两种裂解液的成分和配制步骤

两种裂解液的成分和配制步骤 标签：细胞裂解液裂解液组织裂解液 摘要 : 细胞裂解液的成分包括了 Tris-HCl、EDTA 和 NaCl。组织裂解液的成分主要 是 Urea、thiourea、CHAPS 等。除了蛋白提取裂解液外，上述两种裂解液在一些实 验中的用途也不可小觑。本文介绍这两种裂解液的配方和配制过程。 组织裂解液配 方：` 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea(76.12) 1.5224 g 100mM DTT 0.1543 g 4% CHAPS 0.4 g 0.5mM EDTA 0.00146 g 40Mm Tris 0.0485 g 广州赛诚生物基因表达调控专题 Qiagen：10 个窍门助你更好掌控 qPCR 实验 沐赛生物:快速建立基因敲除细胞系 细胞裂解液的成分包括了 Tris-HCl、 EDTA 和 NaCl。 组织裂解液的成分主要是 Urea、 thiourea、 CHAPS 等。除了蛋白提取裂解液外，上述两种裂解液在一些实验中的用途也不可小觑。本文介绍这两种裂解 液的配方和配制过程。 组织裂解液配方：` 7M Urea(60. 06) 4.2042 g 2M thiourea(76.12) 1.5224 g 100mM DTT 0.1543 g 4% CHAPS 0.4 g 0.5mM EDTA 0.00146 g 40Mm Tris 0.0485 g 2%(v/v) NP-40 0.2 ml 1%(v/v) Triton X-100 0.1 ml 5mM PMSF 用前加 0.00871 g 2%pharmalyte 0.2ml 共 10ml 分装成 400µl/每管(可应用于 30-80 毫克组织裂解) 注：已配好分装成 400µl/每管可供应用 不需另配!!! 细胞裂解液配方： 6M Urea(60. 06) 1.8018 g 2M thiourea(76.12) 0. 7613 g 65mM DTT 0.050 g 4% CHAPS 0.2 g 40Mm Trisbase 0.02425 g 共 5ml 分装成 200µl/每管(可应用于 50-100ml 培养瓶内的细胞裂解) 1、溶液准备 2×样品缓冲液：130mM Tris-HCl ( pH8.0 ) , 20% ( v/v ) 甘油 , 4.6% ( w/v ) SDS , 0.02% 溴 酚蓝 , 2% DTT PBS ( pH7.4 ) ：10mM Na2HPO4 , 1.8mM KH2PO4 , 50mM NaCl , 2.7mM KCl RIPA 缓冲液：50mM Tris-HCl(pH7.4) , 150mM NaCl , 1mM EDTA , 1%Triton×100 , 1%去氧胆酸钠 , 0.1%SDS , 1mM PMSF , 1μ g/ml 牛胰蛋白酶抑制剂 ( aprotinin ) , 1μ g/ml 亮抑蛋白酶肽 ( leupeptin )

裂解液缓冲液：10mM Tris-HCl(pH7.4) , 0.15M NaCl , 5mM EDTA(pH8.0) , 1%Triton×100;使用前 加 5mM DTT,0.1mM PMSF 异丙醇和 5mM ε -氨基己酸 2、裂解液的制备 制备细胞裂解液： 收集胰蛋白酶消化的细胞并离心，用 PBS 清洗。 用 100μ l RIPA 缓冲液冰浴溶解沉淀 10min(每 500000 个细胞 20μ l RIPA 缓冲液)。 10000rpm，4℃离心 10min，取上清转移至新管。 用考马斯亮蓝法检测蛋白质浓度。 用裂解缓冲液将溶液浓度调到 5mg/ml，每小瓶中放 100μ l，-80℃储存。 按照 1：1 体积比混合 2×样品缓冲液，煮沸 5min 后，室温放置 5min。 短时离心后点样电泳检测。 制备组织裂解液： 在制备过程中一直将溶胞液或组织放在冰上。 切开组织，称取组织 1.5g 于 PBS 中清洗。 在 RIPA 缓冲液中剪碎组织后，转移到匀浆器中，加足 5ml RIPA 缓冲液，研磨 20min。 将研磨液转移到 1.5ml 的离心管中，14000rpm，4℃离心 10min。 取上清液作为完整的组织裂解液。 用考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度。 用裂解缓冲液将溶液浓度调到 5mg/ml，每小瓶中放 100μ l，-80℃储存。 按照 1：1 体积比混合 2×样品缓冲液，煮沸 5min 后，室温放置 5min。 短时离心后点样电泳检测。 需要注意的是，为了减少以及杜绝核酸降解，样品被彻底匀浆之前的步骤需要多加留意。还有就是短 时离心后点样电泳检测。让样品从脱离原来的生存环境的时间尽量缩短。