农业转基因生物检测技术的初步研究-转基因检测方法

及其产品、要不要科学和社会文明 进步的问题。他们的根本出发点是要禁止一切生物技 术！ 而我们则是在保证环境和人类健康的同时促进生物技术的发展，这是两者的根本区 别所在 （ 贾士荣， ２ ０ ０ ２ ） ．
１ ． ５转基因产品的检测
鉴于转基因产品具有重大的社会经济效益， 转基因产品的检测鉴定目 前已成为各主 要贸易国的一项重要工作。
１ ． ４ 前景分析
任何技术都是双刃剑，本身并无好坏之分。应用得好，可以造福人类，反之，就会 带来问题。将转基因技术应用在生物农业上，反对的理由主要有两种，一种认为转荃因 技术突破了物种界限，与宗教观念相违背；另一种则认为转基因可能会带来这样那样的 新问题。 但是，人类对新事物的认识是在发展过程中逐步加深的。大多数科学家都赞同 谨慎研究发展的观点。 我们应该在保证环境和人类健康的同时促进生物技术的发展。 与世界上出现的任何新生事物一样， 转基因作物的发展决不会一帆风顺，但是前途 依然是光明的。归结到一点，今天我们与反生物技术组织的争论，是要不要转基因作物
根据国家总局的安排，检测技术先做定性检测，再做定量检测．先解决是否为转基 因产品， 再确认为哪一类转基因产品． 我国己先后建立起检测转基因产品核酸的Ｐ Ｃ Ｒ定 性、 定璧检测，定量检测方法如 “ Ｃ Ｔ Ａ Ｂ － Ｐ Ｃ Ｒ － Ｒ Ｆ Ｌ Ｐ ” 法、 Ｐ Ｃ Ｒ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法 （ 赵文军等， ２ ０ ０ １ ） ，荧光 Ｐ Ｃ Ｒ（ 刘光明， 王群力等， ２ ０ ０ １ ） ，实时荧光定盘 Ｐ Ｃ Ｒ法（ 马荣群， ２ ０ ０ ２ ） 等， 检测转基因蛋白 质成份的试纸条法和酶联免疫方法等，并成功地应用于进出口 转基因产 品的检侧之中， 尤其是烟草的转基因检测 （ 贾建军， 周晓黎， ２ ０ ０ ２ ） 。 一些新的检测技术 如适应于多荃因同时检测的基因芯片技术、 分枝探针、 肤核酸正在研制中（ 朱水芳， ２ ０ ０ １ ） ， 荃因芯片技术已取得突破性进展，对转基因产品核酸和蛋白质以外成份的检测也在试验 之中． 这些枪铡方法基本上反应出了目 前国际转荃因产品检侧水平。国家检验检疫局植 物检疫实验所利用生物芯片技术的原理，己摸索出一种 “ 亲和吸附一一一Ｐ Ｃ Ｒ －
多 重Ｐ Ｃ Ｒ （ Ｍ ｕ ｌ ｔ ｉ ｐ ｌ ｅ ａ Ｐ ｏ ｌ ｙ ｍ ｅ ｒ ａ ｓ ｅ Ｃ ｈ ａ ｉ ｎ Ｒ ｅ ａ ｃ ｔ ｉ ｏ ｎ ， Ｍ Ｐ Ｃ Ｒ ） ： 也称复合Ｐ Ｃ Ｒ ， ， 是一种
特殊的Ｐ Ｃ Ｒ技术，比单一Ｐ Ｃ Ｒ反应更快捷，更经济，只需 １ 次Ｐ Ｃ Ｒ反应， 就能同时检 测多个靶荃因。多重 Ｐ Ｃ Ｒ技术在动物病毒性传染病检测中应用较多（ 谢芝勋， 庞尼珊 等， ２ ０ ０ １ ） 而在转基因成分定性（ 陶展， 杨胜利， ， ２ ０ ０ ０ ） 与定量（ 刘光明， 王群力， ２ ０ ０ １ ） 检测中的 应
Ｈ ｙ ｂ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ ＂ 检测新方法， 这种方法和国际己 知的同 类Ｐ Ｃ Ｒ方法相比， 解决了 转墓因 检
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（ Ｃ ａ ｒ ｏ ｌ ｙ ｎ ｄ ｈ ， Ａ ｎ ｇ ｕ ｓ ｋ ， １ ９ ９ ９ ， Ｖ ｏ ｌ ｌ ａ ｎ ｂ ｏ ｆ ｅ ｒ ｓ ， Ｂ ｕ ｒ ｇ ｋ ， １ ９ ９ ９ ） ． 瑞士的Ｍ ｅ ｙ ｅ ｒ 等（ １ ９ ９ ５ ） 用Ｐ Ｃ Ｒ 法定 盆 检 测Ｃ ａ ｌ ｇ ｅ ｎ ｅ 公 司的 转基因马 铃薯 （ Ｆ Ｉ ａ ｖ ｒ Ｓ ａ ｖ ｒ Ｔ Ｍ ） 中 的Ｃ ａ Ｍ Ｖ ３ ５ Ｓ 启动子 和ｎ ｐ ｔ Ｉ 标记 基
对转基因食品贸易进行管理， 协议首次规定了 各国在装运进出口 货物时，必须对可能含
有 转基因 食品 的 货 柜贴上明 细 标 签．出 于 对 转基因 食品 安 全性的 关 注， 欧盟于 ２ ０ ０ ０ 年４
月起要求含 １ ％以 上转基因成分的产品都必须贴有标签， 日 本也将于 ２ ０ ０ １年实行标签制 度。详见附录 ２ ．
用报道还不多。
Ｇ ｅ ｎ ｅ － Ｓ ｅ ａ ． 法：（ 草文， 董洁等，２ ０ ０ １ ） ：该方法主要用于食品中转荃因成分的检测。 由 于食品的成分比 较复杂，加之经不同的加工工艺处理，使其很难提取出较为完整的高 浓度的重组 Ｄ Ｎ Ａ ， 采用定性 Ｐ Ｃ Ｒ也很难检测出转基因成分， 故必须借助 Ｄ Ｎ Ａ测序仪中 Ｇ ｅ ｎ ｅ － Ｓ ｃ ａ ｎ 的功能，将定性Ｐ Ｃ Ｒ的结果进行软件分析，在特定的波段观察其波峰情况。 该方法如果要广泛推广应用， 还有不少工作有待完成。
因成分。
１ ． ５ ． １ ． ３ Ｐ Ｃ Ｒ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法 Ｐ Ｃ Ｒ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法是利用地高辛或生物素等标记引物， 扩增产物被固相板上特异的探针 所结合，再加入抗地高辛或生物素酶标抗体一辣根过氧化物酶结合物，最终酶使底物显 色．高灵敏度 Ｐ Ｃ Ｒ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ法是将Ｐ Ｃ Ｒ扩增的高效性和Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ的高特异性结合在一起， 灵敏度高达 ０ ． １ ％，足以 达到欧盟的要求（ 转基因检测闭值为 １ ％ ） ． Ｐ Ｃ Ｒ － Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测转基
１ ． ３ ． ２ 国内对转基因生物安全性的管理政策
１ ９ ９ ３ 年１ ２ 月２ ４日以中华人民 共和国国家科学技术员会第 １ ７ 号令．发布 《 基因工 程安全管理办》 ，此后，农业部以 《 基因工程安全管理办法》为基础，于 １ ９ ９ ６ 年７ 月颁 布了 《 农业生物基因程安全管理实施办法源自文库 。 ２ ０ ０ １ 年５ 月９日， 国院第 ３ ０ ４ 号令公布 《 农 业转基因生物安全管条例》 ， 共８ 章５ ６ 条， 条例规定“ 在中华人民和国境内 从事农业转基 因生物的研究、 试验、产、 加工、 经营和进口、出口 活动， 必须遵守本例” 等等。 进一步 明确了我国在农业转基因理方面的政策和体系。 我国农业部颁布的 《 农业转基因生物标识管理办法》规定从 ２ ０ ０ ２ 年３ 月２ ０ 日 起， 凡在中国境内销售的大豆、玉米等及其制品若属转基因产品必须进行标识。有关具体实 施办法见附录 １ ．
东北农业大学理学硕士学位论文
尽水平、食品加工过程对食品安全性产生的影响和潜在的食物营养和成分的改变。在致 敏性方面， 建议常见的致敏食品不要进行基因转移。建议加强方法学研究和动物试脸方
法。 ２ ０ ０ １ 年１ 月． 全球 １ １ ３ 个国家在加拿大蒙 特利尔通过了 一项历史性协议， ‘ 同 愈今后
１ ． ５ ． １ 转基因产品的检侧方法
目 前国内外对转基因成分的检测方法主要包括 Ｄ Ｎ Ａ检测法和蛋白质检测法：
１ ． ５ ． １ ． １ Ｄ Ｎ Ａ检侧法
材料与方法
对转基因产品进行 Ｄ Ｎ Ａ检测，即检测转基因生物墓因组中是否含有外源墓因，方 法有定性Ｐ Ｃ Ｒ 、定皿 Ｐ Ｃ Ｒ ． Ｄ Ｎ Ａ测序、Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｅ ｒ ｎ 以 及近来快速发展的基因芯片法。 定性Ｐ Ｃ Ｒ方法： 定性 Ｐ Ｃ Ｒ方法是最常用、 最经典的检测 Ｄ Ｎ Ａ的方法， 它通过所设 计的引物，在最佳条件下将目的Ｄ Ｎ Ａ片段按照 ２ ０ 扩增，从而大大提高了Ｄ Ｎ Ａ的浓度． 但是由于该方法本身可能存在的假阳性现象，使得有其局限性。用该方法所得的结果往 往需要用另一方法进行验证。 定ｆ Ｐ Ｃ Ｒ方法：定量 Ｐ Ｃ Ｒ检测转基因方法是适应欧盟所提出的对转墓因作物或转 墓因食品的允许量在 １ ％以下而建立的方法。该方法在转墓因定ｉ ｔ上的应用大致在 １ ９ ９ ７ － １ ９ ９ ８ 年间， 德国的科学家对该方法进行了 扩展， 从而通过拷贝数可以计算出转基因的 含Ｉ ｔ．定ｆ Ｐ Ｃ Ｒ方法因为是在定性 Ｐ Ｃ Ｒ方法的基础上加入了一条或多条探针，从而降 低了 假阳性的概率， 增强结果的可靠性； 更重要的是通过所加入的 探针， 在反应时其集团 发出的荧光可以对转基因的含量进行定量。深圳检验检疫局已 经率先在我国建立了 转基 因定里检测方， 。 并在转基因饲料检测上进行了 应用。 辽宁检验检疫局、 广州检验检疫局 和国家检验检疫局动植物实验所亦在转基因产品的定量检测方面取得了可喜的进展。 荧光 Ｐ Ｃ Ｒ （ Ｆ ｌ ｕ ｏ ｒ ｅ ｓ ｃ ｅ ｎ ｃ ｅ Ｐ Ｃ 民Ｆ Ｐ Ｃ Ｒ ） ： 荧光Ｐ Ｃ Ｒ技术集 Ｐ Ｃ Ｒ和探针杂交技术的 优 点位一体， 直接探测Ｐ Ｃ Ｒ过程中的荧光变化， 可获得 Ｄ Ｎ Ａ模板的准确定量结果， 是目 前最先进的 Ｐ Ｃ Ｒ技术， 将Ｆ Ｐ Ｃ Ｒ技术用于转基因产品的检测，无疑会有很高的研究和 实用价值。 实时定ｆ Ｐ Ｃ Ｒ法（ Ｃ ｈ ｒ ｏ ｓ ｔ ｉ ａ ｎ ａ Ｈ ， ｅ ｔ ａ ｌ １ ９ ９ ６ ， Ｋ ｎ ｕ ｔ Ｇ ， Ｂ ｅ ｒ ｄ ａ ｉ ， ｅ ｔ ａ ｌ ． ２ ０ ０ １ ） ： 该法检测转基 因产品，操作简单，省时省力，结果可靠、准确性高。该方法利用特异性荧光探针实时 监测目的基因的扩增，同时循环参数（ Ｃ ｔ 值） 和ＰＣＲ 体系中起始ＤＮＡＸ的对数值之 间有严格的线性关系。利用阳性标准样品的Ｃ七 值， 制成标准曲 线， 再根据未知样品的Ｃ ｔ 值就可以准确确定起始ＤＮＡ的数量。高纯度探针和适宜的镁离子浓度是该方法准确 定童的关键．实时定量ＰＣＲ 方法有效地解决了 其他定量方法所存在的假阳性及定量准 确度不高的难题。
东北农业大学理学硕士学位论文
本身也存在灵敏度低，检测时间长，花费高等缺点，因此它往往应用于基因转化的科研 工作中， 而不适用于口岸上对产品中转基因的检测， 基因芯片法（ 王关林，２ ０ ０ ２ ） ：是将成千上万的荃因探针排列在固定相支持物硅片或 尼龙膜上， 通过与荧光素或同位素标记的待检样本杂交后，对杂交信号分析反映样本信 息。该法的优点是所包含的检测信息量大，可以一次性对数万种转基因成分进行检测， 但存在价格昂贵、稳定性差等缺点． 在Ｄ Ｎ Ａ检测的诸多方法中， Ｐ Ｃ Ｒ方法检测转基因产品是目 前应用最为广泛的方法， 被认为适合用于各类转基因产品包括原料和经过加工的制成品的定性和定ｔ检测
因产品所需仪器简单、易于操作，杂交检测可自动化，适合大批量检测。
目 前在口 岸检测实际工作中， 定性Ｐ Ｃ Ｒ － 酶切、 定性Ｐ Ｃ Ｒ － 测序、 定量Ｐ Ｃ Ｒ和Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 等方法较为常用。
１ ． ５ ． ２ 我国的转基因产品检测技术研究进展 （ 谢 为 龙 栋其 文 等 ， ２ ０ ０ ２ ）
因， 并测定了转基因马铃薯食品中的转基因成分的含量； 这是世界上第一例Ｐ Ｃ Ｒ法定量 检测转荃因产品的报道。 此后， 世界上已有不少学者报道了利用 Ｐ Ｃ Ｒ法检测的转基因 产
品。
１ ． ５ ． １ ． ２ 蛋白 质检测法
蛋白 质检测方法最常用的是Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ检测方法． 该方法具备特异性高、 快速、 耗费低 等特点，但该方法的灵敏度不够高，且即使是检测出阴性结果也不表明该样品不含转基
Ｄ Ｎ Ａ侧序： 目 前应 用最多的Ｄ Ｎ Ａ测 序技 术是Ｓ ａ ｎ ｇ ｅ ｒ 等 提出 的 双脱 氧链终止法。 该
方法准确、可靠，在转基因检测中常作为 Ｐ Ｃ Ｒ验证方法。 Ｓ ｏ ｕ ｔ ｈ ｅ ｒ ｎ Ｂ ｌ ｏ ｔ 法：Ｄ Ｎ Ａ杂交方法是最经典的方法．也是最可靠的方法，但该方法