T淋巴细胞转化实验 ppt课件
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《淋巴细胞转化实验》课件
实验操作技巧
01
技巧三：减少误差来源
02
尽量使用同批次和同质量的试剂进行实验，以减少误差来源。
03
在实验过程中保持一致的操作方法，避免人为误差的产生。
04 实验结果分析
实验结果展示
淋巴细胞转化率
通过显微镜观察，记录不同时间段淋巴细胞 的形态变化，计算淋巴细胞转化率。
细胞形态学观察
细胞增殖数量
采用细胞计数法，统计增殖的淋巴细胞数量 ，并计算增殖倍数。
实验的局限性与改进方向
局限性
实验结果可能受到样本来源、实验条 件等因素的影响，导致一定的误差。
改进方向
进一步优化实验方案，提高实验的准 确性和可重复性；扩大样本量，增加 代表性；探索更多淋巴细胞转化相关 的机制和影响因素。
谢谢聆听
实验操作前的准备
实验场地消毒：确保无菌环 境
实验器材清洗和灭菌：确保 无污染
实验试剂配制：根据需要配 制适量的培养基和试剂
动物处理：麻醉、取材等操 作需严格遵循动物伦理要求
03 实验操作过程
实验操作流程
步骤一：准备试剂和器材 准备淋巴细胞分离液、培养基、离心管、移液管等。
确保所有试剂和器材在实验前已进行消毒处理。
《淋巴细胞转化实验 》ppt课件
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ录
• 实验概述 • 实验材料 • 实验操作过程 • 实验结果分析 • 实验结论
01
实验概述
实验目的
验证淋巴细胞在抗原 刺激下的转化现象。
探究淋巴细胞转化与 疾病发生、发展的关 系。
了解淋巴细胞在免疫 应答中的作用。
实验原理
01
淋巴细胞是免疫系统中的重要组成部分，具有识别抗原 、增殖分化和产生免疫应答的能力。
淋巴细胞转化实验PPT课件
220µL
220µL
450µL
220µL
440µL
10ug/ml
5ug/ml
2.5ug/ml
LOGO
注意事项
❖ 注意无菌操作 ❖ 操作中尽可能短时间内完成，以减少死细胞数 ❖ 将稀释血加于分离液时，动作要轻柔 ❖ 离心时，加速度与减速度要均匀平稳，不能用离心机“刹车”档 ❖ 分离不同种属动物的PBMC要用不同的淋巴细胞分离液 ❖ 细胞数量、刺激剂浓度需要在预实验中摸索最适条件
❖ 细胞传代培养：原代培养细胞长到一定密度时，需进行 B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml.
淋巴细胞在体外培养时，受到刺激物的刺激后可表现为细胞体积增大、代谢旺盛、蛋白质和核酸合成增加，即向淋巴母细胞转化和增
殖。
传代培养。
形态计数法、MTT法、CCK-8法、同位素法。
B组：加入100ul ConA(10ug/ml),则终浓度为5ug/ml. Original sample tube
N关a闭H超CO净为3台溶风D液机：N；常用A浓合度为成5. 的原料。细胞合成的DNA越多，则所掺入 Ω一切操的作均3要H在-火T焰d前R方进就行；越多。该方法与MTT比较，灵敏度高、准
√悬浮生长细胞传代：离心法 Ficoll比重为1.
原代细胞离体时间短，在一定程度上能反映体内的生长特性。
√半悬浮生长细胞传代：直接吹打法 在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖；
取静脉血3ml,用PBS（吸管1）稀释1倍（滴管1）
基本原理：由于血液标本中各种细胞比重不同，红细胞、中性粒细胞比重为1.
❖ 细胞的复苏 从液氮罐中取出的冻存管，迅速投入37℃水浴中充分摇 动，使其迅速融化。加入培养液离心后，弃上清，加培 养液培养。
T淋巴细胞转化试验
离心： 10分钟 离心：1000rpm 10分钟
弃上清， 弃上清，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液
滴片，姬姆萨染色， 滴片，姬姆萨染色，油镜观察
结 果 观 察
转化细胞： 转化细胞：
• 淋巴母细胞： 淋巴母细胞：
体积大，核膜清楚， 体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状， 细胞比例变小。 网状，核/细胞比例变小。
判定结果
实 验 材 料
肝素抗凝血 Hank‘s液 淋巴细胞分层液 PHA 细胞计数板 显微镜
操 作 步 骤
淋巴细胞的分离
用Hank’s液配成 液配成 1×106细胞 的淋 × 细胞/ml的淋 巴细胞悬液。 巴细胞悬液。
加PHA 5ug/ml
阴性对照：不加PHA 阴性对照：不加PHA
分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 24孔细胞培养板 72
实 验 原 理
T淋巴细胞与许多特 异或非特异抗原在体 外共同培养时， 外共同培养时，细胞 的代谢和形态可以发 的代谢和形态可以发 生一系列的变化: 生一系列的变化: 细胞形态向淋巴母细 胞的转化 转化。 胞的转化。 电荷的改变、 电荷的改变、 细胞内蛋白质和核酸 合成的增加、 合成的增加、
未转化细胞
T淋巴细胞转化试验
(T lymphocyte transformation test)
中山医学院免疫学Biblioteka 研室实验目的和要求掌握T淋巴细胞转化实验的原理; 掌握 淋巴细胞转化实验的原理; 淋巴细胞转化实验的原理 掌握细胞计数的方法。 掌握细胞计数的方法。 细胞计数的方法 熟悉能引起T淋巴细胞发生转化 熟悉能引起T 的常用抗原性物质及其特点; 的常用抗原性物质及其特点;
转 化 率 计 算
弃上清， 弃上清，用残液将沉淀细胞混匀配成悬液
滴片，姬姆萨染色， 滴片，姬姆萨染色，油镜观察
结 果 观 察
转化细胞： 转化细胞：
• 淋巴母细胞： 淋巴母细胞：
体积大，核膜清楚， 体积大，核膜清楚，染色质疏松呈细 网状， 细胞比例变小。 网状，核/细胞比例变小。
判定结果
实 验 材 料
肝素抗凝血 Hank‘s液 淋巴细胞分层液 PHA 细胞计数板 显微镜
操 作 步 骤
淋巴细胞的分离
用Hank’s液配成 液配成 1×106细胞 的淋 × 细胞/ml的淋 巴细胞悬液。 巴细胞悬液。
加PHA 5ug/ml
阴性对照：不加PHA 阴性对照：不加PHA
分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 分别加入24孔细胞培养板，培养72小时 24孔细胞培养板 72
实 验 原 理
T淋巴细胞与许多特 异或非特异抗原在体 外共同培养时， 外共同培养时，细胞 的代谢和形态可以发 的代谢和形态可以发 生一系列的变化: 生一系列的变化: 细胞形态向淋巴母细 胞的转化 转化。 胞的转化。 电荷的改变、 电荷的改变、 细胞内蛋白质和核酸 合成的增加、 合成的增加、
未转化细胞
T淋巴细胞转化试验
(T lymphocyte transformation test)
中山医学院免疫学Biblioteka 研室实验目的和要求掌握T淋巴细胞转化实验的原理; 掌握 淋巴细胞转化实验的原理; 淋巴细胞转化实验的原理 掌握细胞计数的方法。 掌握细胞计数的方法。 细胞计数的方法 熟悉能引起T淋巴细胞发生转化 熟悉能引起T 的常用抗原性物质及其特点; 的常用抗原性物质及其特点;
转 化 率 计 算
免疫学实验：T淋巴细胞转化试验
➢ 根据细胞的大小，核与胞浆的比例，胞浆的染色性和核结构 以及有无核仁等特征，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞 和核丝分裂相细胞以及成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化 细胞，每份标本计数200个细胞，按下式计算转化率：
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
转化率
转化的淋巴转细化胞的数淋 未巴转细化胞的数淋巴细胞数100%
3H-TdR掺入法
然后用1000ul加样器隔着纱布将脾细胞悬液吸出，放入50ml无菌离心管中，再分 别用1ml培养液冲洗纱网和平皿，并将细胞悬液吸出，放入同一50ml离心管中， 剩余3ml培养液备用。 4. 2000rpm，常温离心6分钟，弃上清，加3ml含血清1640培养液重悬细胞。
➢ 细胞计数
1. 取上述制备好的细胞悬液混匀后取出20ul，加到盛有980ul计数液的EP管中，混 匀后取出20ul到一个新的EP管中，再向其中加入20ul台盼蓝染料，混匀后取20ul 计入到细胞计数版上，在显微镜下计数，计数方法见后。
第三天
1.取出96孔板加入MTT (5mg/ml) 20ul/孔 2. 5% CO2 37℃，继续培养2小时。 3. 2000rpm，离心10min。小心弃去上清，加入100ul/ 孔 DMSO振荡，使颗粒全部溶解。 4.酶标仪测吸光度值：OD490nm 5.结果判定：SI=ConA孔OD值/对照孔OD值
A,SPA)（人B） 美洲商陆（pokeweed mitogen, PWM)
常用的检测方法
➢ 形态学观察法 ➢ 3H-TdR（3H-胸腺嘧啶核苷）掺入法 ➢ MTT法 (四甲基偶氮唑盐微量酶反应比色法）
本次实验采用 MTT法
形态学检测方法
➢ 淋巴母细胞主要表现有体积明显增大，是成熟淋巴细胞的 3~4倍；染色质疏松，核仁清晰可见；胞浆丰富并形成空泡。
T淋巴细胞(共61张PPT)
表达：活化的T细胞
配体：ICOS-L
作用：在CD28后起调节活化T细胞产生细胞因子，促进T细胞增
殖
4、PD-1 (programmed death 1)
表达：活化的T细胞 配体： PD-L1 和 PD-L2 。 作用：抑制T、B细胞的增殖及细胞因子的释放，
参与外周免疫耐受的形成
5、CD2 （LFA-2即淋巴细胞功能相关抗原2 ） 又称绵羊红细胞受体（E受体）
T淋巴细胞
T LYMPHOCYTE
T淋巴细胞（T lymphocyte）
依赖胸腺发育的淋巴细胞，
负责细胞免疫功能，参与抗肿
瘤、抗细胞内感染微生物、移 植排斥、迟发型超敏反应；对 部分体液免疫发挥辅助功能。
外周血：约占淋巴细胞总数的65%～75%；
胸导管：高达95%以上。
内容
➢T细胞的分化发育
➢T细胞表面分子及作用 ➢T细胞亚群 ➢T细胞的功能
T细胞丝裂原：刀豆蛋白A（ConA）, 植物血凝素（PHA）,
商陆丝裂原（PWM）
B细胞丝裂原：脂多糖/内毒素（LPS），葡萄球菌蛋白A
（SPA），商陆丝裂原（PWM）
五、其它表面分子
• 细胞因子受体（如IL-2R）；FasL等
35
第三节 T细胞的分类和功能
➢ 根据活化阶段分类
➢ 根据TCR的组成分类
α链基因发生重排，开始表达有功能性的TCR。
参与外周免疫耐受的形成
表达：活化的CD4+T细胞
CD28
B7家族
T细胞
靶细胞或APC细胞
约占T细胞的5～10%，主要分布于皮肤和粘膜，多数为CD4-CD8-双阴性T细胞；
Increased Ig production
配体：ICOS-L
作用：在CD28后起调节活化T细胞产生细胞因子，促进T细胞增
殖
4、PD-1 (programmed death 1)
表达：活化的T细胞 配体： PD-L1 和 PD-L2 。 作用：抑制T、B细胞的增殖及细胞因子的释放，
参与外周免疫耐受的形成
5、CD2 （LFA-2即淋巴细胞功能相关抗原2 ） 又称绵羊红细胞受体（E受体）
T淋巴细胞
T LYMPHOCYTE
T淋巴细胞（T lymphocyte）
依赖胸腺发育的淋巴细胞，
负责细胞免疫功能，参与抗肿
瘤、抗细胞内感染微生物、移 植排斥、迟发型超敏反应；对 部分体液免疫发挥辅助功能。
外周血：约占淋巴细胞总数的65%～75%；
胸导管：高达95%以上。
内容
➢T细胞的分化发育
➢T细胞表面分子及作用 ➢T细胞亚群 ➢T细胞的功能
T细胞丝裂原：刀豆蛋白A（ConA）, 植物血凝素（PHA）,
商陆丝裂原（PWM）
B细胞丝裂原：脂多糖/内毒素（LPS），葡萄球菌蛋白A
（SPA），商陆丝裂原（PWM）
五、其它表面分子
• 细胞因子受体（如IL-2R）；FasL等
35
第三节 T细胞的分类和功能
➢ 根据活化阶段分类
➢ 根据TCR的组成分类
α链基因发生重排，开始表达有功能性的TCR。
参与外周免疫耐受的形成
表达：活化的CD4+T细胞
CD28
B7家族
T细胞
靶细胞或APC细胞
约占T细胞的5～10%，主要分布于皮肤和粘膜，多数为CD4-CD8-双阴性T细胞；
Increased Ig production
免疫学 T淋巴细胞ppt课件
❖ 第一个V样结构域是HIV 的受体
胞浆区与p56lck激免疫酶学 T结淋巴细合胞 ，参与信号转导 16
CD8
❖ 是由α、β链借二硫键连接 的异源二聚体，胞膜外区 结构均属IgSF
免疫学 T淋巴细胞
17
CD8
❖ 是由α、β链借二硫键连接的异源二聚 体，胞膜外区结构均属IgSF
❖α链V样区与MHC I类分子的α3区域 结合
识别特异性抗原
免疫学 T淋巴细胞
转导T细胞活化 的第一信号
14
二、CD4和CD8分子
❖ 辅助TCR识别抗原
❖ 参与T细胞活免疫化学 T淋信巴细号胞 的转导
15
❖CD4
gp120
❖ 为单链跨膜糖蛋白，胞 膜外结构为IgSF成员， 共有4个结构域
❖ 第一、二个结构域可与 MHCII类分子的β2结合。
免疫学 T淋巴细胞
26
ICOS — B7-H2
•在CD28之后起作用，调节活化T细胞产生多种细胞因子；
上调T细胞黏附分子的表达，促进T细胞的增殖
CD40L—CD40
•促进抗原提呈细胞活化；促进T细胞活化
•促进B细胞增殖、分化、抗体产生和类别转换；诱导记忆
性B细胞形成
LFA-1—ICAM-1
促进T细胞与靶细胞或其他细胞间的相互结合，并增强细胞
❖ 丝裂原结合分子：有丝分裂原受体，介导多克隆淋
巴细胞的活化
免疫学 T淋巴细胞
29
T淋巴细胞表面分子及其作用
TCR-CD3复合物——(识别) CD4和CD8分子 ——(辅助) 协同信号分子 ——(调节) 丝裂原受体 ——(非特异性识别)
介导的免疫效应
LFA-2（CD2）—LFA-3
T淋巴细胞(金伯泉).ppt
T
CD4
TCRγδ
Tc1 Tc2 Th1 Th2 Th3 Tr1 Th4?
第 三 节
T淋巴细胞的功能
一、CD4Th细胞的功能
CD4Th细胞的亚群 CD4T Th0
Th1 Th2 Th3：分泌TGF-β
CD4＋T 细胞的功能
1.Th1的功能： 增强吞噬细胞等细胞的抗感染机制主要是胞内微生物 介导Ⅳ型超敏反应（迟发型超敏反应)
3、FasL：启动靶细胞凋亡；
4、产生TNF等多种细胞因子：杀伤靶细胞；
5、产生多种趋化因子，吸引天然免疫细胞，杀伤 靶细胞。
3.将T细胞分为不同的亚群 CD4 ( TH,TD) CD8( Ts, Tc) ·1.CD4分子是HIV的主要受体，HIV感染 CD4阳性T细胞，导致AIDS
2. 检测HIV患者外周血CD4/CD8比值，对 辅助诊断和判断病情有重要作用
ab TCR
ab TCR
CD 4 CD 4
抗原肽
CD 8
抗原肽
配体：CD40
4.CD2（绵羊红细胞受体，E受体，LFA2） 作 用：
❖ 加强T细胞与抗原呈递细胞或靶细胞之间的作用 ❖ T细胞活化的旁路途径 ❖ 可区分T、B淋巴细胞，检测T细胞的数量
+
E花环形成实验：正常结花率为60％－80％
5.LFA-1和ICAM-1
（B7）
四、丝裂原受体
淋巴细胞 促分裂原 母细胞
HLAⅡ类分子
HLA I类分子
T细胞活化的
第一信号：
抗原刺激的信 号 — 使得T细胞 产生的效应具 有特异性
TCR识别抗原肽 /MHC复合物 获得活化的第 一信号，CD3 转导信号。
只有信号1不足以 诱导T细胞的活化、增殖和分化。
T淋巴细胞PPT课件
-
辅助 Ig 合成
+
+++
40
（二）CD4+Th亚群的功 能 3.Th3细胞
医医学学 免免 疫疫 学学
分泌TGF-（—）Th1（负调节）
41
医医学学 免免 疫疫 学学
二、CD8+ 杀伤性T细胞（CTL或Tc）
➢杀伤机制 • 溶解靶细胞： 穿孔素；颗粒溶解素 • 诱导凋亡： LT-α（TNF-β） 丝氨酸酯酶（颗粒酶） FasL-Fas途径
CD4：单链 CD8 ：α＋β链
23
功能 ➢辅助TCR识别抗原 ➢MHC限制性 ➢参与信号转导 ➢CD4是HIVgp120的受体
医医学学 免免 疫疫 学学
24
CD4分子：HIV受体
医医学学 免免 疫疫 学学
25
医医学学 免免 疫疫 学学
三、协同刺激分子受体及配体
26
医医学学 免免 疫疫 学学
Treg细胞
表型：CD4+CD25+Foxp3+ 种类：nTreg 、iTreg（Tr1和Th3）等 功能：
分泌IL-10/TGF-β等+直接接触
负调节和参与免疫耐受
35
医医学学 免免 疫疫 学学
第四节 T细胞功能
一.CD4+Th功能 (一） CD4+Th亚群及分化调节
Ag 初始T
Th3 Th17
CD4+D8+
CD4+D8CD4-D8+
(DP)
(SP)
获得功能 性TCR
阴性选择： 获得中枢 免疫耐受
成熟SP
5
DP表达功 能性TCR
阴性选择
医医学学 免免 疫疫 学学
医学检验·检查项目：T细胞转化试验_课件模板
临床意义：
E花环值减低： ①见于免疫缺陷病 （如Digeorge综合征，Wiskott－Aldrich 综合征，Nezelof综合征）以及原发性细 胞和体液免疫同时缺乏性疾病。上述这些 病当用胸腺素等治疗后，EaRFC可明显增 高。 ②某些恶性肿瘤、麻疹、麻疹脑炎、 腮腺炎、带状疱疹、系统性红斑狼
医学检t;
医学检验·各论：T细胞转化试验 >>>
相关疾病：
蝶窦恶性肿瘤、慢性自身免疫性甲状腺炎、 甲状腺功能亢进症、急性化脓性甲状腺炎、 小儿普通易变型免疫缺陷、小儿白细胞黏 附分子缺陷Ⅰ型、重症肌无力、小儿甲状 腺功能亢进症、肺部少见的恶性肿瘤。
谢谢！
临床意义：
疮、皮肌炎、瘤型麻风以及应用免疫抑制 剂时，亦见E花环值降低。有人认为某些 恶性肿瘤EaRFC可早于病情恶化的临床表 现，而EtRFT仍可正常。 E花环值增高： 见于甲状腺功能亢进、甲状腺炎（此两症 病情缓解时可恢复正常）、重症肌无力、 慢性活动性或迁延性肝炎、慢性淋巴细胞 白血病以及移植排斥时。
医学检验·各论：T细胞转化试验 >>>
正常值： 60.l±7.6％。
医学检验·各论：T细胞转化试验 >>>
相关检查： 人类免疫缺陷病毒抗体（HIV)、T细胞花 环形成试验、自身免疫性疾病14项、抗中 性粒细胞胞浆抗体。
医学检验·各论：T细胞转化试验 >>>
相关症状： 呼吸异常、疲劳、心悸、发热。
医学检验·各论 T细胞转化试验 内容课件模板
医学检验·各论：T细胞转化试验 >>>
别名： T细胞转化试验。
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简介： 又称T细胞返幼试验。T细胞在体外培
E花环值减低： ①见于免疫缺陷病 （如Digeorge综合征，Wiskott－Aldrich 综合征，Nezelof综合征）以及原发性细 胞和体液免疫同时缺乏性疾病。上述这些 病当用胸腺素等治疗后，EaRFC可明显增 高。 ②某些恶性肿瘤、麻疹、麻疹脑炎、 腮腺炎、带状疱疹、系统性红斑狼
医学检t;
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相关疾病：
蝶窦恶性肿瘤、慢性自身免疫性甲状腺炎、 甲状腺功能亢进症、急性化脓性甲状腺炎、 小儿普通易变型免疫缺陷、小儿白细胞黏 附分子缺陷Ⅰ型、重症肌无力、小儿甲状 腺功能亢进症、肺部少见的恶性肿瘤。
谢谢！
临床意义：
疮、皮肌炎、瘤型麻风以及应用免疫抑制 剂时，亦见E花环值降低。有人认为某些 恶性肿瘤EaRFC可早于病情恶化的临床表 现，而EtRFT仍可正常。 E花环值增高： 见于甲状腺功能亢进、甲状腺炎（此两症 病情缓解时可恢复正常）、重症肌无力、 慢性活动性或迁延性肝炎、慢性淋巴细胞 白血病以及移植排斥时。
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正常值： 60.l±7.6％。
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相关检查： 人类免疫缺陷病毒抗体（HIV)、T细胞花 环形成试验、自身免疫性疾病14项、抗中 性粒细胞胞浆抗体。
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相关症状： 呼吸异常、疲劳、心悸、发热。
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别名： T细胞转化试验。
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简介： 又称T细胞返幼试验。T细胞在体外培
医学检验·检查项目：淋巴细胞转化率_课件模板
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临床意义：
降低：常见于恶性肿瘤、淋巴肉芽肿、 重症结核、重症真菌感染、瘤型麻风、运 动失调性毛细血管扩张症、霍奇金病、慢 性淋巴细胞白血病、应用放疗或使用肾上 腺皮质激素免疫抑制剂治疗者等。 升高： 见于特纳综合征、急性淋巴细胞白血病等。
பைடு நூலகம்
医学检验·各论：淋巴细胞转化率 >>>
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相关疾病：
慢性淋巴细胞性白血病、骨的原发性淋巴 瘤、何杰金病、严重联合免疫缺陷病、变 应性口炎、淋巴瘤、急性淋巴细胞性白血 病、恶性组织细胞病、腺淋巴瘤、川崎病、 慢性淋巴细胞性甲状腺炎、艾滋病、淋巴 癌、淋巴管肉瘤。
谢谢！
医学检验·各论 淋巴细胞转化率
内容课件模板
医学检验·各论：淋巴细胞转化率 >>>
简介：
T淋巴细胞表面有多种受体，在体外 培养中加入特异性抗原或非特异性促有丝 分裂原的刺激下，细胞代谢和形态可发生 一系列变化，如能转化成体积较大的原淋 巴细胞。转化细胞数量可反映机体细胞免 疫功能，测定T淋巴细胞的应答能力，诊 断细胞免疫缺陷病。
正常值： 0.60～0.75。(形态学法)。
医学检验·各论：淋巴细胞转化率 >>>
相关检查： B淋巴细胞表面标志、淋巴细胞毒试验、 自身免疫性疾病14项、血常规、抗艾滋病 (AIDS)抗体。
医学检验·各论：淋巴细胞转化率 >>>
相关症状： 淋巴增生、淋巴结退化、淋巴发育不全、 反复感冒、发热、易疲乏。
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T淋巴细胞受到PHA作用后发生活化增殖， 其胞内线粒体琥珀酸脱氢酶活性相应升高，四甲 基噻唑蓝（MTT）作为其底物参与反应，被催 化形成蓝紫色结晶甲臢(fomazan) ，经盐酸─异 丙醇或溶解后为蓝色溶液。甲臢的形成量与细胞 增殖活化的程度呈正相关。
ppt课件
31
试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。 2. 植物血凝素（PHA）。
ppt课件
8
试剂与器材
3. 姬姆萨染液。 4. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。 5．器材 细胞培养瓶、CO2培养箱、超净台、高
压灭菌器、无菌过滤装置、离心机、显微镜等。
ppt课件
9
操作步骤
外周血0.2ml
PHA
无PHA
5%CO2 37℃ 72h 1500rpm 离心10min
吸取白细胞层涂片ppt课件24 2 ．淋巴细胞转化率的计算：按上述分类检查推片头、体、尾三部 分，分别计数淋巴母细胞、过渡型母细胞和核有丝分裂相细胞以及 成熟的小淋巴细胞，以前三者为转化细胞，每份标本计数200个细胞， 按下列公式计算转化率：
ppt课件
25
转化率
转化的淋巴细胞数 转化和未转化的淋巴细
胞数
100%
15
四、结果观察
可以见到以下几种类型细胞 (1) 成熟的小淋巴细胞：与未经培养的小淋巴细胞一样为 6 -8
um ，核染色致密，无核仁，核与胞浆比例大，胞浆染色为轻度嗜碱 性。
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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
2002.4
(2) 淋巴母细胞：
细胞体积增大，约 20 - 30 um ，形态不整齐，常有小突出，核 质染色疏松，有核仁 l - 2 个，胞浆变宽，常出现胞浆空泡。
龚道科
2002.4
未转化和转化淋巴细胞的形态特征
转化的淋巴细胞
淋巴母细胞 过渡型
细胞大小(直径μm) 12～20
12～16
核大小、染色质 增大、疏松
增大、疏松
核仁
清晰、1～4个 有或无
有丝分裂
有或无
无
胞质、着色
增多、嗜碱
增多、嗜碱
浆内空泡
有或无
有或无
伪足
有或无
有或无
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未转化的淋巴细胞
6～8 不增大、密集 无 无 极少、天青色 无 无
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淋巴细胞标志及功能检测
龚道科
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(3) 过渡型淋巴细胞：
比小淋巴细胞大，约 l0 - 20 u m ，核染色致密，但出现核仁， 此为与成熟小淋巴细胞鉴别要点。
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结果判断
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(4) 其它细胞： 如中性粒细胞在培养 72h 后，绝大部分衰变或死亡，呈碎片。
实验八 T淋巴细胞转化试验
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基本原理
刺激物PHA
T淋巴细胞
同位素法 MTT法
增殖分化、DNA等大分 子物质合成增加
形态法
淋巴母细胞
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体积变大
胞浆增多、空泡 核染色质疏松 核仁明显 2 有丝分裂
检测方法： 形态学计数法 MTT法 同位素法
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教学内容：
实验目的
4 ． PHA 剂量过大对细胞有毒性，PHA 转化 反应剂量一般 10m1，培养瓶内液体总量不要超 过 2m1 ，太小不足以刺激淋巴细胞转化，试验 前应先测定。
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二、MTT比色法
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实验目的
熟悉MTT比色法进行淋巴细胞转化试验的原理及其操作方法。
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实一验、原原理 理
3. 标本 肝素抗凝人外周静脉血。
4. 器材 超净台、96孔细胞培养板、 CO2培养箱、高压 灭菌器、无菌过滤装置、振荡器、酶联免疫检测仪等。
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操作步骤
分离外周血
100l/孔
单个核细胞1106/ ml
培养板 （含 PHA）
培养板 （无 PHA）
5%CO2 37℃ 68h
1500rpm 离心10min
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操作步骤
3．弃上清，吸取白细胞层制片，自然干燥。
4．甲醇固定1～2min后，姬姆萨染色15～ 20min，水洗，干燥。
5．油镜下计数200个淋巴细胞，观察淋巴细胞的 形态变化，计算淋巴细胞转化率。
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结果判断
未转化的淋巴细胞
淋巴母细胞
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淋巴细胞标志及功能检测
核酸合成增加，并转化为淋巴母细胞。
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试剂与器材
1. RPMIl640 培养液 。包含：
小牛血清10%、青霉素 100u/m1 、链霉素
100ug/m1，用无菌的3% NaHCO3 调 pH 至
7.2～7.4。
2. 植物血凝素（PHA）。用含10%小牛血清的 RPMI
培养液稀释至500～1000g/ml。
加入MTT 20l/
4h
孔
盐酸异丙醇 100l/孔
酶联免疫检测仪A570nm
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操作步骤
1.先采用密度梯度离心法分离外周血单个核细
胞，并用含10%小牛血清的RPMI 1640培养 液调
整细胞浓度至1106/ ml。
2．将细胞悬液加入96孔培养板中，100l/孔，
实验原理
试剂与器材
操作步骤
结果判断
注意事项
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一、形态学计数法
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5
实验目的
1.掌握T淋巴细胞转化试验的原理。 2.熟悉淋巴母细胞的形态特征及判定方法。
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6
实验原理
T淋巴细胞在有丝分裂原PHA等刺激后，细 胞的形态和代谢发生变化，发生一系列增殖反应， 如出现细胞体积增大、核染色质疏松、蛋白质和
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在正常情况下， PHA 诱导的淋巴细胞转化率为 60 ％一 80 ％， 如为 50 ％一 60 ％则偏低， 50 ％以下则为降低。
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注意事项
1 ．培养基成分对转化率影响较大，注意其有 效期。
2 ．小牛血清用前需灭活。
3 ．培养时要保证有足够的气体，保证无菌。
染色镜检观察细胞形态
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操作步骤
1．取肝素抗凝血0.2ml，注入预先加有1.8 ml RPMI 1640培养液的培养瓶内，同时加入 PHA(500g/ml )0.1 ml，对照瓶内不加PHA。 混匀后置37C、5%CO2培养箱内孵育72h，期 间每天旋转摇匀一次。
2．培养结束后，弃去上清，混匀细胞，加入离 心管中，1500rpm 离心10min。