人的外周血淋巴细胞培养

人的外周血淋巴细胞培养

摘要：各种生物的染色体数目是恒定的。大多数高等动植物是二倍体，每一个体细胞含有两组同样的染色体。染色体是显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。通过本实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人外周血淋巴细胞进行核型分析。人外周血中的淋巴细胞几乎都在G1期或G0期是不分裂的。当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，使其恢复增殖能力，随后进入有丝分裂。经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，从而进行核型分析。通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。该方法已为临床医学、病毒学、药理遗传毒理学等方面的广泛应用。

关键词：染色体有丝分裂人的外周血淋巴细胞核型分析

要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显从而利于辨认。每一个体细胞含有两组染色体组，一组来自父方，一组来自母方，用2n表示。其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。每一个配子带有一组染色体叫做单倍体，用n表示，两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。染色体在复制以后，纵向并列的两个染色体，往往通过着丝粒连在一起。着丝粒在染色体的位置是固定的。由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，造成中间着丝粒，亚中间着丝粒，亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。此外，有的染色体还含有随体

和次级缢痕。所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。该方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理得方面广泛应用。

１．材料与方法

1.1材料

1.1.1：实验材料：人的外周血淋巴细胞

1.1.2药品：

RPMI-1640培养基（取1640粉末10.5g溶解在1000ml 的重蒸水中配制成溶液，并加入NaHCO3 1.0-1.2g,用CO2校正pH7.0-7.2，用0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌,待用），肝素（称取126单位/ml的粉末160毫克溶于40ml的生理盐水中，得到550单位/ml的溶液，高压消毒），秋水仙素（称取秋水仙素4mg溶于生理盐水中过滤灭菌，置于冰箱4℃保存），PHA（利用盐浸取法获得），双抗（由100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素制成最终浓度为100单位/ml），磷酸缓冲液（浓度为0.1mol/L，pH7.4-7.6）

1.1.3 器具

灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量桶，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜，载玻片。

1.2.方法

1.2.1超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：

RPMI-1640 4ml

小牛血清 1ml

PHA 0.2ml

肝素 0.05ml

双抗浓度为100单位/ml

用3.5％NaHCO3（无菌）调pH至7.2－7.4，分装到20ml的玻璃瓶中，用橡皮塞塞紧，置于0℃条件下保藏。用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。

1.2.2采血：用2ml注射器吸取肝素0.05ml管壁，酒精消毒皮肤，肘静脉采血约0.3ml，在酒精灯火焰旁立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向5ml培养基中注入轻摇匀后置37℃恒温箱培养

1.2.3培养：时间为72h，培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。

1.2.4秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）

1.2.5收集细胞：将培养物转入洁净离心管中，以3000r/min离心5min，弃上清液。

1.2.6低渗处理: 加入预温37℃的 1ml KCl, 吹打混匀沉淀, 37℃水浴20min。

1.2.7 离心：1000r/m 离心5min, 倒去上清液，收集白细胞。

1.2.8 固定：固定液为甲醇:醋酸为3:1配制。每只离心管中加入固定液2~4ml,片刻后用滴

管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15min后,离心吸弃上清液,留下白细胞。1.2.9 再固定: 重复2.7和2.8一次。

1.2.10再离心：1000r/min离心5min, 弃去上清液，留下白细胞制片。

1.2.11制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。

1.2.12滴片：吸取细胞悬液自10~20cm高滴在从冰箱中取出的一张干燥洁净的载玻片上，

轻吹散，吹干。

1.2.13 染色：用磷酸缓冲液（pH 7.4），稀释过的姬姆萨染液染色20min，倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。

1.2.14镜检：待稍干后，显微镜观察。低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，再在

高倍镜下观察，选择染色体清晰，分散度好的细胞进行显微摄影，进行核型分析。

２.实验结果：

2.1显微镜下观察到的人外周血淋巴细胞

2.2核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，

XY；女子是46，XX。求取已下三个参数：

（1）染色体的相对长度

（2）臂比率

（3）着丝点指数

求取的染色体的相对长度、臂比率、着丝点指数见上次实验报告中。

2.3常规染色体核型分析

根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A.B.C.D.E.F.G 7组共24种类型。本实验的人外周血淋巴细胞采于一女性。

A组：包括1～3号染色体，用M表示。

B组：包括4～5号染色体，用SM表示。

C组：包括6～12号染色体，用SM表示；和X染色体。