T淋巴细胞转化实验 ppt课件

染色镜检观察细胞形态
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操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入 PHA(500g/ml )0.1 ml，对照瓶内不加PHA。 混匀后置37C、5%CO2培养箱内孵育72h，期 间每天旋转摇匀一次。
2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离 心管中，1500rpm 离心10min。
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试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高
压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
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操作步骤
外周血0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片
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四、结果观察

可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8
um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱 性。

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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞：
细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核 质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
龚道科
2002.4
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
细胞大小(直径μm) 12～20
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
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未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
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2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部 分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及 成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞， 按下列公式计算转化率：
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转化率

转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。
4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压 灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
培养板 （含 PHA）
培养板 （无 PHA）
5%CO2 37℃ 68h
1500rpm 离心10min
实验八 T淋巴细胞转化试验
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基本原理
刺激物PHA
T淋巴细胞
同位素法 MTT法
增殖分化、DNA等大分 子物质合成增加
形态法
淋巴母细胞
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体积变大
胞浆增多、空泡 核染色质疏松 核仁明显 2 有丝分裂
检测方法： 形态学计数法 MTT法 同位素法
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教学内容：
实验目的
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在正常情况下， PHA 诱导的淋巴细胞转化率为 60 ％一 80 ％， 如为 50 ％一 60 ％则偏低， 50 ％以下则为降低。
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注意事项
1 ．培养基成分对转化率影响较大，注意其有 效期。
2 ．小牛血清用前需灭活。
3 ．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。
加入MTT 20l/
4h
孔
盐酸异丙醇 100l/孔
酶联免疫检测仪A570nm
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操作步骤
1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细
胞，并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养 液调
整细胞浓度至1106/ ml。
2．将细胞悬液加入96孔培养板中，100l/孔，
核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
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试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。包含：
小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至
7.2～7.4。
2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的 RPMI
培养液稀释至500～1000g/ml。
T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖， 其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲 基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催 化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异 丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞 增殖活化的程度呈正相关。
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试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。
实验原理
试剂与器材
操作步骤
结果判断
注意事项
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一、形态学计数法
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实验目的
1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。 2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。
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实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和
4 ． PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化 反应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超 过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验 前应先测定。
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ห้องสมุดไป่ตู้
二、MTT比色法
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实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。
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实一验、原原理 理
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操作步骤
3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。
4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～ 20min，水洗，干燥。
5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的 形态变化，计算淋巴细胞转化率。
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结果判断
未转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
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淋巴细胞标志及功能检测
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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
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(3) 过渡型淋巴细胞：
比小淋巴细胞大，约 l0 - 20 u m ，核染色致密，但出现核仁， 此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。
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结果判断
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(4) 其它细胞： 如中性粒细胞在培养 72h 后，绝大部分衰变或死亡，呈碎片。