电镜切片样品制作步骤

A 悬浮培养的细胞、细菌、血细胞、精子等；

细胞使用PBS或无血清培养基离心漂洗1~2次以去除血清，离心转速依据不同离心机、不同样品自定，总时间控制在5min内；细胞团根据预设浓度在适量2.5%戊二醛吹悬，滴加在预先置入青霉素小瓶中的托盘，4℃静置沉降2~3天，在托盘周围加入PBS，以防止样品干燥。

B贴壁培养的细胞：

在培养皿中预先加入盖玻片，使细胞贴附于盖玻片上；PBS或无需请培养基漂洗后，放置在培养板室温固定1h，4℃3 h，注意放置干燥，自行转入青霉素小瓶中，加满PBS送检。SEM标本处理必须使用玻璃容器，需明确所用盖玻片尺寸可以放入青霉素瓶。

C组织取材

样品观察表面可达8~10mm2,高度小于5mm左右；

样品表面在固定前必须清洁：使用生理盐水或PBS冲洗掉表面的灰尘以及不需要观察的蛋白、粘液等。能够明确标识标本的观察面。消化道、呼吸道、血管、生殖器官、泌尿等官腔内表面，尤其要注意先清洗再固定。

如需要观察脏器内结构，应依照不同的实验目的，决定目的脏器是否需要灌注清洗；

固定2.5%戊二醛浸没标本，室温1h，4℃固定3h以上，换PBS送检。

附：2.5%戊二醛的配制

Step 1:

0.2M磷酸缓冲液的配制：

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磷酸二氢钠（NaH2PO4.H2O） 2.6克

磷酸氢二钠(Na2HPO4.12H2O)29克

双蒸馏水加至500毫升

pH调至7.4

Step 2:

戊二醛固定液的配制：

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25% 戊二醛1ml

双蒸馏水4ml

0.2mol/L磷酸缓冲液5ml

戊二醛最终浓度 2.5%

pH值7.3-7.4

一、培养细胞

✧本方法适用于贴壁、悬浮培养的细胞；细菌；精子；血细胞等。

1.细胞数量：106或6孔板一孔的细胞达到生长面积的80%或以上。

2.离心收集：消化或用细胞刮刮下细胞。如细胞状态一般或漂浮物较多，建议更换新培养

基；如观察自噬，建议刮下细胞。

3.离心速度、时间依据不同离心机、不同样本自行定义，时间在5min内；

4.细胞团大小：细胞最厚处约0.5~1.5mm,或者参照1元硬币的厚度；

5.细胞离心成团后去除上清，加2.5%电镜用戊二醛500μl固定，切勿吹悬，室温1h，4℃

3 h后，去除戊二醛加满PBS后4℃放置或送检。

✧注意：固定细胞不需要吹悬，细胞不宜过多，过多会导致固定液无法迅速渗透到底部细

胞；

二、生物组织

迅速剪下/切下相应位置，在2.5%戊二醛中，依据不同组织和实验目的，用刀片修成1mm3的小块或__mm2×2mm长条或薄片状。在2.5%戊二醛室温1h，4℃3 h，去除戊二醛加满PBS，4℃放置或送检。

标本固定时，尽量修饰成合适的形状，对于需要定位的标本，离开实验室者后比较难以确认所需要的位置。使用2ml圆底或尖底的EP管，勿用500μl以下的EP管。

✧块状标本基本包含的组织类型：脑、肾、肝、肺、心肌；

✧长条状、薄片状标本基本包括：

骨骼肌、平滑肌：肌纤维方向与标本长轴平行或垂直（送样时说明方向）

皮肤、毛囊：皮肤角质层与长轴平行；

神经、直径在2mm内的小血管：其长轴与标本块长轴平行的长条

消化道、大血管：长条片状，一侧是上皮、内皮细胞面，或依据目的去除无用的分层脑皮质、海马、耳蜗等：具有方向性或需横切或纵切面或需要组织中某一特定位置的标本；

具体到某些组织，可能会有不同的要求，如观察海马CA1区，建议标本取片状或近似三角形的片状或梯形（比较好）。

直观的说，小块直径约为1元硬币厚度；长度的短轴约为1元硬币的厚度；具体大小根据标本会有相应的调整，但都已小尺寸为佳。