酶免疫分析技术

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二、酶wk.baidu.com酶底物
标记酶的要求：
①活性高，纯度高 ②作用专一性强 ③性质稳定，易与抗原或抗体偶联 ④测定方法简便易行、敏感、精确 ⑤酶和底物对人体无害 ⑥酶和底物价廉易得
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（一）辣根过氧化物酶
（horseradish peroxidase ,HRP）
1.ELISA中应用最为广泛的标记用酶
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2．戊二醛交联法 戊二醛分子中有两个相同的醛基，可分别与
酶和抗体（抗原）分子上的氨基结合。该法有一
步法和二步法。二步法标记效率比一步法高，酶 标记物质量较均一。
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（二）酶标记物的纯化与鉴定 1．酶标记物的纯化 标记完成后应除去反应溶液中的游离酶、游 离抗体(抗原)、酶聚合物及抗体(抗原)聚合物，
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目
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录
概述 酶联免疫吸附试验 酶联免疫吸附试验的应用和注意事项 其他酶标记免疫测定技术
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酶免疫分析技术的分类
酶免疫组织化学技术 酶放大免疫测定技术 酶免疫分析技术 酶免疫测定技术 非均相酶免疫测定 液相酶免疫测定 均相酶免疫测定 克隆酶供体免疫测定 固相酶免疫测定
避免游离酶增加非特异显色以及游离抗体(抗原)
的竞争作用。 常用的纯化方法有葡聚糖凝胶层析法和饱和 硫酸铵沉淀法等。
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2.酶标记物的鉴定 （1）免疫活性鉴定：常用免疫电泳或双向免疫扩
散法，出现沉淀线表示结合物中的抗体 (抗原)具有
免疫活性。 （2）酶标记率测定：用分光光度法分别测定结合 物中酶和抗体(抗原)蛋白的含量，然后按公式计算 其标记率。
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邻苯二胺 OPD
四甲基联苯胺 TMB HRP常用底物
5-氨基水杨酸5-ASA
2,2′-氨基-二(3-乙基-苯并噻唑 啉磺酸-6)铵盐 ABTS
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OPD反应后显橙黄色，加酸终止反应后呈棕黄 色，测定波长492nm。不稳定，有致癌性。
TMB反应后显蓝色 ，加酸终止反应后变为黄色,
测定波长450nm ，稳定，无致癌性，ELISA中 应用最广泛的底物。
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（二）碱性磷酸酶
（alkaline phosphatase，AP)
是一种磷酸酯水解酶，从大肠杆菌提取
AP的 底物 对-硝基苯磷酸 酯（ pNPP ） 经AP作用后的产物为黄色对 硝基酚，最大吸收峰波长为 405 nm。
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四、固相载体
（一）固相载体的要求 ①结合抗体(抗原)的容量大，结合稳定；
②可结合抗原或抗体及亲和素或链霉亲
和素等大分子；
③固相化后分子仍应保持活性；
④固相化方法应简便、快速。
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（二）固相载体的种类 1．塑料制品 由聚苯乙烯、聚氯乙烯制成。形状
主要有微量反应板、小试管和小珠三种。
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双抗体夹心法检测抗原
底物
标本（含抗原）
固相抗体
酶标抗体
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2．技术要点 （1）将特异性抗体包被于固相反应板上，洗涤。 （2）加待检标本,温育，洗涤。
（3）加酶标抗体，洗涤。
（4）加底物，根据颜色反应的程度进行该抗原的 定性或定量。
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双抗体夹心法测抗原
2．微颗粒 或颗粒。 3.微孔虑膜 是一种多孔薄膜过滤材料，包括硝酸 微颗粒是由高分子单体聚合成的微球
纤维素膜（NC）、尼龙膜和玻璃纤维素膜等。
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微量反应板
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第二节
一、基本原理
酶联免疫吸附试验
将已知抗原或抗体吸附在固相载体表面， 使抗原抗体反应在固相表面进行，用洗涤的方法 将固相上的抗原抗体复合物与液相中的游离成分 分开。加入酶的底物后，通过酶对底物催化的显
氧化酶、6-磷酸葡萄糖脱氢酶、溶菌酶、青霉
素酶、脲酶、苹果酸脱氢酶等。
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三、酶标抗体(抗原)的制备
制备要求： 抗原要求纯度高、抗原性强。 抗体则要求特异性强、效价高、亲和力强、 易于分离纯化和批量生产。
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（一）常用的标记方法
标记方法要求：
①方法简单，产率高 ②不影响酶和抗体(抗原)的生物活性
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第一节
一、基本原理
概述
酶免疫分析技术的原理是利用酶标记抗体 (抗原)形成酶标抗体(抗原)结合物，此结合物既 保留抗体(抗原)的免疫活性，又保留了酶对底物 的催化活性。酶标抗体(抗原)与相应抗原(抗体)
进行反应后，酶催化相应的底物显色，借助酶作
用于底物的显色反应来判定结果。
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色反应程度，对标本中抗原或抗体进行定性或定
量。
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二、酶联免疫吸附试验的类型
（一）双抗体夹心法检测抗原 1.原理 将己知抗体包被固相载体，待检标本中的相 应抗原与固相表面的抗体结合，洗涤去除未结合
成分。然后再与抗原特异的酶标抗体结合，形成
固相抗体-抗原-酶标抗体复合物，根据加底物后 的显色程度确定待检抗原的含量。
2.糖蛋白（主酶） 主酶与酶活性无关 亚铁血红素（辅基） 辅基是酶的活性中心
3.RZ值：403nm(辅基)与275nm(主酶)OD值之比
4.RZ值与酶活性无关，酶活性单位比RZ值更为重要
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HRP催化的反应式为：
DH2十H2O2—D十2H20 DH2为供氢体，习惯称为底物，H2O2为受氢体 HRP对受氢体的专一性很高，作用底物有多种。
③所得酶结合物稳定，本身不发生聚合
④较少形成酶与酶、抗体与抗体或抗原与抗原的
聚合物
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1．过碘酸钠氧化法 仅用于HRP的标记。可与抗体蛋白的游离氨 基结合，形成HRP-CH2-NH-IgG。此法酶标记物
产率较高，但纯化后仍有少量游离IgG，部分结
合物可能聚合，抗体的活性可能有所降低。
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（三）β-半乳糖苷酶
（β-galactosidase，β-Gal）
源于大肠埃希菌 ，常用于均相酶免疫测定。
β-Gal 的底物
4-甲基伞酮基βD半-乳糖苷 （ 4MUG ）
酶作用后，生成高强度荧 光物 ，用荧光计测量。
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（四）其他酶 在商品试剂中，经常应用的酶还有葡萄糖