免疫凝集和免疫沉淀简介

免疫凝集和免疫沉淀简介
一、免疫凝集反应
（一）基础概述
凝集反应（agglutination）、凝集素（agglutinin）、凝集原（agglutinogen）、效价(滴度)、不完全抗体、抗球蛋白试验(Coombs试验)
1、凝集反应是指细菌、红细胞等颗粒性抗原或表面包被抗原的颗粒性载体（如红细胞、聚苯乙烯胶乳等），与相应抗体结合，在一定条件下，出现肉眼可见的凝集现象（agglutination）。

2、参加凝集反应的抗原称为凝集原，而抗体则称为凝集素。

3、效价：是指抗原抗体反应时，出现明显反应终点时抗原或待测血清（抗体）的最高稀释度。

4、不完全抗体：IgM类抗体与IgG类抗体，IgG类抗体与抗原结合后，常不出现可见的凝集反应，这种抗体有时又称不完全抗体。

5、抗球蛋白试验：利用抗球蛋白抗体作为第二抗体，连接已结合抗原（红细胞）上的不完全抗体，使红细胞凝集，称抗球蛋白试验（Coombs实验）
（二）分类
1、直接凝集反应
原理：细菌、螺旋菌和红细胞等颗粒性抗原，在适当的电解质参与下可直接与相应抗体结合出现凝集。

分为玻片法和试管法：
(1) 玻片凝集实验
用于抗原的定性分析，一般用来鉴定菌种或分型，也适用于人类ABO血型的测定。

(2) 试管凝集试验
检测有无抗体和抗体效价用来协助临床诊断或流行病原调查研究。

例如肥达试验、外斐试验、输血时也常用于受体和供体俩者的交叉配血试验。

2、间接凝集反应
原理：是将可溶性抗原(或抗体)先吸附于适当大小的颗粒性载体表面，然后与相应抗体(或抗原)作用，在适宜电解质存在的条件下，出现特异性凝集现象。

(1)正向间接凝集反应
可溶性抗原致敏载体，用以检测标本中待测抗体的凝集反应，称为正向间接凝集反应。

(2)反向间接血凝反应特异性抗体致敏载体，用以检测标本中待测抗原的凝集反应。

(3)间接血凝抑制试验先将可溶性抗原(或抗体)与相应抗体(或抗原)试剂混合,然后再加入抗原(或抗体)致敏的载体颗
粒，则能抑制原先的凝集现象，称为正向(或反向)间接凝集抑制试验。

可用于检测抗体、自身抗体、变态反应性抗体，也可测定抗原。

间接血凝抑制试验适用于各种抗体和可溶性抗原的检测。

以载体来分，常用的为红细胞、胶乳颗粒及明胶颗粒等
(4)协同凝集反应载体为金黄色葡萄球菌A 蛋白(SPA)。

SPA具有与lgG的Fc端结合的特性，因此当这种葡萄球菌与IgG抗体连接时，就成为抗体致敏的颗粒载体。

如与相应抗原接触，也出现特异凝集现象。

称为协同凝集反应。

协同凝集反应可用于细菌、病毒的直接检测。

3、其它间接凝集试验：
(1）间接血凝试验将抗原(或抗体)包被于红细胞表面，称为致敏载体，然后与相应的抗体(或抗原)结合，从而使红细胞被动的凝聚在一起，出现可见的红细胞凝集现象。

血凝试验凡红细胞沉积于孔底，集中呈一圆点的为不凝集(-)，如红细胞凝集，则分布于孔底周围。

根据红细胞凝集的程度判断阳性反应的强弱，以++凝集的孔为滴度终点。

（2）胶乳凝集试验载体为聚苯乙烯胶乳用于检测抗溶血素0（3）明胶凝集试验出现粉红色凝集为阳性，广泛应用于HIV-1抗体和抗精子抗体等的检测。

（三）自身红细胞凝集试验
原理：抗人O型红细胞的单克隆抗体能与任何种血型的红细胞结合，但不引起凝集反应，这种抗体与另一特异性抗体
连接成的双功能抗体，可用于检测标本中的抗原:如与特异性抗原连接，则可用于检测标本中的抗体。

这一实验与上述血凝实验的区别在于反应中的红细胞是未经致敏的受检者新鲜红细胞。

（四）抗球蛋白试验Coombs试验
包括直接Coombs试验和间接Coombs试验，分别检测红细胞.上不完全抗体和游离在血清中的不完全抗体。

本质上就是间接凝集试验。

1、直接Coombs试验用于检测结合于红细胞表面的不完全抗体。

取患者红细胞制成悬液，直接加入抗人蛋白抗体试剂，若红细胞表面结合有不完全抗体，即可出现凝集现象。

临床常用于新生儿溶血症、自身免疫溶血症、特发性自身免疫性贫血以及医源性溶血性疾病患者红细胞上存在的不完全抗体的检测。

2、间接Coombs试验，用于检测游离在血清中的不完全抗体。

将受检血清与正常人O型红细胞混合，如受检血清中有不完全抗体，即可吸附于红细胞上，形成致敏红细胞，再加入抗人球蛋白抗体，与致敏红细胞表面的不完全抗体结合，使红细胞凝集。

此试验多用于检测母体Rh(D)抗体，以便及早发现和避免新生儿溶血症的发生，也可用该方法对红细胞不相容输血后所产生的d血型抗体进行测定。

（五）间接凝集反应的应用
1、抗原的检测反向间接凝集试验用于检测病原体可溶性抗原，也可用于检测各种蛋白质成分。

2、抗体的检测可用于检测细菌、病毒和寄生虫等感染后产生的抗体，例如间接凝集试验或明胶颗粒凝集试验用于检测抗人类免疫缺陷病毒（HIV）抗体以诊断艾滋病、胶乳凝集试验用于检测抗溶血素O等。

二、免疫沉淀反应
（一）基础概述
1. 沉淀反应（precipitation）
指可溶性抗原（外毒素、血清蛋白等）与相应的抗体结合，在一定条件下出现肉眼可见沉淀物的现象。

2. 高剂量钩状效应：免疫浊度测定时，由于抗原过量，形成的复合物分子小，而且会发生再解离，使浊度下降，光散射也减少。

3. 免疫浊度测定（immunoturbidimetry）是应用抗原抗体结合在液体中形成的免疫复合物干扰光线可用仪器检测的特点，将现代光学测量仪器与自动分析检测系统相结合应用于沉淀反应，对各种液体介质中的微量抗原、抗体和药物及其他小分子半抗原物质进行定量测定。

4. 海德堡曲线：抗体过量，复合物的形成随抗原递增而增加，到抗原抗体最适比例处时达到最高峰。

5. 沉淀反应中的抗原多为蛋白质、多糖、血清、毒素等可溶性物质。

6. 沉淀反应分两个阶段：
第一阶段为抗原抗体发生特异性结合，几秒到几十秒即可完成，肉眼不可见。

第二阶段为形成可见的免疫复合物，约需几十分钟到数小时才能完成，如沉淀线、沉淀环。

（二）液体内沉淀试验
1、絮状沉淀试验
（1）抗原稀释法
（2）抗体稀释法
（3）方阵滴定法即棋盘滴定法
2、免疫浊度测定
（1）原理：可溶性抗原与相应抗体特异性结合，两者在比例合适和增浊剂作用下，可快速形成较大的免疫复合物，使反应液出现浊度；当反应液中保持抗体过量且浓度固定时形成的免疫复合物随抗原量增加而增加，反应液的浊度也随之增加，即待测抗原量与反应液的浊度呈正相关；与标准曲线比较，即可计算出待测抗原的含量。

（2）分类透射免疫比浊法、散射免疫比浊法、免疫胶乳比浊法
（3）影响因素
抗原抗体的比例；抗体的质量；抗原抗体反应的环境；增浊剂
（三）凝胶内沉淀反应（琼脂扩散反应）
1、单相琼脂扩散
先将一定量的抗体混于琼脂凝胶中，使待测的抗原溶液在琼脂内由局部向四周自由扩散，在一定区域内形成可见的沉淀环。

①Mancini曲线
用于大分子抗原和长时间扩散（>48h）的结果处理,使用普通坐标纸画曲线,沉淀环直径的平方与抗原浓度呈线性关系。

②Fahey曲线
用于小分子抗原和较短时间扩散（>24h）的结果处理,使用半对数纸画曲线,抗原浓度的对数与扩散直径之间呈线性关系。

2、双相琼脂扩散
双向免疫扩散试验是将抗原和抗体加在同一琼脂板对应孔中，各自向对方扩散，在浓度比例恰当处形成沉淀线，观察沉淀线的位置、形状及对比关系，可对抗原或抗体进行定性分析。

此法灵敏度低，出现结果慢，不能精确定量，这些缺点一定程度上限制了它的应用。

应用：
(1) 抗原或抗体存在与否以及估计其相对含量
沉淀线靠近含量低的一方
(2) 分析抗原或抗体的相对分子量
沉淀线弯向分子量大的一方
(3) 抗原性质的分析
a、两条沉淀线互相吻合相连，表明抗体与两个抗原中的相同表位结合形成沉淀，但不能说明两个抗原完全相同；
b、两条沉淀线交叉，说明两个抗原完全不同；
c、两条沉淀线相切，提示两个抗原之间有部分相同。

(4) 滴定抗体的效价：以出现沉淀线最高的抗体稀释度作为该抗体的效价。

(5) 抗原或抗体纯度分析：若仅出现一条沉淀线则表示待检抗原或抗体纯，若出现多条沉淀线则说明不纯。

（四）免疫电泳技术
1.免疫电泳技术（immunoelectrophoresis technique）
是电泳分析与沉淀反应的结合产物，是直流电场作用下的凝胶扩散实验，是将抗原抗体反应的高度特异性与电泳技术的高分辨率及快速、微量等特性相结合的一种免疫化学技术。

2. 对流免疫电泳（CIEP）
实质上是将双向免疫扩散与电泳相结合在直流电场中的定向加速的免疫扩散技术。

3. 火箭免疫电泳(RIE)
是单向免疫扩散与电泳相结合的一项定向加速的单向扩散试验。

4. 免疫电泳（IEP)，
亦称免疫区带电泳-免疫双扩散试验，是区带电泳与双向免疫扩散相结合的一种免疫分析技术。

蛋白质抗原在凝胶中作区带电泳，分成若干区带，加入相应抗体进行双扩，两者在浓度比例适合处形成弧形沉淀线。

通过对沉淀线的数量、位置和形态与已知标准抗原抗体生成的沉淀线比较，进行分析。

5. 免疫固定电泳（IFE）
是区带电泳和沉淀反应相结合的一项免疫化学分析技术。