组织裂解液和细胞裂解液的配制

组织裂解液和细胞裂解液如何配制?

一、细胞裂解液配制

方法一

一、试剂准备

1、新鲜配制冷的RIPA 裂解缓冲液:

150 mM NaCL

1% NP-40 (去垢剂)

0.1% SDS (去垢剂)

2ug/ml Aprotinin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)

2ug/ml Leupeptin (蛋白酶抑制剂) (使用前加入)

1 mM PMSF (蛋白酶抑制剂)

1.5 mM EDTA (蛋白酶抑制剂)

1mM NaVanadate (磷酸脂酶抑制剂)(任选)

以上所有试剂均按比例溶于150 mM NaCL溶液中。

2、冷的PBS 中加入1 mM PMSF

1.5 mM EDTA

1mM NaVanadate （钒酸钠）(任选)

3、对数期生长状态佳的细胞，75cm至少3-4瓶（90%以上生长面积）。

二、实验步骤

1、将长满细胞的培养瓶放置在冰上，用吸液管吸出培养液。加入足够的冷的PBS在培养瓶中充分洗涤细胞表面，以洗去瓶中残留的培养基，倒掉PBS ，重复以上操作2-3遍。在最后一次洗涤中尽可能吸干残留的PBS，尽量在冰上操作。

2、向培养瓶中加入冷的RIPA 裂解缓冲液(每75cm2 培养瓶加1ml). 然后用细胞刮子沿着瓶壁开始刮细胞，如果所需要刮的同种细胞有多瓶，则将第一瓶刮下的细胞液吸出转入下一瓶中继续刮(由于处理后的细胞裂解液较粘稠，所以宜用直径大点的吸液管吸取)。

3、吸出刮好的细胞裂解液置于14ml 离心管中（置于冰上），然后重复步骤2以刮取剩下的细胞。

4、尽可能将多的细胞裂解液收集到14ml的离心管中，样品插入冰盒进行超声，超声强度以不产生泡沫为准，超声每次2-3秒，重复3-4次。如仍有细胞碎片或沉淀，应离心10000rpm,10分钟，留取上清。

5、取出小量细胞裂解液测其蛋白浓度（用Biorad Bradford 试剂盒或紫外分光光度计，在A280测定），分装保存在-70℃。

4方法二

NP-40 or Triton-100 1%

TrisHCl (pH 8.0) 50mmol/L

NaCl 150mmol/L

PMSF（苯甲基磺酰氟）0.1mmol/L(100µg/ml)

Pepstatin(胃蛋白酶抑制剂) 1 µmol/L(0.7µg/ml)

Leupeptin（亮抑制肽）0.5mg/ml

Aprotinin（抑蛋白酶肽）0.3µmol/L(1µg/ml)

（注：PMSF 贮存液：100mmol/L即17.4mg/ml于异丙醇中；

Aprotinin 贮存液：10mg/ml溶于0.01mol/LHEPES(pH8.0);

Leupeptin 贮存液：10mg/ml溶于水中；

Pepstatin 贮存液10mg/ml于甲醇液中.均于-20℃保存）

裂解操作程序：

* 离心收集1×107个细胞

* 加入4℃预冷1%NP-40裂解液100µl

* 剧烈震荡使细胞充分悬浮混匀（如为组织进行匀浆）

* 4℃放置15~30min

* 4℃离心，15 000rpm,10min，取上清备用。

方法三

•细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性

•推荐RIPA buffer:

•. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系

•· 150 mM NaCl 等渗体系

•· 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂

•· 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂

•· 5 µg/ml Aprotinin （抑肽酶）蛋白酶抑制剂

•· 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂

•· 1% Triton x-100 破坏细胞

•·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂

•细胞裂解液的主要目的：1.利用去污剂破坏脂质双分子层，破裂细胞；2. 溶解蛋白；3. 蛋白变性使其稳定；4. 抑制蛋白酶活性

•推荐RIPA buffer:

•. 50 mM Tris-HCl pH 7.4 缓冲体系

•· 150 mM NaCl 等渗体系

•· 1 mM PMSF 强大的蛋白酶抑制剂

•· 1 mM EDTA 变性剂和稳定剂

•· 5 µg/ml Aprotinin 蛋白酶抑制剂

•· 5 µg/ml Leupeptin 蛋白酶抑制剂

•· 1% Triton x-100 破坏细胞

•·1% Sodium deoxycholate 中度变性剂和蛋白溶解剂

•·0.1% SDS 强变性剂和蛋白溶解剂

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•其中PMSF等蛋白酶抑制剂最好另外配制，－20℃保存，用前混合。蛋白酶抑制剂较贵，如果你的经费有限，可以仅用PMSF试一试，能出结果就可以。•用于普通的Western、IP或co-IP，我们推荐使用Western及IP细胞裂解液(P0013)，该裂解液已被国内各大研究机构广泛使用，用户普遍反映很好。裂解细胞或组织后，没有非常粘滞的透明状DNA团块形成，不必采用超声处理等就可以非常理想地用于后续操作。另外该裂解液裂解的产物也适合用于磷酸化蛋白的Western检测。对于某些特殊蛋白的IP，如果发现Western及IP细胞裂解液(P0013)效果不是非常理想，可以尝试用RIPA裂解液(强、中或弱)或NP-40 裂解液。如果发现IP的时候背景很高，即非特异的蛋白也被IP下来，则需要选用裂解强度较高的裂解液，例如RIPA裂解液(强或中)。如果发现目的蛋白无法被IP下来，则说明裂解液的强度过强，可以使用较为温和的裂解液例如RIPA裂解液(弱)或NP-40裂解液。对于某些难溶解蛋白的Western，如果发现Western及IP细胞裂解液效果不是非常理想，可以尝试使用裂解强度更高的裂解液,例如RIPA裂解液(强、中)或SDS裂解液。

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•RIPA裂解体系：150 mmoL/L Nacl，1.0% NP-40或Triton-x-100 ，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS，50 mmoL/L Tris ( ph8.0)。