急性毒性试验[1]

实验一急性毒性试验(Acute Cytotoxicity Test)

一、实验目的：

了解生物材料急性毒性的含义，掌握急性毒性试验的基本方法。

二、实验原理：

医学上通常指的急性毒性试验是对药物而言的，并以半数致死量（median lethal dose, LD50）来衡量药物急性毒性的大小。所谓LD50是指某一药物使试验动物总体死亡一半的剂量，由于LD50是剂量反应曲线上最敏感的一点，而且有易测、准确和重复性好的优点，以此作为药物使用的安全指标。但对于生物材料而言，它与药物在体内的反应机理不同，大多数生物材料不能计算LD50，所以在试验过程中，通过对实验动物进行动物静脉或腹腔注射试验材料或其浸提液来观察实验动物体重在24、48和72h的变化、运动、呼吸状态以及死亡情况作为评价的指标，判定某种生物材料的急性毒性作用。

三、实验对象：小鼠

四、实验器材和药品：

聚甲基丙烯酸羟乙酯（PHEMA），蒸馏水，生理盐水（0.9％），注射器（1ml），量筒（10ml），小烧杯（50、100ml），高压消毒器。

五、实验步骤：

1．浸提液制备：

按评价标准裁剪试样，选择适当浸提温度制备浸提液。

2．将10只体重在17～23g间的健康、未做过其他实验的小鼠随机分为实验组和对照组，每组5只。

3．将浸提液按每公斤小鼠体重注射50ml于实验组小鼠尾静脉（50ml/kg），用生理盐水按同样方法作空白对照。

4．记录试样表面积和使用浸提液的容量；记录注射后24h、48h、72h两组小鼠的体重，观察其各种生物学反应情况。

六、评价方法：

2．结果判断标准：

2．1 在72h观察期内，注射材料浸提液的动物反应不大于对照组动物，则认为该材料符合急性毒性试验要求。

2．2在72h观察期内，注射材料浸提液动物中有2只以上出现轻度毒性症状或仅1只动物出现明显毒性症状死亡，或实验组5只动物的体重均下降，即使无其他中毒症状都要进行重复试验。

2．3 重复试验的动物数量应加倍，即每组需10只小鼠。浸提液应该重新制备。重复试验若符合2．1 项要求，则认为该材料合格。

2．4 如实验组动物有2只以上发生死亡或3只以上出现明显毒性症状或动物普遍出现进行性体重下降，则不需要重复试验，可认为该材料不符合急性毒性试验要求。

附：小鼠静脉注射方法

小鼠的尾部有三条静脉，一般采用两侧的静脉。把动物固定在暴露尾部的固定器内（可用烧杯、铁丝罩或粗试管邓物代替固定器）。拔去尾部静脉走向的毛，置尾巴于40～500C 温水中浸泡几分钟，或用75％乙醇棉球反复擦抹，使尾部血管扩张。行尾部注射时，尽量采用与尾部平行的角度进针，抽吸法不能验证是否穿刺成功，开始注药时应尽量缓慢，仔细观察，如果有白色皮丘出现，说明未刺入血管，应重新向尾部方向移动针头，再次穿刺，直至注射时无皮丘出现，才能正式注射药物，有时在注射药物的同时可见静脉血被进去的药物向前推进。

实验二致热源试验(hypersusceptibility test)

一、实验目的：

掌握致热源实验的基本方法。

二、实验原理：

致热源试验是通过被测材料或其浸提液注入实验动物体内，若浸提液存在热源物质，作用于单核细胞、巨噬细胞等靶细胞后，促使其产生内出性热源，作用于丘脑体温调节中枢，使动物体温上升，因此，观察动物的体温变化可用来判断该材料或其浸提液中所含热源量是否符合人体的要求。

三、实验对象：兔

四、实验器材和药品：

硅橡胶、蒸馏水、生理盐水（0.9℅）、注射器（50ml）、烧杯(150ml)、量筒（100ml）、高压消毒器、体温计（肛测）。

五、实验步骤：

1．浸提液制备：

1.1将所有与浸提液接触的容器、量器等玻璃器皿均应先置于干燥箱内250℃加热30min，或180℃加热2h去除热原物质。

1.2 浸提液所用灭菌0.9℅生理盐水应是热原检查合格者，试样浸提前应用同一批号灭

菌的0.9℅生理盐水溶液冲洗3次。

1.3 按评价要求裁剪试样，选择适当的浸提温度获得浸提液。

按评价标准裁剪试样，先用清水洗净，再用蒸馏水冲洗三次，用生理盐水冲洗一次，置于烧杯中，按试样与浸提介质比例注入适量的生理盐水，封口。

2．实验前的准备：

2．1 实验动物的选择：

选用健康、成年的新西兰兔，体重2.5～3.0kg。

2．2 对实验动物试验前的要求：

试验前应对试验动物进行体温测量，在体温测量前7日应在同一条件下使用同一饲料进行喂养，使其在此期间体重不减轻，精神、食欲、排泄等不应有异常现象。

在试验前1～2日，应让试验用兔尽可能处于同一温度环境中，饲养室和试验室的温度也尽可能相同。在试验过程中，应注意温度变化不得太大，应避免兔躁动并停止给食2h以上。

2．3 实验动物的体温测量：

在实验前7日内预测体温，每隔1h测量体温一次，共测4次，4次体温均在38.3～38.60C 之间，最高和最低的体温差数不超过0.40C。

2．4 体温测量方法和时间：

选用肛温计测量直肠内温度，肛温计插入深度一般约为6cm左右，时间5～10min。

3．试验过程：

3．1选用3只符合要求的试验兔，测定其正常体温后15min内，自耳静脉缓慢注入试验材料浸提液，剂量为10ml/kg，液体温度为370C。

3．2 注射后每隔1h测量兔体温1次共测3次，以3次体温中最高的一次减去正常体温，即为该兔的升高度数。

六、结果判断标准：

1．在试验的3只试验兔中，体温升高均在0.60C以下，并且体温升高总度数在1.40C 以下，则认为试验材料浸提液符合热源检查要求。

2．若3只试验兔中仅有1只体温升高0.60C或0.60C以上，或3只试验兔体温均低于

0.60C，但升高总数在1.40C或1.40C以上时，应另取5只兔复试。在复试的5只兔中，体温

升高0.60C或0.60C以上的总数仅有1只,，并且初复试合并8只试验兔的体温升高总数不超过3.50C时，则认为试验材料浸提液符合热源检查要求。

3．若初试的3只试验兔中，体温升高0.60C或0.60C以上的兔数超过1只时,或在复试的5只试验兔中，体温升高0.60C或0.60C以上的兔数超过1只时,或在初复试合并8只兔的体温升高超过3.50C，均认为试验材料浸提液不符合热源检查的要求。

4．将所有温度下降的反应都计为无温度上升。

注：兔正常体温为39.0(38.5～39.50)℃

附：兔耳静脉注射方法

兔一般采用耳缘静脉。兔耳中央为动脉，内外缘为静脉。内缘静脉不易固定，很少选用。外缘静脉表浅易固定，常用作注射部位。注射时先拔去注射部位的皮毛，用手指弹动或轻柔兔耳，使静脉充盈。左手示指和中指尖夹住静脉的近端，拇指绷紧静脉的远端，环指及小指垫在下面，右手持注射器靠远心端刺入静脉，针头朝向近心端。当穿刺成功后，移动拇指于针头上，将兔耳与针头牢固捏在一起，放松示指和中指，将药注入后，拔出针头，用手指压迫针眼直至不流血为止，不可用中央动脉注射药物，以免药物损伤兔耳。