微生物实验报告一

北方民族大学学生实验报告

院（部）生物科学与工程学院

姓名学号

专业生物工程班级

同组人员

课程名称微生物学类实验

实验名称产酶微生物的分离、纯化与选育

实验日期 2013.11 批阅日期

成绩教师签字

北方民族大学教务处制

产酶微生物的分离、纯化与选育

实验意义：

酶是生物体内进行生物化学反应的催化剂，在生物体中已发现的酶有2500多种。由于酶促反应的特异性强，反应温和，安全无毒，环境污染少，在洗涤剂、皮革、纺织、诊断、制药等领域具有广泛的应用价值。能由工业生产的50多种酶制剂蛋白酶、淀粉酶等，大部分是由霉菌、细菌、链霉菌和酵母菌生产的。通过本实验，学会从自然界中分离产酶微生物的方法，军中的纯化技术及其高产菌的选育技术。

1.蛋白酶产生菌的分离与纯化

1.1实验目的：学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化。

1.2实验原理

许多细菌和霉菌产生蛋白酶，细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品（或其他样品）悬液加热处理，杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌，将其接种到酪蛋白平板进行培养，根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养，分离筛选其他蛋白酶产生菌。

1.3实验仪器与材料

土壤样品或其他富含蛋白质的样品、牛肉膏蛋白胨培养基平板、酪蛋白平板、无菌水（带玻璃珠）、芽孢染色液；显微镜、恒温水浴锅、酒精灯、接种针、游标卡尺、无菌移液管、无菌试管、量筒等。

1.4实验方法与步骤

1.4.1配制酪素培养基：牛肉膏0.3g、NaCl 0.5g，酪素 1.0g，琼脂

2.0g，蒸馏水100mL 左右，调节pH 7.6-8.0。

1.4.1.1配制方法：称取酪素1g，先用少量2%NaOH润湿，玻璃棒搅动，再加适量的蒸馏水，在沸水浴中加热并搅拌，至完全溶解，补足水量至100mL，加入其他成分，调整pH值，灭菌备用。

1.4.2配制土壤样品：

1）采集土壤样品，用无菌水制备1：10土壤悬液。

2）取1：10土壤悬液5ml，然后将悬液按10-1、10-2、10-3、10-4梯度稀释，注入试管中。

3）将这些试管放入75-80 ℃水浴中热处理10 min，以杀死非芽孢细菌。

1.4.3灭菌与接种：

1）将培养基灭菌处理。

2）取加热处理过的土壤悬液100-200 μL，涂布接种到酪素培养基平板，将平板倒置，于30-32 ℃培养24-48 h。

1.4.4.蛋白酶产生菌的纯化：

1）根据酪蛋白平板的水解圈作初筛，挑选出单菌落的蛋白酶产生菌。

2）将挑选出的单菌落用平板划线法接种到牛肉膏蛋白胨培养基上，然后将平板倒置放于培养箱中24—48h。

1.4.5芽孢杆菌的染色判断

1）挑去菌落涂片固定。

2）滴加1——2滴孔雀绿染液于已固定的涂片上。

3）用木夹夹住载玻片在火焰上加热，使染液冒蒸汽但勿沸腾，切忌使染液蒸干，必要时可添加少许染液

4）倾去染液，待玻片冷却后水洗至孔雀绿不再褪色为止。

5）用番红水溶液复染1分钟，水洗至水为无色。

6）待干燥后，置油镜观察，芽孢呈绿色，菌体呈红色。

1.4.6蛋白酶产生菌的保存培养：

1）用斜面划线法，取纯化鉴定后的菌种接种于斜面上，放于培养箱中24—48h。

2）将培养后的菌种置于冰箱中保存。

1.5实验结果：

在含酪蛋白的平板上，产蛋白酶的芽孢杆菌可形成蛋白质水解圈。自然界中分离的微生物各菌株间产蛋白酶活力有很大差异，有些芽孢杆菌酶活力超过4000 U/mL。

1）描述你所分离的蛋白酶产生菌的菌落特征和个体形态特征；

答：第一组：A:原液培养基表面出现大面积菌落，难以挑出所需单一菌落；

B:10-1培养基表面菌落较多，但未发现与所需菌落相关特征；

C:10-4培养基表面基本未出现菌落：

D:10-2、10-3均发现与所需菌落特征相符的菌落，继续培养待进一步纯化。

第二组：A：原液培养基表面出现大面积菌落，难以区分

B:10-3培养基表面基本未出现菌落

C:10-4培养基表面基本未出现菌落：

D:10-1、10-2培养基表面均发现与所需菌落特征相符的菌落，继续培养待进一步纯化2）报告你所分离的蛋白酶产生菌的初筛（水解圈与菌苔直径的比值）结果。

答：求的平均HC值=1.7

1.6注意事项

1）土壤悬液加热处理的温度和时间应准确控制；

2）点接含酪蛋白的平板时，接种量及接种面积要基本相同。

1.7分析与讨论

在酪蛋白平板上水解圈与菌落直径比值大的菌落，其蛋白酶活力不一定大，因此，对初筛选出的水解圈与菌落直径比值大的菌落要进行发酵培养，进一步对发酵液进行酶活力测定。1.8思考题

1）对所筛选的菌株如何进一步提高酶活力？请写出设想和方案；

答：选用蛋白酶产量较高的原始菌种，扩大培养后，采用低浓度的菌悬液，进行紫外线时间梯度照射，选取一个突变率较高，成活率也较高的时间，大批量的进行紫外照射诱变，然后在明胶固体培养基平板上筛选水解圈较大的菌株接种，培养后测定水解酶活性，进一步筛选出高产菌株。

2）蛋白酶有哪些方面的应用。

答：蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产。

2.产酶微生物菌种的选育

生物的遗传信息的改变是通过基因突变、基因重组和基因转移来进行的。基因突变，又称点突变（point mutation），包括自发突变和诱发突变，前者是未经人为施加诱变剂处理而发生的突变，后者是经人为施加诱变剂处理而获得的突变。两种突变都是由于一个或几个碱基的增加、缺失或置换而引起的，因此本质相同，不同的只是诱发突变的频率比自发突变的频率要高得多。这一部分的实验是以紫外线为例介绍了物理因素对微生物的诱变作用。本实验中，学生将筛选出的蛋白酶的产生菌株作为出发菌株通过紫外线即物理因素对微生物的诱变作用，对以上菌株进行选育工作。特以蛋白酶产生菌株作为出发菌株，经过紫外线的