石蜡制片技术

石蜡制片技术［自己整理］

石蜡制片又叫永久制片，是观察植物组织构造常用的制片方法之一。其优点主要是适合各种植物组织的制片，切片的厚薄易于控制（最薄可达0.5微米），清晰度很好，亦适合作细胞学研究，并能够制成连续切片，制片易于长久保存，易于交流等。但制片周期较长，易受条件限制，制片中使用化学试剂较多，对人有一定毒害，易使材料变脆、变硬或变形，某些内含物易于消失，常使组织变小，甚至使组织扭转变形，细胞所含物质缩小而折光性增强，影响观察正确性，且制片成本较高等。虽然这样，但是石蜡制片仍不失为一种很好的制片方法，被人们常采用。

现将主要的基础理论和技术方法介绍如下：首先要明确,在这种条件下,植物的组织或部位不能直接用来切片,首先要按照该方法的要求,将材料进行程序化处理,终究要让所起填充作用的石蜡进入到材料的细胞中,然后带石蜡在切片机上进行切片,再染色、封藏。这样的程序中，中间过程是十分复杂的，往往随材料的不同，而方法有所不同，在实际工作中要不断地摸索,不断地总结,只有这样,才有可能做出好的片子。

选择切片材料是全部切片工作的第一步，如果选择的材料不适当或有错误，以后的工作将是没有意义的。选择材料时要注意具有代表性,植物的器官或器官的某一部位,其组织构造往往能够代表整个器官的基本情况,但不同部位,即便是同一器官,其组织构造,亦有一定的过渡差异,通常在选择材料时,要注意选择器官靠中间的部位作为试验材料,当然如果是作生长发育观察,则另当别论。因此选好试验材料，对于整个实验至关重要。

当选择好材料后，实验的主要过程有以下步骤：

材料的固定或软化——冲洗——脱水——透明——浸蜡——包埋——切片——贴片——烘片——脱蜡——二重染色——封片

⒉制片程序简介：

1)材料的固定或软化：最好用新鲜的固定材料（新鲜材料要迅速杀死植物细胞，最大程度保持组织和细胞的自然状态，这就是所说的杀死和固定）。干材料可先行软化（常用温水浸泡，勤换水，勿使材料腐烂）。一种固定液兼有杀死和固定双重作用，固定液能否迅速渗透于组织中，既与固定液本身的穿透能力有关，也因组织的致密程度有关，因此要根据材料的情况选择固定液，一般的固定液中，FAA固定液的作用较快（叶类材料至少4小时，或8－24小时、木类材料3天－一周），而含有铬酸的固定液作用较慢（叶类材料至少8小时，木类材料一周以上，期间最好更换一项固定液）。组织细胞的杀死和固定是同时发生的。所谓杀死是指在很短的时间内终止细胞的生命力；固定是指在杀死的同时，保存了组织细胞的构造基本上没有改变，其目的有一下几点：①防止组织细胞中细菌和酶的活动而引起霉烂。②减少组织细胞在以后程序中的收缩和变形。③植物细胞在生活状态下，有些结构模糊不清，经固定使各部分结构清晰可辨。④经过固定的材料，组织细胞容易着色。

2)注：冲洗：若为固定的材料，制片前用流水冲洗直至固定液被彻底置换干净。水溶性固定液要用水洗，特别是含有铬酸的固定液应用流水冲洗，醇溶性固定液，应以固定液中酒精浓度相等或相近的酒精洗涤。流水冲洗时以慢速流水进行冲洗，切忌流速太快使材料上下翻飞而使材料损坏；用酒精混合固定液固定的材料，用同浓度的酒精溶液更换洗涤；固定液中含有苦味酸，无论它是水溶性还是酒精溶液，一定要用酒精溶液洗涤；含有铬酸或其它金属离子的材料可流水冲洗4－24小时，以彻底清除金属离子。

3)脱水：经过冲洗或软化的材料，因组织内含有大量的水分，在以下的步骤中会有干扰，故须将水脱干净。通常预先配制好从10%—100%的梯度酒精溶液，在一定时间范围内逐级置换（注：梯度、时间要视材料的性质而定，不能一概而论），直至到达100%的酒精两次。注：梯度酒精脱水时间可按材料的大小、质地情况而定，如较幼嫩的根及根茎、茎、叶等材料，在70％一下浓度的酒精，一般2小时更换一次，70％以上的酒精约在4小时以上更换一次。

在一般情况下，材料应在70％酒精中过夜；坚硬的木质材料，每级度酒精需4－8小时；材料进入70％酒精以上时，每级度酒精要更换以－2次。

4)透明：因以下的步骤是使用脂溶性很强的石蜡，但以上最末步骤的纯酒精，亦不会与此相溶，因此本步骤的关键是选择一个界于二者之间的溶媒，以实现自然过渡。通常选择二甲苯与无水酒精配成梯度并在一定时间范围内逐级置换，直至达纯二甲苯两次。

5)浸蜡：使组织细胞内浸入石蜡，以填充组织间隙和细胞内，是以下各步骤的关键所在。以上步骤所选择的二甲苯可以和石蜡相溶，因此将二者配置成不同的梯度，并在一定的时间范围内逐级更换（注：本步骤可在恒温箱中进行），直至纯石蜡两次。

6)包埋：将材料与熔融的石蜡凝固在一起,叫包埋。这个过程要求动作要娴熟、快速、到位，通常所用的工具有镊子、酒精灯、包埋模具（金属或用纸自己折叠）、冷水等。在此过程中，要注意材料在蜡块中的位置，这与以后的各过程好坏有一定关系。

7)切片：将包埋好的蜡块修理成梯形（中央有材料），再将蜡块熔粘在特制的木块上，然后固定在旋转切片机上进行切片。将切下的蜡片用镊子摆放在深色的纸上（靠刀口面朝下）。若蜡带不直，则要修正蜡块的几个边，使之规则后再切；若连不成带状，说明蜡质过硬或室温过低；若卷片，说明刀口角度不适或刀钝感。

8)贴片：将切好的蜡片按需要分割成一定长短，用镊子夹放在预先准备好的温水上（水温以不会使蜡片熔散但要使蜡片充分展开为度），贴于预先清洗洁净的玻片上，用吸水纸吸去周围的水分，摆放在平盒中。

9)烘片：将贴好的片子连同平盒放于温箱中（温度以低于石蜡熔点约5度），以蜡片下水分充分蒸发，蜡片充分紧贴于玻片上为度。

j)脱蜡：将烘好的蜡片放置于纯二甲苯溶液中脱蜡（此为染片的第一步，在染色缸中进行），以材料周围洁净、清晰为度。

k)染色：脱蜡后，将片子转移至下一步。其步骤大致如下：片子（无蜡片）——二甲苯：纯酒精（1：1）——纯酒精——各级酒精——番红水溶液染色——水清洗（除去多余的染料）——各级酒精（脱水至95%酒精）——95%的酒精亮绿溶液二重染色（亦可用龙胆紫染色）——洗涤与脱水（95%—纯酒精）——透明（纯酒精：二甲苯1：1至2：1至纯二甲苯）——封藏（以加拿大树脂胶或光学树脂胶的二甲苯溶胶液封片）——烘片（在温箱中以低温约35度烘干或自然干燥）——贴签

个人经验：浸蜡和染色是重中之重。浸蜡我是这样搞定的，逐级石蜡替换二甲苯后，在温箱中将石蜡转移干净，再加新蜡，重复两三次；染色药摸索番红和亮绿的时间，总的来说番红染色能力强，亮绿弱的多。我有一个药材番红染了15min，亮绿8h，结果亮绿还是没染上，当然不排除染料本身的质量原因。所以这个时间一定要根据实际药材定。

我体会最深的就是包埋时位置的摆放，包埋好的话切片就会相对容易些，如果包埋不好在切片时补救就稍微费些劲。下面是我做组织培养材料时注意的几点，完全是我自己的体会，希望对你有帮助。包埋最主要的就是：1）对材料的判断，必须弄清楚到底要观察哪个部位；2）包埋时要分清材料的方向；3）包埋要快，千万不要等蜡凝了，那样会造成蜡块的断层，切片时就不能成连续的蜡带，有的还会毁掉材料。因此做之前最好先拿别的样练好手再作试验的材料。如果包埋位置未摆放正确，那就只能在修整蜡块时补救。就是在修整蜡块时，以材料为准，找出材料的上下左右，把蜡块修成材料在蜡块的正中央比较好。