关于乙烯生物合成方法2011.5

关于乙烯生物合成的相关试验
GC-9A气象色谱仪（日本），带有空心橡胶塞的玻璃容器（塞上带有取气口），注射器（2.5ml），PL303电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司），研钵，G2-20G-Ⅱ高速冷冻离心机（飞鸽牌），RE-85C旋转蒸发仪（上海青浦沪西仪器厂），DZKW-S-4水浴锅（北京市永光明医疗仪器厂），FL-1可调式封闭电炉（北京市永光明医疗仪器厂），微量移液器，试管，样品瓶
1.2.2 试验药品
药品等级厂家
95％乙醇溶液分析纯天津永晟精细化工有限公司
HgCl
2
分析纯天津市化学试剂三厂
FeSO
4
分析纯天津市化学试剂三厂
NaClO 分析纯天津市北晨方正试剂厂
NaOH 分析纯天津市化学试剂三厂
ACC 分析纯sigma公司
K 2HPO
4
分析纯四川西陇化工厂有限公司
KH
2PO
4
分析纯天津市红岩化学试剂厂
EDTA（乙二胺四乙酸）分析纯天津市化学试剂三厂
PMSF（苯甲基磺酰氟）分析纯sigma公司
DTT（二硫苏糖醇）分析纯sigma公司
PVPP(交联聚乙烯吡咯烷酮) 分析纯上海蓝季科技发展有限公司
磷酸吡哆醛分析纯sigma公司
Tris（三羟甲基氨基甲烷）分析纯sigma公司
HCl 分析纯天津永晟精细化工有限公司
甘油分析纯天津市东丽区李明庄工业区
抗坏血酸钠分析纯国药集团化学试剂有限公司
SAM（S-腺苷蛋氨酸）分析纯sigma公司
HEPES(4-羟乙基哌嗪乙磺酸) 分析纯sigma公司
茉莉酸甲酯分析纯s igma公司
精胺、亚精胺分析纯 sigma公司
1.2.3试验试剂配制
95％、80％乙醇溶液，25 mmol/L HgCl
2
溶液，5％NaClO-饱和NaOH (NaClO:NaOH=2:1,v/v)混合液，1-氨基环丙烷-1-羧酸（ACC），100 mmol/L、pH 8.0磷酸钾缓冲液，ACS提取缓冲液（含1 mmol/L EDTA、1 mmol/L PMSF、4 mmol/L DTT、3％ PVPP和10 μmol/L 磷酸吡哆醛），50 mmol/L、pH 8.0 HEPES-KOH
缓冲液，ACS 反应缓冲液（含250 μmol/L SAM 和10 μmol/L 磷酸吡哆醛），100 mmol/L 、pH 7.5 Tris-HCl 缓冲液，ACO 提取缓冲液（含10％甘油、5％PVP 、5.0 mmol/L DTT 、30 mmol/L 抗坏血酸钠和0.1 mmol/L FeSO 4）,ACO 反应缓冲液
（含10％甘油、30 mmol/L 抗坏血酸钠、2.0 mmol/L ACC 和0.1 mmol/L FeSO 4）。

1 乙烯释放量的测定方法
气象色谱法测定。

参照曹建康等主编的《果蔬采后生理生化实验指导》，略有改进，改进出用黑色斜体标识，详见如下：
将玻璃容器打开，倒扣放置或用风扇吹风，使容器中气体与空气平衡。

然后放上果实500 g 左右，在室温下密闭1h 。

用注射器从容器橡胶塞取气口中顶空抽取1.0 mL 气体，在气相色谱仪上进样测定。

经色谱仪检测后得到色谱图，加载标准曲线后，经过微机处理，即可得到进样气体乙烯浓度。

乙烯释放量以每小时每公斤果实释放的乙烯的微升数表示（μL ·kg -1·h -1）。

计算公式：
乙烯释放量（μL ·kg -1·h -1）=1000⨯⨯⨯t W V
C
式中：
C ——气相色谱测定的样品气体中乙烯含量，μL/L ；
V ——玻璃容器密闭空间的容积，mL ；
t ——测定时间，h ；
W ——果实重量，kg 。

2 ACC 含量的测定方法
气象色谱法测定。

参照曹建康等主编的《果蔬采后生理生化实验指导》，略有改进，改进出用黑色斜体标识，详见如下：
称取5.0 g 果蔬样品，置于研钵中，稍加研磨后，转入到试管中，加入10 mL95%乙醇溶液，煮沸浸提20 min ，冷却后于14000×g 离心15 min ，收集上清液。

再向残渣中加入10 mL 80%乙醇于70℃浸提30 min ，离心，收集上清液。

合并两次浸提液，用旋转蒸发仪在45℃条件下将浸提液蒸发至干。

向蒸发残留物中加入2.0mL 蒸馏水振荡溶解，即为ACC 制备液，于-20℃保存备用。

取1.0 mL ACC 制备液，置于容积为20 mL 的样品瓶中，加入40μL 25 mmol/L HgCl 2溶液，用反口橡皮塞密封样品瓶，冰浴10 min 使温度平衡。

再通过注射加
入0.2 mL 经冰浴预冷的5% NaClO-饱和NaOH (NaClO:NaOH=2:1，v/v)混合液，迅速振荡5 s 后，放回冰浴平衡5 min ，顶空取1.0 mL 气体，用气象色谱法测定乙烯生成量。

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，计算每克鲜重果蔬样品中ACC 的含量，以nmol/g FW 表示。

计算公式：
ACC 含量（nmol/g FW ）= 4.22⨯⨯⨯⨯⨯W V R V
V C S L
式中：
C ——气相色谱测得顶空气体中乙烯含量，μl/L ；
V L ——样品瓶剩余空间体积，mL ；
V ——样品提取液总体积，mL ；
R ——ACC 向乙烯转变的效率，%；
V S ——测定时所取样品提取液体积，mL ；
W ——样品重量，g ；
22.4 ——标准状况下1摩尔气体体积常数，L/mol 。

3 ACS 活性的测定方法
气象色谱法测定。

参照曹建康等主编的《果蔬采后生理生化实验指导》，略有改进，改进出用黑色斜体标识，详见如下：
称取2.0 g 果蔬组织，加入2.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆后于4℃、12000×g 离心30 min ，收集上清液即为粗酶提取液。

将0.5 mL 酶提取液和1.5 mL 反应缓冲液加入到25 mL 样品瓶中，用反口橡皮塞密封样品瓶后，在30℃水浴中保温1h 。

然后注射加入0.1 mL 25 mmol/L HgCl 2溶液以终止反应，并置于冰浴10min 平衡温度，再用注射器加入0.2mL 经冰浴预冷的5% NaClO-饱和NaOH (NaClO:NaOH=2:1，v/v)混合液，迅速振荡5 s 后，放回冰浴平衡5min ，顶空取1.0 mL 气体测定乙烯释放量。

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，以乙烯的产生速率表示每小时每克鲜重果蔬样品组织中ACC 合成酶活性，即为 nmol ·h -1·g -1 FW 。

ACS 活性（nmol ·h -1·g -1 FW ）=4.22⨯⨯⨯⨯⨯⨯W t V R V
V C S L
式中：
C S ——气相色谱测得顶空气体中乙烯含量，μl/L ；
V L ——样品瓶剩余空间体积，mL ；
V ——样品提取液总体积，mL ；
R ——ACC 向乙烯转变的效率，%；
V S ——测定时所取样品提取液体积，mL ；
t ——酶促反应保温时间，h ；
W ——样品重量，g ；
22.4 ——标准状况下1摩尔气体体积常数，L/mol 。

4 ACO 活性的测定方法
气象色谱法测定。

参照曹建康等主编的《果蔬采后生理生化实验指导》，略有改进，改进出用黑色斜体标识，详见如下：
称取2.0 g 果蔬组织，加入2.0 mL 提取缓冲液，在冰浴条件下研磨匀浆后
于4℃、12000×g 离心30 min ，收集上清液即为粗酶提取液。

将0.5 mL 酶提取液和1.5 mL 反应缓冲液加入到25 mL 样品瓶中，用反口橡皮塞密封样品瓶后，向样品瓶中注射进1.0 mL 纯CO 2气体，在30℃水浴中保温
30 min 。

然后，顶空抽取1.0 mL 气体测定乙烯释放量。

根据气相色谱法测得顶空气体中乙烯含量，以乙烯的产生速率表示每小时每克鲜重果蔬样品组织中ACO 活性，即为nmol ·h -1·g -1 FW 。

ACO 活性（nmol ·h -1·g -1 FW ）= 4.22⨯⨯⨯⨯⨯W t V V
V C S L
式中：
C S ——气相色谱测得顶空气体中乙烯含量，μl/L ；
V L ——样品瓶剩余空间体积，mL ；
V ——样品提取液总体积，mL ；
V S ——测定时所取样品提取液体积，mL ；
t ——酶促反应保温时间，h ；
W ——样品重量，g ；
22.4 ——标准状况下1摩尔气体体积常数，L/mol 。