官亦卿常帆吕睿齐凡贾凤安王艳丁浩来源：《湖北农业科学》2019年第01期摘要：为开发高效微生物解磷肥，利用解磷菌选择培养基（蒙吉娜卵磷脂培养基）从陕西省西安市周至县猕猴桃园农田土壤中分离出11株解磷菌，通过纯化培养，筛选出1株高效解磷菌JYP9。

利用16S rDNA基因序列分析方法对该菌株的分类信息进行鉴定，鉴定结果表明该菌株为假单胞菌（Pseudomonas extremorientalis）。

并用解磷圈法和液体摇瓶培养法，分别以卵磷脂为惟一磷源，确定了该菌株的最适培养温度为26 ℃、最适转速为200 r/min、最适起始pH为7和最适起始接种量为2%。

关键词：解磷菌;筛选;鉴定;最适条件中图分类号：S154.39; ; ; ; ;文献标识码：A文章编号：0439-8114（2019）01-0030-05DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2019.01.007; ; ; ; ; ;开放科学（资源服务）标识码（OSID）：Isolation，Screening，Identification and Phosphate Solubilizing Ability of Phosphate Solubilizing BacteriaSHANGGUAN Yi-qing1，2，CHANG Fan2，LYU Rui2，QI Fan1，JIA Feng-an2，WANG Yan2，DING Hao2（1.Shaanxi Academy of Sciences，Xi’an 710043，China;2.Microbial Metabolism Research Center，Shaanxi Province Institute of Microbiology，Xi’an 710043，China）Abstract： In order to develop an efficient microbial fertilizer solution， 11 strains from the farm-land soil of actinidia park in Zhouzhi county， Shaanxi prvince， were isolated， using phosphate volubility bacteria selective culture medium （Mongolia lecithin culture medium）. A strain of phosphate volubility bacteria JYP9 was screened through purification cultivar. And classification information of this strain was identified by using 16S rDNA gene sequence analysis，the results showed that the strain was a Pseudomonas extremorientalis. Then the phosphate solubilizing method and the liquid shake flask method were used in the experiment to confirm the optimum cultivation condition of JYP9 with lecithin as the only phosphorus source. The results showed that the optimal temperature was 26 ℃， optimal rotational was 200 r/min， optimal pH was 7， and optimum initial inoculation amount was 2%.Key words： phosphate solubilizing bacteria; screen; identify; optimum condition磷是植物生长所需的一种主要营养元素，但植物对土壤中的磷元素利用率很低，严重影响着植物的生长[1]。

一株聚磷菌GP44的筛选、鉴定及其聚磷特性研究

土壤(Soils), 2009, 41 (5): 757~763一株聚磷菌GP44的筛选、鉴定及其聚磷特性研究①赵海泉，胡子全（安徽农业大学生命科学学院，合肥 230036）摘要：采用纯培养结合蓝白斑筛选法从巢湖和南淝河底泥中分离筛选出能聚磷（P）的 11 株解 P 细菌，好氧培养时菌体吸 P 能力测定结果表明，GP44 的菌体含 P 量达到 11.92%，具有较高的聚 P 能力，对其初步鉴定为鉴定菌株 GP44 属肠杆菌科中的克雷伯氏菌属土生克雷伯氏菌（K.terrigena）。

GP44 在废水合成培养基上最佳聚 P 温度 30℃、初始 pH 为 7.5、最佳装液量为120 ml/250 ml 和最适 C 源是葡萄糖，Mg2+、K+ 和 Fe3+ 有利于菌株 GP44 的生物除P。

关键词：聚磷菌；筛选；鉴定；聚磷特性中图分类号： X172磷（P）是水体产生富营养化的主要营养物质，水体一旦富营养化，即使切断外界N、P 营养元素也难以自净恢复。

目前，国内外污水除P技术主要有物理法、化学法和生物法3类。

物理法除P效果较好，但其只适合处理流量较小，含P量较高的工业废水，成本又过高，技术复杂，因而无法得到普遍的应用[1]。

化学法对P的去除率较高，一般可达75% ~ 85%，处理效果稳定，污泥在处理和处置过程中不会重新释放P。

但是在化学方法处理过程中使用的化学试剂常会引起二次污染，且污泥产量大，远远不能满足现在大规模控P现实情况[2]。

生物法是利用微生物的生理活动实现除P，其处理效率高，运行成本较低，污泥产量较小，减少污泥膨化，对环境造成的副作用较小。

由于藻类除P和大型水生植物普遍应用也存在一定的困难，因此目前国内外的研究学者把目光集中在微生物除P的研究中。

但是大多数研究学者主要研究微生物的除P工艺的改进和创新，而对聚磷菌聚P机理研究进展比较缓慢。

对聚P机理研究的最大障碍是聚磷菌筛选的较少，分离纯化培养较为困难，而且筛选的聚磷菌稳定性较差，且纯化分离的菌种不能在聚P工艺中表现好氧聚P和厌氧释P的聚P特性[3]。

聚磷菌-JN459的分离和聚磷特性研究

聚磷菌-JN459的分离和聚磷特性研究钟传青;姜天翼;王静;张春明【摘要】聚磷菌PAOs（ phosphate accumulation organisms）的聚磷特性是生物除磷研究的重要内容。

文章针对山东省济南市高新区污水处理厂活性污泥中分离的聚磷菌JN459，经生理生化特征研究及16 S rDNA分析，将该菌株鉴定为Microlunatus phosphovorus，对纯培养条件下聚磷菌JN459菌株聚磷特性进行了序列间歇式反应器SBR （ sequencing batch reactor）批量试验研究。

结果表明：JN459菌株在人工合成污水体系中除磷率最高可达93.7%，在市政污水体系中除磷率明显降低，约为84.4%，两者缺氧初期没有明显的磷释放过程，随着缺氧时间延长，污水体系中溶解磷都小幅度上升，聚磷菌JN459菌株分解和转运多聚磷酸盐的相关酶系需要诱导并且表达水平较低。

%It is of great importance to study the species of PAOs,their phosphate-accumulating characteristics and roles in the biological phosphorus removal system. Phosphate-accumulating bacterium JN459 was isolated from activated sludge of sewage plant in new and high-tech zones of Jinan City. Microbial strain JN459 was identified as Microlunatus phosphovorus by its physiological and biochemical characteristics and 16 S rDNA analysis. Results of SBR batch experiments on phosphate-accumulating characteristics of JN459 strain show that phosphate-removing rate can achieve 93 . 7% in artificial wastewater system,while the phosphate-removing rate decreases obviously in municipal wastewater system,which can achieve 84. 4%. No obvious phosphate-releasing process was found during the initial stage of hypoxia in both artificial and municipal wastewater system. With theprolonging of hypoxia,a small rise was found in insoluble phosphates of the wastewater system,which indicates that enzymes related to degradation and transportation of polyphosphates in phosphate-accumulating bacterium JN459 strain require induction at low expression level.【期刊名称】《山东建筑大学学报》【年(卷),期】2015(000)001【总页数】4页(P25-28)【关键词】聚磷微生物;Microlunatus phosphovorus;聚磷特性【作者】钟传青;姜天翼;王静;张春明【作者单位】山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101;山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101;山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101;山东建筑大学市政与环境工程学院，山东济南250101【正文语种】中文【中图分类】Q930 引言增强型生物除磷工艺EBPR（enhanced biological phosphorus removal）是目前普遍使用的生物除磷技术，除磷效率是普通生物除磷工艺的3～7倍［1－3］。

一株聚磷菌的分离、鉴定及其除磷特性分析

一株聚磷菌的分离、鉴定及其除磷特性分析摘要：本研究从污水处理厂的污泥中分离出一株聚磷菌，并经过形态学、生理生化及基因分析鉴定其为菌种Pseudomonas aeruginosa。

利用此菌株研究了其在不同pH、温度条件下的生长情况，并探究了其除磷特性，结果表明该菌株能够在pH 6.5-7.5、温度30-35℃的条件下表现出较好的生长状态，并能够有效地利用污水中存在的磷酸盐类物质进行除磷作用，具有较好的应用前景。

关键词：聚磷菌；除磷；Pseudomonas aeruginosa；生理生化分析；基因分析正文：一、引言污染是当今社会面临的一大挑战，其中水污染是一个日趋严重的问题，而高浓度的磷酸盐的污染更是影响了我国的水资源状况和生态环境。

因此寻找一种高效、低成本的磷酸盐除去技术具有极其重要的现实意义。

其中聚磷菌具有很好的应用前景，因其可以通过生物吸收的方式将磷酸盐从水中除去。

因此本研究分离鉴定一株聚磷菌，并探究了其除磷特性，以期为其在水处理中的应用提供理论和实践支持。

二、材料与方法1.材料本研究采用来自于某市污水处理厂的污泥样品，并使用5%的凝胶过筛进行样品初步处理。

2.分离鉴定根据经过处理的污泥样品，采用接种平板、坡菌培养、肉汤稀释等方法进行菌种分离，最终筛选出一株聚磷菌菌株，对其进行了形态学和生理生化特性判定。

形态学特点：本研究所得的菌株为荧光绿色的杆菌，常见于自然水体中。

在营养琼脂平板上生成绿色润滑状菌落。

生理生化特性：本研究所得的菌株在28℃的条件下可以达到最佳生长状态，ph 范围为6.5-7.5，对葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、葡萄糖酸和黄嘌呤的利用情况也进行了研究。

基因分析：采用PCR 等方法对其16s rRNA 基因进行扩增和序列分析，利用HOMD 数据库对其进行了物种定位，并最终鉴定菌株为Pseudomonas aeruginosa。

3.除磷特性研究本研究选取了典型的对数期菌群阶段的聚磷菌培养液作为实验对象，利用紫磷钼酸钠法测定Pseudomonas aeruginosa 在不同浓度的HPO4-2 和PO4-3 下的生长情况，并采用虫草菌磷酸酶法分析其对废水中磷酸盐的除磷能力。

反硝化聚磷菌的分离鉴定及各单菌的反硝化吸磷特性

ｂａｃｔｅｒｉａａｎｄｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｂａｃｔｅｒｉａｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍｍｉｘｅｄｌｉｑｕｏｒｓａｍｐｌｅｓｉｎａｎｏｘｉｃｚｏｎｅｏｆｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｆｌｏｗｔｗｏ－ｓｌｕｄｇｅｓｙｓｔｅｍｕｓｉｎｇｐｌａｔｉｎｇｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒｍｏｒｅ，ｄｅｎｉｔｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＰ—ｕｐｔａｋｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｏｆｅｎｒｉｃｈｅｄｐｕｒｅｂａｃｔｅｒｉａｈａｓａｌｓｏｂｅｅｎｃａｒｒｉｅｄｏｕｔｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｆｉｎａｌｌｙｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａ，ｗｈｉｃｈｈａｖｅｔｈｅａｂｉｌｉｔｙｏｆｄｅｎｉ— ｔｒｉｆｙｉｎｇａｎｄＰ—ｕｐｔａｋｅ，ｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄ．Ｌｏｎｇ—ｔｅｒｍｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｔｈａｔ６ｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇｉｓｏｌａｔｅｓｔｈａｔｈａｖｅｏｂｖｉｏｕｓｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇａｂｉｌｉｔｙｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓｖｉｂｒｉｏｎａｃｅａｅ，Ｅｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ，Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，ＡｅｒｏｍｏｎａｓａｎｄＭｉｃｒｏｃｏｃｃｕｓ．Ａｎｄ９ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｓＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ，Ｓｔｒｃｐｔｏｃｏｃｃｕｓ，Ａｌｃａｌｉ－ｇｅｎｅｓ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ，ＰｓｅｕｄｏｍｏｎａｓａｎｄＥｎｔｅｒｏｂａｃｔｅｒｉａｃｅａｅ．Ｏｆ９ｐｏｌｙｐｈｏｓｐｈｏｒｕｓｉｓｏｌａｔｅｓ，６ｈａｖｅｔｈｅｄｅｎｉｔｒｉｆ－ｙｉｎｇａｂｉｌｉｔｙ．ＲｅｓｕｌｔｓｏｆＰ—ｕｐｔａｋｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓｓｈｏｗｔｈａｔ１１ｉｓｏｌａｔｅｓｈａｖｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｄｅｎｉｔｒｉｆｙｉｎｇａｎｄＰ—ｕｐ—

高效聚磷菌的分离及其特性研究

1.1 课题研究背景 ......................................................................................................... 1 1.1.1 我国水体污染及水体富营养化的严峻形势...................................................... 1 1.1.2 水体富营养化的危害及其治理的紧迫性.......................................................... 2 1.2 废水除磷的概述 ..................................................................................................... 2 1.2.1 化学除磷法.......................................................................................................... 3 1.2.2 生物除磷法.......................................................................................................... 3 1.2.3 生物－化学联合除磷法...................................................................................... 4 1.3 聚磷微生物（聚磷菌）的种类 ............................................................................. 4 1.4 微生物聚磷机理 ..................................................................................................... 6 1.4.1 PAOs 机理（厌氧/好氧聚磷机理） ................................................................... 7 1.4.1.1 厌氧条件下的生化机理................................................................................... 7 1.4.1.2 好氧条件下的生化机理................................................................................. 10 1.4.2 DPB 机理（反硝化聚磷机理） ........................................................................ 12 1.4.3 除磷机理研究中存在的问题............................................................................ 13 1.5 微生物聚磷的影响因素 ....................................................................................... 14 1.5.1 COD 对生物除磷的影响 ................................................................................... 14 1.5.2 溶解氧(Dissolved Oxygen, DO)和硝酸盐对生物除磷的影响 ....................... 15 1.5.2.1 DO 对生物除磷的影响 ................................................................................... 15 1.5.2.2 硝酸盐对生物除磷的影响............................................................................. 16 1.5.3 温度对生物除磷的影响.................................................................................... 16 1.5.4 pH 值对生物除磷的影响 ................................................................................... 17 1.5.5 其它因素对生物除磷的影响............................................................................ 17 1.6 本课题研究的目的意义及主要内容 ................................................................... 18 1.6.1 课题研究的目的意义........................................................................................ 18

间歇式反应器中反硝化聚磷菌的筛选、鉴定及特性研究参考课件

4
反硝化脱氮除磷工艺的优点
❖ 可有效的改善出水水质,从而可有效地减少引起富营养化的营养物(N、P)的排放；
❖ 减少污泥的回流量和剩余污泥，减少运行费用；
❖ 减少曝气量，降低COD的消耗量，节省能耗；
❖ 该工艺在COD/（N+P）的值低的条件下还能保持良
好的运行状态，同时使除磷所需的化学药剂量大大减少；
2
➢ 随着我国水体的富营养化越来越严重，污水处理的标准越来越严格，1998年1月1日开始实施的污水综合排放标准(GB8978-1996)对排放污水中氮、磷提出了更高要求。研究和开发经济有效可持续生物除磷脱氮的新工艺已成为水污染控制领域的重点和热点。
➢ 高效、节能、低耗的反硝化同时聚磷工艺具有广泛的应用前景
➢ 传统工艺（A/A/O法、倒置的A/A/O法、UCT法等）存在以下弊端：（1）COD氧化和硝化耗能大，且在COD氧化中失去了贮存在 COD内的大量化学能，（每kgCOD约含1.4×107J代谢能）; （2）反硝化与磷的生物聚集均需消耗COD; （3）剩余污泥量大; （4）耗能造成大量二氧化碳释放。
A2/O厌氧反硝化聚磷菌的筛选鉴定、
生物学及利用
间歇式反应器中反硝化聚磷菌的筛选、鉴定及
特性研究
1
研究意义
➢ 当今世界由于富营养化的日趋严重,污水中处理的主要对象为有机物、氨氮、和磷酸盐。化学需氧量COD和氨氮的去除一般由生物氧化和硝化/反硝化作用完成；磷酸盐或通过细菌的生物聚积或靠化学沉淀法被去除。
7
本试验的研究原理
8
工作内容
❖ 对驯化后培养出来的纯菌株进行筛选、分离及纯化；
❖ 进行纯菌株的生理生化鉴定，结合好氧吸磷试验，确定纯菌株的菌属；

高效低温聚磷菌的筛选及特性研究

摘
要：通过人工模拟自然降温的方式，Ａ／从０反应器驯化污泥中筛选到低温条件下聚磷效果较好的三株功
能菌株Ｐ、２Ｐ，１Ｐ、３经试验得到一种分离聚磷菌效果较好的方法一稀释混合平板法；分析研究三株茵的聚磷效
果、生化特性，测定三株茵的多维生长曲线，究了温度、Ｈ、量元素对这三株茵的生长量及除磷率的影响，研ｐ微结果表明，三株茵的生长最适温度均为１℃ ，宜的生长和除磷ｐ５适Ｈ为中性偏碱。最后用分子生物学的方法对三株菌进行鉴定，三株菌均属于不动杆菌属的约氏不动杆菌（ｉｅｂｃｅｈｓｎｉ。ＡｃｔａｔＪｎｏ）ｎｏｒｏｉ关键词：低温；聚磷菌；生长曲线；Ｈ值；ｐ温度；微量元素；菌株鉴定
ｔａｈｉｔｎｌｎｉｇｍｅｈｄｗｓｆｖｒｂｅｔｏａｅｐｏｐａｅ—ａｃｍｕａｉｇｏｇｎｓｙｓｕｙｎｎｔｅｒｐｏｐＯｌＳａ－ｈｔｔｅｄｌｉ／ｂｅｄｎｔｏａａｏａｌｏｉｌｔｈｓｈｔ — ｃｕｌｔｒａｉｍｓｂｔｄｉｇｏｈｉｈｓｈ／ｃｕｏｓｎｌ－ｃｍｕａｉｎቤተ መጻሕፍቲ ባይዱｃｐｂｌｙａｄｂｏｈｍｉａｅｔｒｓｎｏｄｒｔｅｔｔｅ２ｈｇｏｈｃｒｅ，ｉｏａｔｆｃｏ，ｔｍｐｒｔｒ，ｐａｄｕｌｔａａｉｔｎｉｃｅｃｌｆａｕｅ．Ｉｒｅｏｔｓｈ４ｒｗｔｕｖｏｉｍｐｒｎａｔｒｅｅａｕｅＨｎｔｓｔａｅｅｅｎｓｖｌｅｗｅｅｓｕｉｄｔｖｌａｅｔｅｒｆｅｔｎｔｅｇｏｔｎｈｓｈｒｓｒｍｏａａｉｓｏ，ＰｒｃｌｍｅｔａｕｒｔｄｅｅａｕｔｉｆｃｈｒｗｈａｄｐｏｐｏｕｅｖｌｔｆＰ１２，ａｄＰｏｈｅｏｒｏｎ３．Ｒｅｕｔｓｌｓｓｏｈｔｔｅｏｔｌｔｍｐｒｔｒｏｈｈｅｔｉｓｇｏｈｉｂｕ５．ｈｓｈｒｓｒｍｏａｒａｌｆｕｔａｎｒｐｉｌｎｈｗｔａｈｐｉｅｅａｕｅｆｒｔｅｔｒｅｓｒｎｒｗｔｓａｏｔ１ ℃ ｐｏｐｏｕｅｖｌｒｓｒｉｓａｅｏｔｍａａｏｆｌｏｍａｉａｍｉｌｌａｉｃｎｉｏ．Ｆｎｌ，ｔｅｍｏｅｕａｉｌｇｔｏｄｐｅｅｔｙｔｅｔｒｅｐｏｐａｅａｃｍｕａｉｇｂｃｅｉｎｌｙａｋｌｏｄｔｎｉａｌｈｌｃｌｒｂｏｏｍｅｈｄｉａｏｔｄｉｎｉｈｅｈｓｈｔｃｕｌｔａｔｒａｄｄｉｙｙｓｄｆｈｎａ

富营养化湖泊沉积物聚磷菌的分离鉴定及除磷特性

富营养化湖泊沉积物聚磷菌的分离鉴定及除磷特性杨㊀波1∗㊀王㊀文1㊀毕㊀磊2㊀曾清如3㊀周细红3㊀刘爱军3(1.三亚学院翟明国院士工作站,海南三亚572022;2.中国科学院生态环境研究中心环境纳米技术与健康效应重点实验室,北京100082;3.湖南农业大学资源环境学院,长沙410128)摘要:采用经典的稀释混合平板法,从昆明滇池沉积物中分离出1株高效聚磷菌,并结合16sRNA 基因序列分析进行了菌株的鉴定,在此基础上研究了其在不同理化因素条件下的除磷特性㊂研究结果表明,分离出的菌株为节杆菌属(Arthobacter sp.),将其命名为Arthobacter sp.B ㊂在富磷培养基中接种培养12h 该菌株即能完成对数增长期,在磷浓度为2mg /L ㊁温度为30~35ħ㊁pH 值为6~7㊁以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖作为唯一碳源和以牛肉膏㊁蛋白胨为唯一氮源时,菌株B 在培养周期内生长迅速,体系的除磷率都在80%以上,而当温度低于15ħ或高于35ħ㊁pH 值低于5或高于8时,菌株的生长受到明显抑制,除磷率也较低㊂同时研究结果发现,该菌株的生长会影响其生长环境基质的pH 值,在一定范围内,可调节pH 至其最适的生长区间㊂进一步的分析表明,该菌株利用碳源和氮源的方式和机理有别于传统的活性污泥中的反硝化聚磷菌,对蔗糖㊁葡糖糖等大分子有机碳源具有较高的利用率和亲和力,此外,该菌株不能利用铵盐作为唯一氮源来加以利用㊂关键词:聚磷菌;分离;鉴定;节杆菌属;除磷率㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀收稿日期:2019-11-18基金项目:海南省自然科学基金项目(617180);海南省重点研发计划项目(ZDYF2018144)㊂∗第一作者㊁通信作者:杨波(1981-),男,博士,副教授,主要从事环境污染与防治研究㊂yangbo810819@ISOLATION ,IDENTIFICATION AND PHOSPHORORUS-REMOVAL CHARACTERIZATIONOF PHOSPHATE ACCUMULATING ORGANISMS COLLECTEDFROM EUTROPHIC LAKE SEDIMENTYang Bo 1∗㊀Wang Wen 1㊀Bi Lei 2㊀Zeng Qingru 3㊀Zhou Xihong 3㊀Liu Aijun 3(1.Zhai Mingguo Academician Work Station,Sanya University,Sanya 572022,China;2.Key Laboratory of Environmental Nanotechnology and Health Effects Research Centerfor Eco-Environmental Sciences,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100082,China;3.College of Resource and Environment,Hunan Agricultural University,Changsha 410128,China)Abstract :A phosphate accumulating organisms was isolated from eutrophic sediment which located in Dianchi Lake,Yunnan,China.The strain,named Arthobacter sp.B,was obtained by classic methods for screening microorganisms together with 16srRNA gene analysis.Effects of different culture conditions to the bacterial growth and phosphorus removal efficiency werestudied.The results showed that the logarithmic growth phase was completed within 12hours after incubation,the optimal temperature range was from 30ħ~35ħ,the optimal initial pH was 6~7,and the best carbon source were sucrose,glucoseor maltose,the best nitrogen source were beef extract or peptone.Under these optimized condition,the phosphorus removal efficiency was higher than 80%with maximum growth rate of the strain B.On the contrary,when the temperature was below15ħor above 35ħand the pH was below 5or above 8,which would obviously inhibit the growth of strain B,eventually ledto lower phosphorus removal efficiency.The results also showed that the strain B could affect the pH during its growth period in a certain extent,and adjusting the pH value to its optimum range was observed.The utilization mode and mechanism of carbonsource and nitrogen source for the strain was different from denitrifying phosphate accumulating organisms which existed inactivated sludge.Further study revealed that the strain B could utilize macromolecule carbon source such as sucrose,glucoseand maltose effectively.In addition,ammonium salt could not use be the sole nitrogen source to support the growth of strain B.Keywords:phosphate accumulating organisms;isolation;identification;Arthobacter sp.;phosphorus removal efficiency0㊀引㊀言水体富营养化是全球范围内主要的水体污染问题之一㊂一般认为水体中氮㊁磷等营养物质过剩是造成富营养化的主要原因,其中又以磷为主要污染因子[1-3],所以去除水体中过量的磷显得尤为重要㊂生物除磷法的基本原理是利用活性污泥中的聚磷菌(phosphate accumulating organisms,PAOs),在好氧条件下,可超出其生理需要的从污水中过量摄取磷,并以多聚磷酸盐储存于体内形成聚磷污泥,并最终通过污泥的排放达到从污水中去除磷的目的[4,5]㊂在生物除磷法中,高效聚磷菌的筛选成为了首先要考虑的问题[6]㊂为获得高效聚磷菌物种资源,至今已有多种具备较强聚磷能力的微生物被筛选出来[6-10]㊂目前,关于聚磷菌的研究,大多数集中于高浓度废水和污水的活性污泥处理系统[7,11-15],而直接从富营养化水体沉积物中分离筛选高效聚磷菌并研究其除磷特性目前报道较少㊂伍思宇等[16]和佘晨兴等[17]从天然湖库水体沉积物筛选了具有一定聚磷能力的若干种菌株,但并未就其在不同理化条件下的除磷特性做进一步的研究㊂本研究从富营养化水体沉积物中分离筛选出高效除磷的聚磷菌菌株,并研究其在不同理化因素影响下的生长及除磷特性,期望能对富营养化水体生物除磷技术提供有用的菌种资源和基础性研究支持㊂1㊀材料与方法1.1㊀材㊀料1.1.1㊀微生物沉积物来源沉积物样品分别来自昆明滇池,大理洱海和太湖梅梁湾,用于菌种的分离与筛选㊂1.1.2㊀培养基预培养基:乙酸钠0.5g,MgSO40.4g,CaSO4 0.08g,牛肉膏0.22g,NH4Cl0.15mg,K2SO4 0.018g,Na2HPO43H2O0.008g,蒸馏水1000mL,pH 7.0~7.2.富集培养基:乙酸钠5g,牛肉膏3g,蛋白胨10g,NaCl5g,KH2PO40.02g,蒸馏水1000mL, pH7.0~7.2㊂筛选培养基:乙酸钠0.5g,MgSO4 0.4g,CaSO40.08g,牛肉膏0.22g,(NH4)2SO4 0.2g,FeSO40.002g,蒸馏水1000mL,根据需要分别加入不同浓度的磷㊂富磷培养基:乙酸钠0.5g, MgSO40.4g,CaSO40.08g,牛肉膏0.22g,(NH4)2SO40.2g,FeSO40.002g,K2HPO43H2O0.0147g,蒸馏水1000mL,pH7.0~7.2㊂以上培养基均为液体培养基,且均经过121ħ灭菌20min后使用㊂1.2㊀方㊀法1.2.1㊀菌株的分离和筛选称取采集的沉积物样品2g于250mL锥形瓶中,加入100mL去离子水,摇床培养3d(30ħ, 120r/min),形成泥水混合液,然后转取泥水混合液5mL于100mL磷浓度为2mg/L的富集培养基中,于摇床振荡培养7d(30ħ,120r/min)得到驯化液,再转取2mL驯化液于75mL不同磷浓度的筛选培养基中,于摇床上振荡培养3d(30ħ,120r/min),筛选培养基的磷浓度分别为5,10,15,20,25,30mg/L(以P 计)㊂将富集驯化的菌悬液按10-1~10-7梯度进行稀释,采用混合平板法分离菌株,挑取单菌落,并对挑取的单菌株进行多次培养划线分离纯化得到纯化菌株㊂将分离纯化得到的菌株于预培养基中在120r/min㊁30ħ条件下摇床振荡培养12h㊂然后将菌液在8000r/min条件下离心5min,再将菌液转接于富磷培养基(磷含量为2mg/L)中,于120r/min㊁30ħ条件下摇床振荡培养至菌液变浑浊.然后在10000r/min转速下冷冻离心10min,取上清液测定总磷浓度,并用未接种菌株的富磷培养基做对照实验,计算各菌株除磷率,筛选出高效除磷菌株㊂将筛选出的高效除磷菌株进行PHB颗粒染色和异染颗粒染色,确定含有PHB颗粒和异染颗粒的菌落进行后续实验㊂1.2.2㊀菌株的鉴定采用Ezup柱式细菌DNA快速提取试剂盒提取待鉴定菌株的基因组DNA㊂扩增16S rDNA引物,正向引物:5ᶄ-GGCGGACGGGTGAGTAA-3ᶄ,反向引物: 5ᶄ-GGACTGCTGCCTCCCGTAG-3ᶄ㊂反应过程:94ħ预变性5min,94ħ30s,54ħ50s,72ħ1min,30个循环,72ħ延伸10min,然后经过凝胶电泳和PCR产物回收㊂PCR产物交于上海生工生物工程有限公司进行测序,测序结果登陆GenBank进行比对分析㊂1.2.3㊀不同理化因素对聚磷菌生长及除磷特性的影响磷浓度及培养时间对聚磷菌生长及除磷率的影响:将筛选纯化得到的菌株接种到装有100mL预培养基的锥形瓶中,在120r/min,30ħ条件下振荡培养24h,然后将预培养液按2%接种到100mL调整了磷浓度的富磷培养基中(磷浓度分别调整为2,5, 8mg/L),在120r/min,30ħ条件下振荡培养,分别于8,12,24,36和48h取培养液测定菌株生长情况,并计算除磷率㊂温度对聚磷菌生长及除磷率的影响:将上述预培养液按2%转接到装有100mL富磷培养基的锥形瓶中,在120r/min和不同温度条件下振荡培养2d,温度梯度分别设置为10,15,20,25,30,35,40ħ㊂培养完成后取培养液测定菌株生长情况并计算除磷率㊂pH对聚磷菌生长及除磷率的影响:将上述预培养液按2%转接到装有100mL富磷培养基的锥形瓶中,设置培养基的pH值分别为4㊁5㊁6㊁7㊁8㊁9㊁10,在120r/min㊁30ħ条件下振荡培养2d㊂培养完成后取培养液测定菌株生长情况并计算除磷率㊂不同碳源和氮源对聚磷菌生长及除磷率的影响:以不含乙酸钠的富磷培养基为基础,按照1%添加量分别加入葡萄糖㊁木糖㊁蔗糖㊁麦芽糖㊁乳糖㊁乙酸钠㊁乙醇㊁可溶性淀粉作为唯一碳源配置培养基㊂同时,以不含牛肉膏和硫酸铵的富磷培养基为基础,按照1%添加量分别加入牛肉膏㊁蛋白胨㊁尿素㊁酵母粉㊁硝酸钾㊁氯化铵㊁硫酸铵作为培养液唯一氮源配置培养基㊂然后按照2%预培养液接种量,于上述不同碳源和氮源的富磷培养基中,在120r/min㊁30ħ条件下振荡培养2d,分别考察不同碳源和氮源对聚磷菌生长及除磷率的影响㊂1.2.4㊀分析测试方法㊀总磷采用钼锑抗分光光度法(GB11893 89)测定㊂菌体的生长情况采用光电比浊法即OD值法测定[18],利用UV2300型分光光度计在波长为600nm 处测定菌悬液的吸光度值OD600,用来表示菌体的细胞浓度.异染颗粒采用Albert染色法染色,PHB颗粒采用苏丹黑染色法染色[19]㊂1.2.5㊀数据处理与统计分析实验结果用EXCEL2010进行数据处理和绘图,每组实验做3个平行,结果取其平均值,实验结果以MeanʃSD来表示㊂2㊀结果与分析2.1㊀高效聚磷菌的筛选与鉴定2.1.1㊀高效聚磷菌的分离与复筛㊀采用稀释混合平板法,通过对菌株进行富集驯化㊁划线分离与纯化,将所得菌种接种于富磷培养基进行除磷率的测定,筛选出除磷率在50%以上的7株菌,并进行PHB颗粒和异染颗粒实验,实验结果见表1㊂由表1的实验结果可知,在除磷率50%以上的7株菌中,菌株B的PHB颗粒染色和异染颗粒染色效果较明显,同时除磷率达到了78.4%,因此,选择菌株B进行后续的研究㊂表1㊀聚磷菌菌株筛选结果比较菌株名称除磷率/%PHB颗粒异染颗粒A58.4%未观察到有,较小B78.4%有,明显有,较大C76.2%未观察到有,小D65.1%有,不明显有,较小E59.1%有,不明显有,小F62.5%未观察到有,小G52.2%有,不明显有,小2.1.2㊀菌株的形态特征及鉴定㊀分离纯化的菌株B菌落的形态如图1所示㊂经观察,形成的菌落菌苔丰厚,呈亮黄色,半透明状,表面光滑有光泽,隆起,粘稠湿润㊂图1㊀菌株B的形态将测序得到的菌株16S rDNA与NCBI Genbank 数据库进行Blast比对,采用MEGA4.0对16SrDNA 结果进行比对分析,将所选菌株鉴定到属,并采用邻位链接法(Neighbor-joining)绘制系统发育树(图2)㊂NCBI数据库的比对结果表明,该菌株与Arthobacter 的相似性达98%以上,鉴定其为节杆菌属(Arthobacter)㊂2.2㊀磷浓度及培养时间对聚磷菌生长及除磷率的影响由图3可以看出,在30ħ振荡培养条件下,菌株B在3种不同磷浓度的富磷培养基中均能正常生长,培养时间12h内,OD值增加明显,说明生物量增长迅速,12h既能达到最大生物量,随后的48h内生物图2㊀菌株B 的系统发育树量基本保持稳定,但略有下降,说明菌株B 的最佳培养时间为12h 左右㊂同时,结果表明,菌株B 在3种不同磷浓度的富磷培养基中生物量差别不大,说明菌株B 在磷浓度达到一定值后,过量的磷并不会刺激其生长㊂图3㊀不同磷浓度培养条件下菌株B 的生长及除磷特性除磷实验发现,菌株B 除磷率变化趋势与其生长曲线基本相吻合㊂在磷浓度为2mg /L 时,除磷率在8~12h 内急剧上升,由51.2%上升到96.8%,除磷效果明显,12h 后除磷率略有下降,但也高达85%以上㊂在磷浓度为5和8mg /L 时,随着培养基磷浓度的升高,除磷率整体呈现下降,在培养12h 时,除磷率分别为72.2%和47.9%,除磷率下降明显㊂2.3㊀温度对聚磷菌生长及除磷率的影响每1种特定微生物都有其温度适应范围及最适温度㊂如图4所示,菌株B 在温度为30ħ时生物量和除磷率都达到最高,当温度低于15ħ时,菌株B 生物量较低,除磷率也较低,随着培养温度的上升,菌株B 的生物量和除磷率也快速增长,当温度为30ħ时,菌株B 生物量和除磷率都达到最高,而当温度超过35ħ时,菌株B 生物量和除磷率都急剧下降㊂实验结果表明,菌株B 在20ħ~35ħ之间均能正常生长,但是除磷率仅在30~35ħ维持在较高水平,说明温度对菌株B 的除磷效率的影响要大于其对生长的影响㊂图4㊀温度对菌株B 生长及除磷率的影响2.4㊀pH 对聚磷菌生长及除磷率的影响由图5可知,当接种pH <6时,菌株B 的生长受到了明显的抑制,尤其是接种pH 值<5以下菌株B 很难生长,菌株B 的最佳接种pH 为6~7,当接种pH 超过8后,随着pH 的增加生物量快速减少,说明此时生长受到明显抑制㊂同时,B 菌除磷率的变化趋势与其生长趋势基本相吻合,在接种pH 为6~7时,除磷率最高,pH 超过7后,随着pH 的上升,除磷率显著下降㊂图5㊀pH 对菌株B 生长及除磷率的影响2.5㊀不同碳源和氮源对聚磷菌生长及除磷率的影响如图6所示,不同碳源对菌株B 的生长和除磷率影响较大㊂当以乙醇和木糖为碳源时,菌株B 生长受到明显抑制,生物量较低,除磷率也较低;当以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖作为碳源时,菌株B 生长迅速,其生物量和除磷率都处于较高水平㊂值得注意的是,以乳糖作为碳源时,菌株B 生长受到明显抑制,生物量很低,但是其除磷率却较高,而以可溶性淀粉作为碳源时,菌株B 的OD 600值较高,暗示生物量较大,但是除磷率却很低.另外,乙酸钠为碳源时,菌株B 生物量虽然不是最高,但是也能够正常生长,除磷率也处于较高水平㊂综合来说,在以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖为唯一碳源时,菌株B 具有较高的生长速率和除磷率,这3种碳源是菌株B 较理想的碳源㊂图6㊀不同碳源对菌株生长及除磷率的影响如图7所示,不同氮源对菌株B 的生长和除磷率具有较大的影响㊂当分别以牛肉膏㊁蛋白胨为唯一氮源时,菌株B 生长旺盛,生物量较大,同时除磷率也较高㊂当分别以硫酸铵㊁氯化铵㊁硝酸钾和尿素作为唯一碳源时,菌株B 的生长缓慢,在培养周期48h 达不到较高的OD 600值,同时,除磷率也处于较低水平㊂当以酵母膏作为唯一碳源时,菌株生长较旺盛,在培养周期48h 内能达到较高的OD 600值,但是其除磷率却低于10%㊂图7㊀不同氮源对菌株生长及除磷率的影响3㊀讨㊀论聚磷菌含有典型的PHB 颗粒和异染颗粒,PHB 颗粒可被脂溶性染料苏丹黑着色,异染颗粒可被甲苯胺蓝和次甲基蓝染成紫色,可与其他非颗粒性物质区分开来[19]㊂目前发现的聚磷菌种类繁多,分属不同类群微生物,天然水体沉积物中发现的常见聚磷菌多为:不动杆菌属(Acinetobacter )㊁假单胞菌属(Pseudomonas )㊁芽孢杆菌属(Bacillus )㊁寡养单胞菌属(Stenotrophomonas )㊁厌氧粘细菌(Anaeromyxobacter )㊁聚磷小月菌(Microlunatus phosphovorus )和甲基杆菌属(Methylobacterium )等[16,17,20-22]㊂本研究中,从富营养化水体滇池沉积物中分离筛选出的菌株B 具有明显的PHB 颗粒染色和异染颗粒染色效果,同时具有较理想的除磷效果,经鉴定其为节杆菌属(Arthobacter )㊂本研究发现,在培养基初始磷浓度为5和8mg /L 时,除磷率明显降低(图3),但并不能说明菌株B 在初始磷浓度升高条件下除磷能力减弱㊂结合图2,经过计算,菌株B 在培养时间48h 内除磷量的统计发现,体系初始磷浓度为5和8mg /L 时,其除磷量是高于初始磷浓度为2mg /L 时的体系(图8),而此时菌株B 的生物量并没有较磷浓度为2mg /L 时有明显增长,这说明菌株B 除磷能力并没有减弱㊂磷浓度升高时菌株B 表现为除磷率降低的原因在于磷浓度较低时(2mg /L),除磷量没有达到饱和,在磷浓度增加和菌株B 的生物量并没有明显增加的条件下,除磷量逐渐达到饱和,而除磷率是以初始磷浓度作为基数来进行计算的,因此结果表现为高浓度磷培养条件下除磷率降低㊂进一步的,根据图8的计算结果推算菌株B 的除磷极限初始磷浓度大约为3.7mg /L,说明当初始磷浓度低于3.7mg /L,菌株B都应能保持有较高的计算除磷率㊂图8㊀培养液初始磷浓度和除磷量的关系聚磷菌的生长受环境的pH 影响很大㊂环境pH 值会影响细胞在培养基中的氧化还原电位和带电状态,进而影响菌体对营养物质的吸收和利用以及代谢过程中酶的反应活性,最终影响除磷性能[23-25]㊂大量研究表明,活性污泥中的聚磷菌在中性或偏碱性的条件下能够占据优势地位,系统能够取得较好的除磷效果[14,26,27]㊂李楠等的研究发现,在中性(pH=7)和弱碱性(pH=8)条件运行下的生物除磷反应器中,聚磷菌在活性污泥微生物中的含量甚至能达到60%以上[14]㊂本研究中,对各梯度接种培养后48h培养基的pH的测定结果发现,在本实验培养48h时,不同pH梯度培养基的PH值发生了较明显变化,pH值梯度为5㊁6㊁7㊁8㊁9的培养液接种培养48h后培养基的pH均集中在6.3~6.6(表2),说明菌株B最适的生长pH为中性或偏弱酸性,并且菌株B的生长会影响其生长环境基质的pH值,在一定范围内,可调节pH 至其最适的生长范围,但是,pH值超过了其生长适应范围,则不能将其调节至最适生长pH区间,如本实验中的初始pH为4.0和10.0,在培养时间48h后,菌株B基本不能生长,其培养基pH值始终处于较低或较高范围㊂表2㊀菌株B培养前后培养基pH值的变化培养状态培养基pH值培养前 4.0ʃ0.2 5.0ʃ0.2 6.0ʃ0.27.0ʃ0.28.0ʃ0.29.0ʃ0.210.0ʃ0.2培养后 4.7ʃ0.2 6.4ʃ0.3 6.5ʃ0.3 6.5ʃ0.4 6.3ʃ0.3 6.6ʃ0.28.0ʃ0.1㊀㊀本研究中,将不同理化因素条件下的菌株生长量与除磷率做一相关性分析,如图9所示㊂结果表明在不同培养时间㊁不同pH和不同温度培养条件下,菌株B的除磷率和反映其生物量的OD600值呈现出明显的正相关(图9a),线性关系明显,且基本处于同一线性关系中,说明上述3个因素影响显著影响了菌株B的生长和繁殖,生物量的高低决定了体系内除磷率的高低㊂不同碳源和氮源对聚磷菌的生长和除磷效果影响很大㊂多数聚磷菌只能以低级脂肪酸类的小分子有机基质作为碳源,并将其合成的PHB以能量形式储存在细胞内[28]㊂在活性污泥法处理工艺中存在的反硝化聚磷菌,当以乙酸钠为碳源时,其除磷效果最佳,而以葡糖糖为碳源时,除磷效果较差,其原因在于活性污泥中聚磷菌吸收乙酸等小分子有机物时不依靠主动运输,而是靠被动运输或是扩散作用,不需要消耗能量,而以葡萄糖或蔗糖等大分子有机物为碳源时,不利于被微生物吸收,以致在厌氧环境下不能贮存糖原,从而无法有效转化成PHB,从而影响除磷效果[7,29]㊂本研究中聚磷菌为富营养化湖泊滇池沉积图9㊀不同理化因素条件下菌株B除磷率与生长OD600值的相关性物分离得到,结果表明当以蔗糖㊁葡萄糖和麦芽糖作为碳源时,菌株生长迅速,其生物量和除磷率都处于较高水平,以乙酸钠为唯一碳源时,生物量和除磷率也能达到较高水平,这与前述的研究结果不尽相同㊂屈建航等研究发现,从太湖分离出的一株高效聚磷菌,在葡萄糖和蔗糖作为碳源时,也能取得较高的生物量和除磷率[26],这跟本研究中的结果相似㊂大部分已报道的关于聚磷菌的研究,主要集中于活性污泥法处理工艺中,通常研究对象为反硝化聚磷菌,而从富营养化湖泊沉积物中分离的聚磷菌实为好氧聚磷菌,从上述的分析中可以发现,不同种类的聚磷菌对碳源的利用效果可能不尽相同,除了与分子量与分子结构有关以外,还可能跟菌体本生对碳源的亲和性和其他利用特性也有关系㊂氮源是微生物细胞生长的第二大营养物质,对蛋白质㊁核酸和其他一些成分的合成非常重要,多数细菌能以铵盐作为唯一氮源[6]㊂本研究发现,分别以硫酸铵㊁氯化铵㊁硝酸钾等作为唯一碳源时,菌株B 生长缓慢,除磷率也处于较低水平,说明铵盐并不能作为菌株B的唯一氮源㊂菌株B利用氮源的机理还需进一步的研究和探讨㊂本研究中,不同碳源和不同氮源培养条件下,菌株B的除磷率与OD600值并没有呈现出明显的相关关系(图9b),其中,比较特殊的碳源为乳糖和可溶性淀粉,比较特殊的氮源为酵母膏㊂以乳糖为唯一碳源时,OD600值很低,除磷率却很高㊂有研究表明,某些碳源和氮源当中存在某些含磷杂质,可能会影响除磷率的计算[6],这可能是造成本研究中菌株生长良好,而除磷率却很低的原因㊂而以可溶性淀粉为唯一碳源和以酵母膏为唯一氮源时,OD600值较高,但是除磷率却很低㊂有研究表明,在碱性条件下会导致PO4-3-P 以磷酸盐沉淀的形式析出[6,7],造成除磷率偏高的假象,但是本研究中在以可溶性淀粉为唯一碳源和酵母膏为唯一氮源时,培养基的pH值并没有处于碱性条件下,据此推测,可能是可溶性淀粉和酵母膏中的某些成分导致了磷的析出或者吸附,造成除磷率明显偏高㊂4㊀结㊀论1)采用富集培养及混合平板分离技术,从滇池沉积物中驯化筛选出了一株高效聚磷菌,经分子生物学鉴定,该菌株与Arthobacter sp.的相似性达98%以上,鉴定其为节杆菌属(Arthobacter)㊂2)菌株B在接种培养12h即能完成对数增长期,在磷浓度为2mg/L㊁温度为30~35ħ㊁pH值为6~7㊁以蔗糖㊁葡萄糖或麦芽糖作为唯一碳源和以牛肉膏或蛋白胨为唯一氮源时,菌株B在培养周期内生长迅速,体系的除磷率都在80%以上,而当温度低于15ħ或高于35ħ㊁pH值低于5或高于8时,菌株的生长受到明显抑制,除磷率也较低㊂3)菌株B的生长会影响其生长环境基质的pH 值,在一定范围内,可调节pH至其最适的生长范围㊂菌株B的除磷率和其生物量呈现出明显的正相关,且基本处于同一线性关系㊂4)菌株B利用碳源和氮源的方式和机理有别于传统的活性污泥中的反硝化聚磷菌,对蔗糖㊂葡萄糖等大分子有机碳源具有较高的利用率和亲和力,同时,不能利用铵盐作为唯一的氮源来加以利用㊂参考文献[1]㊀PAERL H W,HAI X,MCCARTHY M J,et al.Controlling harmfulcyanobacterial blooms in a hyper-eutrophic lake(Lake Taihu,China):the need for a dual nutrient(N&P)management strategy[J].Water Research,2011,45:1973-1983.[2]㊀ABELL J M,ZKUNDAKCI D,HAMILTION D P.Nitrogen andphosphorus limitation of phytoplankton growth in New Zealandlakes:implications for eutrophication control[J].Ecosystems,2010,13(7):966-977.[3]㊀王军霞,李莉娜,陈敏敏,等.中国重点污染源总磷㊁总氮排放状况研究[J].环境污染与防治,2015,37(10):98-104.[4]㊀COKRO A A,LAW Y Y,WILLIAMS R B H,et al.Non-denitrifying polyphosphate accumulating organisms obviaterequirement for anaerobic condition[J].Water Research,2017,111:393-403.[5]㊀王文瀚,王林,李咏梅.富磷污泥厌氧消化磷释放与回收的研究进展[J].环境污染与防治,2014,36(4):75-79. 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（如脂肪酸）
合成
正磷酸盐
（类脂粒PHB、糖原）等贮能物质
生物除磷—聚磷菌除磷机理
聚磷菌过量吸磷（好氧）
细胞内的（聚β -羟基丁酸）PHB分解
废水中
Q
正磷酸盐
摄取
ATP+多聚磷酸盐Poly-P 储存在细胞内
生物法除磷的原理是细菌交替地处于厌氧与好氧条件下，好氧时吸收的磷大大的超过了厌氧时释放的磷，将剩余污泥排出系统，达到除磷的目的。
聚磷菌全基因组测序及其聚磷基因比对研究
（1）全基因组测序
上海生物生工有限公司
(2 ）聚磷相关功能基因序列的比对分析
通过 primer5.0 、 DNAMAN、SPDBViewer 等生物信息学软件完成基因序列及结构分析
（3）聚磷关键基因的序列及结构分析通过SOPMA对序列的二级结构进行分析
PAM-TBO培养基褪色法
PAM-TBO培养基褪色原理:
甲苯胺蓝带正电荷，异染粒带负电荷，亲和结合。
利用甲苯胺蓝颜色易观察，且吸附后颜色变化明显。细菌体内多聚磷酸盐被染色，离心后，颜色变淡。
菌名空白 WS-6 WS-16 WS-16-2 HS-2 HS-5 HS-12
染色率 0
0.425 0.457 0.553 0.538 0.75 0.693
不同初始pH下菌体的生长情况
MA-2 MA-5
1.5
X-24
吸光
1
度
值 0.5
0 3 4 5 6 7 8 9 10 11
发酵液初始pH值
OD600
吸光度
不同温度值
培养温度
OD600
吸
吸
光
光
度值
度
OD600
OD600
转速r
Nacl浓度
菌种的聚磷特性
菌种生长曲线、培养基中PO4-3-P含量
01
（5）研究多聚磷酸盐，了解其理化性质，并对其进行初步的分离纯化，可以从分子方面对聚磷菌进行认知。
（6）人工构建的工程菌仍然存在质粒容易丢失、关键酶蛋白易形成包涵体、聚磷效果不够稳定、对生长环境适应力较差等问题。所以，提高聚磷工程菌的稳定性也是生物除磷的一个重要研究方向。
谢谢！
接种量
培养基起始pH
最适接种量、发酵时间，培养温度在不同PH值下进行培养24h，然后分别测定所对应菌的 OD60。
最适接种量和最适的发酵时间，不同温度下进行培养分别测定 OD600。
发酵温度
碳源
氮源
分别接入不同C/N条件下培养，然后分别测定所对应菌的 OD600。
聚磷培养条件优化
16S rDNA电泳图和系统发育数
↑↑ ↑↑
↑↑
MA-2 红细菌属X-24 NhomakorabeaMA-5 MA-2
MA-5 微杆菌属
X-24 节杆菌属
聚磷培养条件优化
种子液：经过试管培养24h，分别对对培养温度、培养时间、起始pH、碳源、氮源、接种量进行优化，通过正交试验获得最佳培养的条件。
1%-8%接种量接到装有100mL加磷的 LB液体培养基（平行三个）,然后放到37 度下静置培养24h,测定OD600。
细菌，能催化过氧化氢成为水和原子态氧，继而形成氧分子，出现气泡。
淀粉水解实验：检测细菌能否产生淀粉酶和利用淀粉的能力；
（有些细菌具有合成淀粉酶的能力，可以分泌胞外淀粉酶.淀粉酶可以使淀粉水解为麦芽糖和葡萄糖,淀粉水解后遇碘不再变蓝色。）
V-P试验、甲基红实验：糖发酵后形成丙酮酸后的不同代谢途径；
硝酸盐试验：鉴别返硝化细菌；
聚磷率 0
0.341 0.374 0.432 0.506 0.775 0.685
表1 初始聚磷率和染色率
生理生化鉴定
观察菌落的形态、形状、大小、颜色、干湿、边缘、光泽和透明度、菌落高度、褶皱、质地和培养基的颜色等。革兰氏染色、芽孢观察和运动性观察
生理生化特性鉴定：
过氧化氢酶实验：鉴别大多产生过氧化氢酶的好氧和兼性厌氧菌。含有过氧化氢酶的
污废水样本采集
（1）淮安第二污水处理厂沉淀池活性污泥（2）黄海海边化工厂旁的沙泥
聚磷菌的筛选
YG培养基
污水样品
PAM-TBO培养基培养
细菌贮存PolyP能力
染色率试验
聚磷率试
验
稀释涂布
分离纯化
筛选出20+16 株菌株
类脂粒（PHB）异染粒（Poly-P）染色
复筛
驯化培养
生理生化鉴定
聚磷特性研究
聚磷最佳条件优化
全基因组测序及其聚磷基因
研究
初筛-染色与褪色实验
（1）染色实验
类脂粒PHB（聚β -羟基丁酸）染色
苏丹黑对脂类溶解度高，类脂粒易染色，便于观察。番红复染，细菌底色淡红色。
异染粒-多聚磷酸盐（Poly-P）染色
异染粒是以无机偏磷酸盐聚合物为主要成分的一种无机磷的贮备物。异染颗粒嗜碱性或嗜中性较强,用蓝色染料 ( 如甲苯胺蓝或甲烯蓝 ) 染色后不呈蓝色而呈紫红色,故称异染颗粒。孔雀绿复染，易染颗粒呈蓝黑色，菌体呈绿色或浅绿色
明胶液化：细菌把明胶分解成液状的现象，明胶是在热水中溶解胶原而成的蛋白质，可
由产生于体外的蛋白酶进行分解的；
糖发酵、柠檬酸、氧化酶试验等。
生理生化鉴定
菌体形态
菌体形状菌落形状褶皱度湿润度凸起程度
颜色耐盐度运动形态
X-24
杆状圆形平滑湿润凸起黄色 5% 运动
MA-2
球状圆形平滑湿润凸起乳黄色 10% 运动
聚磷菌介绍
聚磷菌：是活性污泥工艺中的兼性细菌，在好氧或缺氧状态下能超量地将污水中的磷吸入体内，使体内的含磷量超过细菌体内含磷量的数倍.
当聚磷菌生活在营养丰富的环境中，在将进入对数生长期时，为大量分裂作准备，细胞能从废水中大量摄取溶解态的正磷酸盐，在细胞内合成多聚磷酸盐，并加以积累，供下阶段对数生长时期合成核酸所需的磷元素。
（1）当培养基含磷量为20mg/L时，三株菌的除磷率都达到大约80%，X-24还超过90%。（2）但是当环境中的磷浓度逐渐增加时，聚磷效果明显降低，这由细菌体内最多含磷量多少（摄磷率）决定。
聚磷特性研究
（1） MA-2,MA-5在8-16h是对数生长期、比X-24较早进入生长期，但是也相对的较早进入衰亡期。（2）MA-2,MA-5的稳定期较长，X-24很快出现细胞衰亡的情况。（3）X-24生长较慢，进入对数期要12h才达到稳定期。（4）随着菌体生长，培养基中磷含量下降，菌体中的磷含量增加，开始除磷。（5）当细菌进入衰亡期，由于细胞失活聚磷效果明显下降。
种子液培养24h,按照获得最佳接种量接种，接到装100ml
含磷LB液体培养基（平行三个）,然后放到28度下静置培养，
分别测下培养时间分别每隔4h测量对应菌的OD600，并绘制生
长曲线和随时间变化培养液pH值的变化、PO4-3-P量。
02
菌体含磷量的测定
测菌体干重并将湿菌体溶解于无菌水中，过硫酸钾消解，测菌体总磷。（依据国标法检测）
水体富营养化已经成为世界性的环境污染问题。
矿化作用同化作用
污水固处氮作理用研究背景
（蓝藻补充自身氮量）
物理除磷
电解法、结晶
法吸附法（粒状复
合铁铝除磷吸附剂）
化学除磷生物除磷
化学沉淀法（混
凝剂作用下，磷酸根和某些阳离子(如Fe2+,Fe3+和 Al3+)进行化学反应,生成不溶于水的沉淀）
?
课题研究意义
菌株聚磷能力的比较
03
将菌体在缺磷培养液培养，将离心过的湿菌体悬浮于
富磷培养基培养，比较各菌株的聚磷能力。
聚磷特性研究
OD700
0.6
吸光
0.5
度 0.4
值
0.3
聚磷标准曲线
y = 0.43517x + 0.00542 R2 = 0.99973
0.2
0.1
0
0
0.5
1
1.5
磷浓度 ug/ml
聚磷特性研究
聚磷菌的分离鉴定及其聚磷特性的研究
汇报人：导师：企业导师：研究方向:
主要内容
（1）污水处理研究背景（2）课题研究意义（3）生物除磷机理（4）聚磷菌的分离纯化筛选（5）影响因素及条件优化（6）菌种的聚磷特性（7）全基因组测序及其聚磷基因研究（8）展望
氮、磷、钾等元素排入到地表水体，使藻类等水生生物大量地生长繁殖，水体中有机物积蓄，破坏水生生态平衡的过程，造成水体富营养化。
参考《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰氏细菌鉴定手册》。采用试剂盒法提取总DNA。 16S rDNA的通用引物： 27F（5’-AGAGTTTGATCM TGGCTCAG-3’）
1492R（5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’） PCR反应体系（25μ l）：模板2μ l，引物1492R 0.5μ l，引物27F 0.5μ l 2*Taq酶混合液（包含Mg2+) 12.5μ l 补无菌水到25μ l。扩增程序：94℃预变性10min；然后94℃变性40s，55℃复性 30s，72℃ 延伸90s进行30个循环；最后于72℃ 延伸10min。采用琼脂糖凝胶电泳检测，然后采用PCR纯化试剂盒（上海博彩生物科技有限公司），将PCR纯化产物直接送上海生工生物工程技术服务有限公司测序进行检测。最后根据所得的16S rDNA 基因核苷酸序列，输入GenBank 数据库，进行 Blast比对，获取16S rDNA基因序列相似度高的菌种。
若环境中的磷源仍有剩余时，仍能从外界吸收磷元素，这种对磷的积累作用大大超过微生物正常生长所需的磷量，可达细胞重量的6％-8 ％。以多聚磷酸盐的形式积累于细胞内作为贮存物质。