人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制片方法、染色体组型分析一、实验背景1、Carnoy固定液：固定液的重要特性是能迅速穿透细胞，将其固定并维持染色体结构的完整性，还要能够增强染色体的嗜碱性，达到优良染色效果。
单纯的固定液一般难以达到这些要求，因此在实验中使用两种混合的固定液。
由于Carnoy首先使用的甲醇和冰乙酸混合液而称其为卡诺氏固定液。
Carnoy固定液（甲醇∶冰乙酸=3∶1）每次使用前需临时配制，长时间放置影响固定效果，固定时间15min至24h，冰箱、室温均可。
必要时可改变甲醇和冰乙酸的比例，冰乙酸比例增加，利于细胞膨胀、染色体铺展，但易导致细胞破裂、染色体散失。
2、低渗液（hypotonic solution）低渗液是指渗透压和离子强度均低于正常细胞生理条件的溶液，渗透压低于组织液，与外周血混在一起时，水分迅速进入细胞，使其膨胀，甚至破裂，获得分散良好的染色体分裂象。
常见的低渗液：水、低渗的柠檬酸钠或氯化钠、甘油磷酸钾（0.65mol/L）、氯化钾（0.075mol/L）等。
低渗效果取决于低渗液的化学组成、低渗的温度和处理时间。
低渗处理是凭借反渗透作用使细胞膨胀染色体铺展，同时可使黏附于染色体的核仁物质散开，以便能在一个平面上观察所有染色体形态。
实验室中一般选用0.075mol/L KCl为低渗液，其优点有：①染色体轮廓清楚，可染色性强，染色时间短。
②用于显带染色时能充分显示带型特点。
低渗处理为37℃，25～30min，以预实验条件为准。
2、肝素N-硫酸和艾杜糖醛酸含量较多的一种糖胺聚糖，由D-β-葡糖醛酸(或L-α-艾杜糖醛酸)和N-乙酰氨基葡糖形成重复二糖单位组成的多糖。
肝素是一种抗凝剂，是由二种多糖交替连接而成的多聚体，在体内外都有抗凝血作用。
2、PHA植物血凝素(Phytohaemagglutinin)是一种有丝分裂原，主要用于激活免疫细胞—淋巴细胞。
是一种干扰素诱导剂，不仅可以刺激机体产生白介素-2和干扰素；还可以刺激机体产生非特异性抗体。
人外周血淋巴细胞体外扩增培养后细胞表型变化及生物学活性的研究的开题报告
人外周血淋巴细胞体外扩增培养后细胞表型变化及生物学活性的研究的开题报告一、选题背景和意义人外周血淋巴细胞是人体免疫系统的主要组成部分，它们在身体抵御病原微生物、肿瘤细胞以及其他异物侵袭方面扮演着关键的角色。
在临床治疗中，利用患者自身的免疫系统对抗肿瘤、感染等疾病已成为一种热门的治疗方式。
而淋巴细胞体外扩增培养技术作为一种重要的免疫治疗手段，已经在多个疾病治疗方面得到了应用和发展。
虽然淋巴细胞体外扩增培养技术已经得到广泛应用，但是目前对于扩增培养后淋巴细胞的表型变化和生物学活性研究还相对不足。
本研究旨在通过体外扩增培养人外周血淋巴细胞，从表型和生物学活性两个方面，对其进行详细的研究，为临床治疗提供科学依据和指导。
二、研究内容和主要技术路线1. 研究内容（1）体外扩增培养人外周血淋巴细胞，观察其数量和比例的变化。
（2）通过流式细胞术检测培养后淋巴细胞的表型变化，包括细胞表面标志物和功能分子的表达情况等。
（3）评估扩增后淋巴细胞的生物学活性，包括细胞的增殖能力、细胞因子的分泌水平等。
2. 技术路线（1）利用Ficoll法从人外周血中分离出淋巴细胞。
（2）利用无血清培养基添加激活剂的方法体外扩增培养淋巴细胞。
（3）利用流式细胞术对扩增后淋巴细胞的表型进行分析。
（4）利用MTT法、ELISA法、Western blot等技术对扩增后淋巴细胞的生物学活性进行分析。
三、研究的预期结果和意义通过对体外扩增培养人外周血淋巴细胞的表型和生物学活性的研究，本研究将能够为淋巴细胞体外扩增培养技术的应用提供科学依据和指导。
本研究结果将可以精确预测淋巴细胞在体外培养过程中不同环节的变化，优化淋巴细胞的体外扩增培养条件，提高治疗效果。
同时，本研究也将为深入了解淋巴细胞的生物学功能、免疫学机制以及人类疾病的发生和发展提供基础数据和新思路。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告
人体外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备实验报告今天咱们来聊聊人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本制备这个实验。
说实话，听到这些名词，可能不少人脑袋都开始发懵了，觉得这不就是一堆复杂的科学术语吗？别急，咱们慢慢捋，听我给你讲讲。
这可不是要你背什么枯燥的理论，而是要带你一起走进实验的世界，让你感受到那种“哦，原来是这么回事”的瞬间。
毕竟，科学嘛，有时候就像拆礼物，总有惊喜！实验的核心就是“外周血淋巴细胞培养”。
乍一听，你是不是就想，外周血、淋巴细胞，都是啥玩意儿？咱们先聊聊外周血吧，这其实就是咱们常常说的“血液”啦。
血液里有好多种细胞，其中淋巴细胞是一类非常重要的免疫细胞，它们在咱们身体里干着“保卫战”的活儿，专门用来对付入侵的细菌、病毒什么的。
简单来说，外周血淋巴细胞培养，就是从咱们的血液里把这些“小卫兵”挑出来，然后在实验室里“喂养”它们，让它们活得更好，变得更强大。
你可能好奇，咱们怎么从血液中把这些淋巴细胞分离出来呢？这个过程就像是“捞金子”。
先把血液给分离开，过滤掉那些不需要的部分，然后通过一些化学方法把淋巴细胞从里面提取出来。
想象一下，就像在沙滩上捡贝壳，虽然周围一片沙子，关键是得挑到最闪亮的那个！而这些淋巴细胞就像是你捡到的宝贝，咱们要把它们培养得越来越强，看看它们会变成什么样子。
咱们要讲到“染色体标本制备”了。
这一步可以说是实验的“高光时刻”，也是最让人兴奋的地方。
你想啊，细胞里的染色体其实就是所有遗传信息的“宝藏”，它们决定了咱们长得像谁、会不会秃头、是不是容易发胖，这些东西统统都藏在里面。
所以，看看这些染色体的“真面目”就成了实验的终极目标。
为了能看清楚它们，咱们要用一些特殊的染色技术，让染色体变得更“显眼”。
你可以想象，染色体就像一张复杂的地图，原本是密密麻麻、看不清楚的，但一旦染上颜色，它们就变得清晰可见，咱们才能一目了然地分辨出它们的结构和形态。
在这个过程中，首先咱们得让细胞分裂。
人外周血培养实验报告
1. 掌握人外周血淋巴细胞体外培养技术。
2. 学习制备染色体标本并进行核型分析。
3. 了解淋巴细胞有丝分裂过程及其影响因素。
二、实验原理淋巴细胞是免疫系统中的重要细胞，在免疫应答和维持内环境稳定中起关键作用。
在体外培养条件下，淋巴细胞受到植物血球凝集素（PHA）的刺激，可转化为淋巴母细胞，进入有丝分裂周期。
通过秋水仙素处理，使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
三、实验材料1. 实验动物：小鼠2. 试剂：PHA、秋水仙素、KCL、甲醇、冰醋酸、PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、肝素、双抗等3. 仪器：显微镜、培养箱、吸管、培养瓶、载玻片、酒精灯、碘酒、无菌棉签等四、实验方法1. 采样：无菌条件下，取小鼠外周血0.5-1ml。
2. 培养液配制：无菌条件下，按照比例配制PRMI 1640或M199培养基、小牛血清、PHA、肝素、双抗等。
3. 细胞培养：将外周血加入培养瓶中，每瓶加20滴左右，轻摇均匀。
将培养瓶置于36℃培养箱中培养72小时，每隔12小时轻摇1次。
4. 秋水仙素处理：在培养72小时后，加入适量秋水仙素，使细胞分裂停滞在中期。
5. 细胞收获：收获细胞，进行低渗处理，使细胞膜破裂，染色体释放。
6. 固定：将低渗处理后的细胞加入甲醇和冰醋酸的混合液中固定。
7. 染色：将固定后的细胞涂片，进行染色。
8. 显微镜观察：在显微镜下观察染色体形态，进行核型分析。
1. 细胞培养：在培养过程中，细胞逐渐增多，形成细胞群体。
2. 秋水仙素处理：细胞分裂停滞在中期，染色体形态清晰。
3. 显微镜观察：观察到人类染色体，男性为46，XY；女性为46，XX。
六、实验讨论1. 外周血淋巴细胞培养的成功与否，取决于培养液的成分和培养条件。
本实验采用PRMI 1640或M199培养基，并加入适量小牛血清、PHA、肝素、双抗等，保证了细胞的正常生长。
2. 秋水仙素处理是本实验的关键步骤。
适量的秋水仙素可以使细胞分裂停滞在中期，便于染色体标本的制备和核型分析。
hpbmc淋巴细胞的培养方法
hpbmc淋巴细胞的培养方法HPBMC（Human Peripheral Blood Mononuclear Cells）是指人外周血单个核细胞，其中包括淋巴细胞、单核细胞和浆细胞。
淋巴细胞是一类重要的免疫细胞，对于免疫系统的功能发挥起着至关重要的作用。
因此，淋巴细胞的培养方法对于研究免疫系统的功能和机制至关重要。
本文将介绍HPBMC淋巴细胞的培养方法。
为了获得HPBMC，我们需要采集新鲜的外周血样本。
在采集外周血样本时，需要使用消毒的器具，避免污染。
一般来说，我们可以选择采用静脉采血的方式，将外周血收集到抗凝剂处理的试管中。
接下来，我们需要将外周血样本进行分离，获取到其中的HPBMC。
常用的分离方法有密度梯度离心法和负选择法。
密度梯度离心法是将外周血样本加入到含有密度梯度溶液的离心管中，经过离心后，不同细胞类型会分布在不同的密度层中，从而实现淋巴细胞的分离。
负选择法是使用磁珠或抗体等对非淋巴细胞进行标记，通过磁力或柱子的作用，将非淋巴细胞分离出去，从而获得HPBMC。
获得HPBMC后，我们需要对其进行培养。
首先，我们需要选择合适的培养基。
常用的培养基包括RPMI-1640培养基、DMEM培养基等。
在培养基中，我们需要添加适当浓度的血清、抗生素和其他生长因子等，以提供细胞所需的营养物质和环境。
接下来，我们将HPBMC加入到培养基中，并将其转移到培养皿中。
在培养过程中，我们需要控制培养皿中的温度、湿度和CO2浓度等环境因素。
一般来说，培养温度为37摄氏度，湿度为95%，CO2浓度为5%。
在培养过程中，我们需要定期更换培养基，以保证细胞的生长和增殖。
通常情况下，每隔2-3天更换一次培养基。
此外，我们还可以根据实验需要添加不同的刺激物，如抗原、细胞因子等，以模拟特定的免疫反应。
在培养的过程中，我们可以通过显微镜观察细胞的形态和增殖情况。
如果需要进一步分析细胞的免疫功能，我们可以使用流式细胞术、ELISA等技术进行检测。
遗传实验05：人外周血培养与染
3、离心前配平，离心速度过高，细胞团不易打散； 反之，细胞易丢失。
4、固定液应在使用前临时配制。
5、载玻片一定要洁净，否则染色体分散不好。
六、实验结果与分析：
染色体核型分析：人类每个体细胞有 46条染色体，22对常染色体和一对性染色 体，男性为46，XY；女性为46，XX。
人类染色体分组
A组（No.1～ 3）：是最大的一组染色体，它们的 着丝粒在中部或几乎在中部，为中部着丝粒染色 体；
B组（N0.4～5）：为两对大的亚中部着丝粒染色 体，它们有明显的长臂和短臂；
C组（N0.6～12+X）：为中等大小的亚中部着丝 粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介 于期间，一般难以区分；
G组（N0.21～22+Y）：为最小的一组近端着丝粒 染色体，在N0.21～22的短臂上可见随体。Y染 色体常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。
人类染色体核型分析结果
重要参数： （1）染色体的相对长度 （2）臂比率 （3）着丝点指数
七、作业及思考题：
1、将分散良好的标本进行显微照相； 2、观察人类染色体的形态、结构特点； 3、对比男性和女性的染色体标本，比较异同； 4、总结做好本实验的关键因素。
每个培养瓶接25－28滴（约0.5ml），轻轻摇匀后 将培养瓶放在37℃温箱中培养72小时。培养过程 中，每天应轻轻摇动两次培养瓶。
3、秋水仙素处理：在终止培养前3-4小时，向培养 瓶中加 20µ g/ml的秋水仙素20µ l，轻轻温箱中取出培养瓶，用吸管将培养液转 入10ml的刻度离心管内。2000转/分，离心10分钟。
外周血淋巴细胞培养的原理
外周血淋巴细胞培养的原理《外周血淋巴细胞培养的原理，我可太有话说啦》嘿，你要是跟我提外周血淋巴细胞培养的原理，那我可就来精神了。
这事儿啊，就像种小植物似的，可有趣了。
咱先说说这外周血淋巴细胞是啥。
这就好比是一群小小的“士兵”在我们身体的血液这个“大战场”里巡逻呢。
它们个儿小小的，但是作用可大了。
有一回啊，我去医院抽血，看到那细细的针头扎进胳膊里，血就那么流出来了，当时就想，这里面可藏着好多淋巴细胞这些小宝贝呢。
那怎么培养它们呢？首先得有个合适的环境，就像咱们人住房子得挑舒服的地儿一样。
这个环境啊，有专门的培养液，那培养液就像是为淋巴细胞特制的“营养粥”。
里面有各种各样的营养成分，像氨基酸啊，葡萄糖啊啥的。
我记得我有次看实验员在准备培养液的时候，那瓶瓶罐罐的可多了。
他拿着小量杯，小心翼翼地量着各种东西，那认真的样子就像在做一件超级精细的艺术品。
然后呢，还得调节好温度和酸碱度。
温度就像是给淋巴细胞盖的被子，不能太热也不能太冷。
就像咱人一样，太热了会出汗难受，太冷了就会冻得打哆嗦。
酸碱度也很重要，要是太酸或者太碱了，淋巴细胞就像住在一个充满怪味的房子里，肯定不乐意生长了。
我曾经不小心把一滴酸液滴到了一个测试酸碱度的试纸上，那试纸一下子就变了颜色，可明显了，这就说明酸碱度变化对环境影响可大了。
接着就是让淋巴细胞在这个舒适的环境里开始分裂繁殖啦。
这就像是小细胞们开始生小宝宝一样。
它们会从一个变成两个，两个变成四个，慢慢地越来越多。
在这个过程中，它们会进行一系列复杂的变化，就像小魔法一样。
我在显微镜下看过一次淋巴细胞的样子，小小的、圆圆的，在培养液里慢悠悠地晃悠着，当时就觉得它们可真神奇。
而且啊，为了让它们长得更好，有时候还得加点刺激物呢。
这刺激物就像是给淋巴细胞的一个小鼓励，告诉它们：“嘿，小细胞们，加油生长呀！”不过这刺激物可不能乱加，就像给人吃药得按照剂量来一样。
你看，外周血淋巴细胞培养就是这么一回事儿。
人外周血淋巴细胞培养
通过人外周血淋巴细胞培养，可以研究疾病的预 防策略，如利用疫苗进行预防接种等。3Fra bibliotek个体化医疗
利用人外周血淋巴细胞培养，可以开展个体化医 疗研究，根据患者的免疫状况制定个性化的治疗 方案。
05
结论
研究成果总结
01
成功建立了人外周血淋巴细胞的培养方法，并观察到了淋巴细胞的生 长和增殖过程。
02
细胞活性检测
使用台盼蓝染色等方法检测细胞的活性。
培养基检测
定期检测培养基的pH值和营养物质浓度， 确保培养条件适宜。
04
人外周血淋巴细胞培养的 应用和前景
在免疫学研究中的应用
免疫应答机制研究
通过人外周血淋巴细胞培养，可以深入了解免疫应答的机 制，包括抗原识别、信号转导、细胞活化等过程。
免疫细胞功能分析
淋巴细胞分为T细胞、B细胞和NK细胞等多种类型，每种细胞类型具有不同的功能和 特点。
淋巴细胞在人体健康和疾病发生中起着至关重要的作用，因此研究淋巴细胞对于了 解疾病机制和开发治疗手段具有重要意义。
淋巴细胞培养技术
淋巴细胞分离技术
淋巴细胞功能检测方法
通过密度梯度离心法和免疫磁珠分离 法等手段从外周血中分离出淋巴细胞。
疫苗免疫原性研究
通过培养的人外周血淋巴细胞，可以研究疫苗对免疫系统的刺激作 用，评估疫苗的免疫原性。
疫苗效果评估
利用人外周血淋巴细胞培养，可以对疫苗进行效果评估，包括疫苗 的保护率、免疫持久性以及对不同人群的适应性等。
在疾病治疗和预防中的应用前景
1 2
疾病治疗
利用人外周血淋巴细胞培养，可以为某些疾病的 治疗提供支持，如肿瘤免疫治疗、自身免疫性疾 病治疗等。
研究意义
实验1人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备
实验一人类外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备【实验目的】(1)了解人类外周血淋巴细胞培养技术。
(2)初步掌握人类外周血淋巴细胞染色体标本的制备技术。
【实验原理】在健康成年人外周血淋巴细胞中，以小淋巴细胞为主。
在通常情况下，它们都处在间期的G1期或G0期，一般情况下不进行分裂。
但在体外适宜培养条件下，它们经有丝分裂原如植物血球凝集素（Phytohemagglutinin，简称PHA）的作用可发生转化而重新进行有丝分裂活动。
因此，当该类细胞在人体外经PHA 刺激短期培养后，经秋水仙素（colchicine）处理使正在分裂的细胞停止在中期，再经低渗和固定等处理，即可得到较多可供分析的中期染色体标本。
【材料】人外周血【器材与试剂】1、主要器材超净工作台，光学显微镜、恒温培养箱、水平式离心机、高压蒸汽消毒锅、水浴箱、冰箱、离心管、滴管、试管架、酒精灯、载玻片等。
2.主要试剂RPMI-1640培养基、小牛血清、PHA(浓度5mg/ml)、秋水仙素(浓度4ug/ ml), 肝素(配制浓度:0. 4%)、固定液(甲醇与冰醋酸按3: 1配制) 、低渗液(0.075 mol/L 氯化钾) Giemsa染液(浓度5%)。
【实验步骤】1.取材与细胞培养在无菌条件下抽取静脉血0.5 ml，立即接种于盛有5 ml RPMI-1640培养液的培养瓶中，加入5mg/ml PHA 20-40ul,轻轻将其摇匀后放在37℃恒温培养箱中。
2、培养至68 -70h。
然后加人秋水仙素0.05 ml，继续培养2-4h，即可获得细胞。
3.染色体标本制备(1)将培养物吸入离心管内，以1500-2 000 r/min离心5-10 min，用吸管小心吸弃上清液。
(2)将预温至37℃的低渗液7-8 ml加入离心管中，用吸管混匀后放人37℃水浴箱中低渗处理10-20 min 。
中途混匀一次。
(3)取出离心管，加入1 ml固定液，缓慢混匀，立即离心5-10 min（15 00-2 000 r/min）。
人类外周血淋巴细胞的培养及染色体标本制备
细胞与遗传学教研室
一、实验目的 1.掌握人类染色体标本的制作方法 2.了解人类染色体形态结构特征
24hrs 时加 入 BrdU
68 hrs 时加 入秋水仙素
人类外周血
植物血球凝集素 ( PHA） 肝素、培养基、小牛血清
体外培养
72 hrs 后 收集细胞
制作玻片标本
固定
预固定 紫外线照射
四、实验方法
1.外周血细胞培养
（1）采血：无菌，肝素抗凝。 用无菌注射器抽取肝素0.2ml,润湿针筒,推出多 余肝素.消毒后,抽取受试者静脉血2ml。） （2）接种培养：每培养瓶加入0.3～0.5ml（10滴）, 接种于装有5ml培养基的培养瓶中，摇匀， 37℃培 养箱中培养68小时。 （20滴） • • （3）秋水仙素处理：0.05～0.4μ g∕ml培养基，轻 摇混匀后，继续培养至72小时 。
人类外周血体外培养收集细胞制作玻片标本固定预固定低渗处理植物血球凝集素pha肝素培养基小牛血清72hrs68hrs入秋水仙素24hrs入brdu紫外线照射giesma染色处理荧光染料染色染色体带的制作方法giesma染色外周血外周血中的淋巴细胞几乎都是处在中的淋巴细胞几乎都是处在gg00期或gg11期期一般情况下是一般情况下是不分裂不分裂的
外周血淋巴细胞
PHA 37℃ 68h
G0期或G1期
秋水仙素 至72 h
三、实验用品
• 1.材料：人体外周血 • 2.器材：培养箱、培养瓶、离心机、刻度离心管、吸 管、恒温水浴锅等 • 3.试剂：培养基、秋水仙素（12.5μ g∕ml）、植物凝 集素（PHA）、肝素、0.075Mkcl低渗液、甲醇、冰乙 酸、PH6.8磷酸缓冲液、Giemsa原液。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［目的与要求］ 1、掌握外周细胞培养物收获方法; 2、掌握外周血细胞染色体标本制备； 3、熟悉相关试剂的配制。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［原理］经低渗处理，细胞膨胀，然后用 固定液使细胞膜蛋白变性，保持细胞处于 膨胀状态；调节上述收获细胞的浓ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ，制 成细胞悬液，滴片，即可得到有丝分裂中 期的染色体标本。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［收获］ 1、离心
将培养物转入刻度离心管内，以1500r/min 离心10min，弃上清液，留下沉淀物。
2、低渗 在离心管中加入预温至37℃的低渗液
（0.075 mol/L KCl）8ml，用吸管轻轻吹打混 匀细胞，置入37℃水浴箱中低渗30min。
人外周血淋巴细胞染色体标本制作
［收获］ 3、预固定
低渗处理后，在离心管中加入固定液[甲醇 : 冰 乙酸=3:1，新配备]2ml或至10ml刻度，混匀。以 1500r/min离心10min，弃上清液，留下约0.5ml液体 盖着沉淀物，轻柔重悬细胞。
4、第1次固定 预固定后，往离心管加入新鲜因定液至10ml刻度，
充分混匀细胞，在室温中固定30min。以1500r/min离 心10min，弃上清液，留下沉淀。
［培养］ 培养72h，并每天将培养瓶振荡1~2次，在终止
培养前2h~4h，在培养物中加入秋水仙素（10mg/L） 0.2ml，混匀，继续培养到收获。
染色体标本制作准备--载玻片清洁
［载玻片清洁］
1、用过饱和洗衣粉溶液浸泡载玻片1h以上； 2、用自来水彻底冲洗干净载玻片上的洗衣粉成分； 3、将干净的载玻片置于长方形浅缸，蒸馏水冲洗3 次后，用蒸馏水浸泡置于冰箱冷冻待用。
人的外周血淋巴细胞培养及染色体制作技术
54生物学通报2011年第46卷第3期人体外周血淋巴细胞培养和染色体标本的制备是遗传学和细胞生物学实验教学中的重要实验项目。
染色体是遗传物质的载体，携带着丰富的遗传信息。
只有获得较好的染色体标本才能进行核型分析，进一步深入地研究染色体的形态、变异和畸变及其与表型或症状之间的关系。
人外周血液中的小淋巴细胞几乎都处在G0期或G1期，一般情况下是不分裂的。
在人工离体培养的条件下，在培养液中加入植物血细胞凝素（PHA），则能刺激小淋巴细胞转化为淋巴母细胞而进行有丝分裂。
这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，经空气干燥法制片，便可获得质量较好的染色体标本。
由于本实验操作过程较繁琐，且实验过程中许多步骤对于实验结果都非常重要，比如PHA效价、外周血接种量、培养温度及酸碱度、秋水仙素加入时间及浓度、低渗时间、固定次数及时间等，所以学生在实验过程中很难全面掌握每个环节，因此，对于学生实验来说实验的成功率也较低。
作者在本实验室现有的条件下，经过长期摸索，总结出了完整且成熟的人外周血淋巴细胞培养及染色体标本制备的实验方法，现将具体方法介绍如下：1材料和方法1.1材料RPMI1640培养基［1］人静脉血：由阜阳师范学院生命科学学院生物科学专业07级学生提供。
1.2方法1）采血。
用一次性2mL注射器抽取肝素稀释液0.2mL，湿润针管，然后将多余的肝素排除。
以75%酒精清洗并消毒供血者肘部皮肤，用橡皮管结扎静脉回流的上端，用注射器抽取静脉血0.5～2mL，然后转动针管，使血液和肝素混合。
2）接种和培养。
先用酒精消毒培养瓶的翻口瓶塞，然后插入针头，将抽得的抗凝血迅速接种到5mL含适量PHA（约0.2mL）及小牛血清的培养瓶中，每瓶接种全血0.4mL左右（6号针头15～20滴），接种过后再次用酒精消毒瓶塞，并在外面用Parafilm封口膜密封好，轻轻摇匀，置37℃培养箱中培养66～72h。
5blood实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析
实验5 人外周血淋巴细胞培养及染色体核型分析5.1 相关基础知识人外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期（G0期），一般情况下是不再分裂的。
在培养液中加入植物凝血素（PAH）时，小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
这样经过短期培养、秋水仙素的处理、低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
目前本方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等领域广泛采用。
人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
根据各组染色体的特征予以分组：A组：（N01～03）是最大的一组染色体，它们的着丝粒在中部或几乎在中部；B组（N04～05）为两对大的亚中着丝粒染色体，它们有显的长臂和短臂；C组（N06～12+X）为中等大小的亚中着丝粒染色体，它们大小相差不多，X染色体大小介于期间，一般难以区分；D组（N013～15）为中等大小的端着丝粒染色体，它们的一个重要形态特征是随体，随体是一对着色很深的小球，处于短臂的末断，随体与短臂之间的区域很少着色；E组（N016～18）包括一对中着丝粒染色体，亚中着丝粒染色体和一对近端着丝粒染色体；F组（N019～20）为两对小的中着丝粒；G组（N021～22+Y）为最小的一组端着丝粒染色体，在N021～22的短臂上可见随体，Y常呈现异固缩状态，着色更深，可以识别。
5.2 实验目的和要求(1)掌握人体微量血液体外培养技术和制备染色体标本的方法；(2)观察人类染色体的形态，并计数、配对、分类和绘图。
5.3 实验材料和仪器5.3.1 实验材料和试剂(1)人的外周血淋巴细胞；(2)Giemsa母液：量取33ml甘油，先在研钵内加入少量甘油与0.5g Giemsa粉混合，研磨至无颗粒为止，再将剩余甘油倒入，搅拌后于56o C水浴保温2小时，再加入33ml甲醇，搅拌均匀后储存于棕色瓶中；(3)Giemsa染色液：将Giemsa母液用0.1M pH7.4磷酸缓冲液稀释至10倍。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要淋巴细胞是免疫系统中最重要的细胞，在免疫中起关键作用，维持内环境的稳定。
对人的外周血淋巴细胞进行染色体核型分析对人类遗传研究及临床应用有重大意义。
每一物种都有一定数目及一定形态结构的染色体，可在显微镜下观察到。
本次实验的目的就是掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人的外周血淋巴细胞进行核型分析。
每1ml 外周血中一般含有约1～3×106个小淋巴细胞，几乎都处于G1期或G0期的非增殖状态，一般情况下是不再分裂的。
但当在培养液中加入植物凝血素（PHA）后，淋巴细胞受刺激便转化为淋巴母细胞，重新进入增殖周期，进行有丝分裂。
经过66～72小时(三个周期)的短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂相细胞，从而进行染色体标本制备和核型分析。
这种微量全血培养技术已在临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理学等方面得到了广泛应用。
本实验采取了人类的外周血进行实验，经各种技术处理后最后得到较为清晰的人体染色体照片。
通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男性是46，XY；女性是46，XX。
根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G7组共23种类型。
关键词人的外周血淋巴细胞染色体低渗溶液核型分析秋水仙素动物细胞体外培养Human Peripheral Blood Lymphocyte CultureAbstract: Lymphocytes are among the most important immune system cells in the immune plays a key role in together, in order to maintain a stable environment. To analyze chromosome of lymphocytes is very important. Various biological chromosome number and shape are constant,can be seen under a microscope. The purpose of this experiment is human body trace blood samples were cultured in vitro chromosome preparation methods and studying on the peripheral blood lymphocyte karyotype analysis on.In human body's 1ml circumference blood includes approximately 1~3×106 the small lymphocyte generally, usually they are between time G0 and the G1 time, generally is not divided. But when adding plant in medium coagulopathy (PHA), lymphocyte transformation and stimulated for lymphatic mother cell proliferation capacity, make its recovery, then entering mitosis. After 66~72 hours(three cycles) short-term training, autumn grain processing, daffodil, low permeability and fixed can be gained lots of mitotic cells, for makes the chromosome specimen preparation and analysis. This kind of micro wholeblood culture technique in aspects and so on clinical medicine, virology, Pharmacology, heredity toxicology obtained widespread application.The experimental taken to conduct experiments on human peripheral blood, the various technical ultimately be treated more clear picture of human chromosomes. Through the experiments have found that each human somatic chromosome, 22 to 46 euchromosome sex chromosomes, and a pair of 46 XY; male is, Women are 46, XX. This method has been clinical medicine and virology, pharmacology, genetic toxicology etc widely. According to the chromosomes of the shape, size, and the centromere position, the peripheral lymphocytes 46 chromosomes into A, B, C, D, E, F, the G7 group of 23 types.Key words: Human blood lymphocytes Chromosome Low permeability solutionKaryotype analysis Autumn daffodils element zooblast in vitro raise offcenter前言细胞培养技术是目前生命科学研究领域的一项常用而重要的技术，它涉及的技术有：无菌操作技术、细胞分离技术、细胞培养技术、显微摄影技术、图像分析技术等。
人体外周血淋巴细胞培养及染色体制片实验原理
实验原理人体的1ml 外周血中一般含有约1-3×106个小淋巴细胞，通常它们都处于间期的GO和G1期。
在培养条件下给予药物刺激时，经过53-72小时可在培养物中获得大量的有丝分裂细胞，供染色体标本制备和分析之用。
这种外周血培养方法是在1960年由Moorhead等所建立的。
人体外周血的形成包括红细胞、白细胞、血小板，其中红细胞和血小板不能离体培养。
血细胞中的小淋巴细胞处于间期的GO和G1期。
在培养时给予药物刺激，可转变为淋巴细胞，随后进行有丝分裂。
这样经过66-72小时短期培养、秋水仙素处理，低渗和固定，就可获得大量有丝分裂的细胞。
这种微量全血培养技术已得到了广泛的应用。
1912年，Warfter 最先研究人类染色体。
1923年，报道人类染色体的二倍体为48条。
细胞遗传学、组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：（1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用：PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
（2）秋水仙素的应用：秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
（3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察。
1956年，J.H.Tjio A.Levan 培养人胚胎组织细胞，计数人体细胞染色体数为46条。
1960年，Moorhead建立人体外周血培养技术，使染色体的研究跃进一步。
1968年，T.U. Casperssan 提出染色体显带技术。
实验试剂RPMI1640培养基，植物血凝素（PHA），小牛血清，肝素，双抗，秋水仙素，低渗液：0.075Mol/L Kcl，卡诺氏固定液，Giemsa染色液，0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6)等。
磷酸缓冲液的配制0.1Mol/L 磷酸缓冲液(pH7.4-7.6):A:Na2HPO4•12H2O 28.8克B:Na2HPO4•7H2O 2.164克KH2PO4 2.67克NaH2PO4•2H2O 0.3克溶解于1000 ml双蒸水中溶解于1000 ml双蒸水中实验设备2ml灭菌注射器，离心机，电子天平，恒温培养箱，除菌滤器，显微镜，酒精灯，载玻片等。
人的外周血淋巴细胞培养
人的外周血淋巴细胞培养摘要：在正常情况下，人外周血淋巴细胞是没有分裂相的，只有在异常情况下才能发现。
植物血球凝集素（PHA）是人类淋巴细胞有丝分裂的刺激剂，在PHA作用下，源出于G0期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，进而进行有丝分裂。
利用PHA的这一特性，淋巴细胞经过含有PHA培养液培养，在体外便可获得丰富的含有丝分裂的生长活跃的细胞群体，终止分裂中期的淋巴细胞便可得到所需要的人体染色体图形。
本实验具有用血量少，操作简单等优点[1]。
关键词：外周血淋巴细胞染色体秋水仙素双抗前言：通过本实验掌握人体外周血离体培养制备染色体标本的方法。
人外周血中的小淋巴细胞几乎都在G1期或G0期，一般情况下是不分裂的。
当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），小淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。
经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。
细胞遗传学组织培养技术为人类染色体的研究提供了条件。
技术突破主要在于：(1）人体外周血淋巴细胞培养和PHA的应用。
PHA 是从菜豆种子中提取出来的，大量的PHA具有凝血作用。
如果适合，可刺激细胞转为母细胞，从而进行有丝分裂。
(2）秋水仙素的应用。
秋水仙素可阻断纺缍体截止于中期，使染色体个体大，结构清晰，缩短适度，细胞质粘度降低。
(3）低渗处理（水或0.075mlKcl）使红细胞胀破，白细胞胀大，染色体空间变大，易伸展，便于观察[2]。
1设备和药品1.1设备低温冷冻离心机；离心管；精密pH试纸；恒温培养箱；恒温水浴锅；棉花；毛细管；玻璃棒；烧杯；载玻片；培养瓶；采血针；冰柜1.2药品RPMI“1640”粉末；NaHCO3粉末；肝素；秋水仙素；植物凝血素（PHA）；青霉素；链霉素；姬姆萨粉末；0.1mol/L磷酸缓冲液；生理盐水；KCl低渗液；蒸馏水；纯甘油；甲醇；酒精2方法2.1药品制备2.1.1 RPMI“1640”培养基：是一种综合培养基，称取“1640”粉末1.05g,用100mL的蒸馏水溶解，如溶液出现浑浊或难以溶解时，可用干冰或CO2处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。
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人的外周血淋巴细胞培养摘要：各种生物的染色体数目是恒定的。
大多数高等动植物是二倍体，每一个体细胞含有两组同样的染色体。
染色体是显微镜下可见细胞有丝分裂过程中出现的结构。
通过本实验掌握人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法并学习对人外周血淋巴细胞进行核型分析。
人外周血中的淋巴细胞几乎都在G1期或G0期是不分裂的。
当在离体培养条件下加入植物凝血素（PHA），淋巴细胞受刺激转化为淋巴母细胞，使其恢复增殖能力，随后进入有丝分裂。
经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞，从而进行核型分析。
通过实验发现：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
该方法已为临床医学、病毒学、药理遗传毒理学等方面的广泛应用。
关键词：染色体有丝分裂人的外周血淋巴细胞核型分析要使细胞在体外长期生存，必须模拟体内环境，共给细胞存活所必需的条件。
如供给适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖以及有关的生长因子；氧气及适宜的温度；注意调节其外环境的酸碱度（pH）与渗透压；以及为排除细胞代谢产物的危害，保持良好适宜的外环境而进行必需的传代等等。
所有这一切条件与操作都要保持在无菌条件下进行。
外周血淋巴细胞是不能增殖的分化细胞群，在体外无菌培养条件下，若于培养基中植物凝集素(PHA)则可刺激处于G期的淋巴细胞转化为淋巴母细胞，重新有丝分裂的能力，经一段时间的培养即可获得大量分裂期细胞以供染色体分析。
秋水仙素(或秋水酰胺)可通过干扰微管组装而抑制纺锤丝形成，使细胞分裂顺利进入后期而停滞于中期，从而可在短期内积累大量最适于进行染色体分中期分裂相。
此外，秋水仙素还能使染色单体缩短、分开，使染色体呈现明显从而利于辨认。
每一个体细胞含有两组染色体组，一组来自父方，一组来自母方，用2n表示。
其中与性别直接有关的染色体，即性染色体，可以不成对。
每一个配子带有一组染色体叫做单倍体，用n表示，两性配子结合后，具有两组染色体，成为二倍体的体细胞。
染色体在复制以后，纵向并列的两个染色体，往往通过着丝粒连在一起。
着丝粒在染色体的位置是固定的。
由于着丝粒位置的不同，可以把染色体分成相等或不等的两臂，造成中间着丝粒，亚中间着丝粒，亚端部着丝粒和端部着丝粒等形态不同的染色体。
此外，有的染色体还含有随体和次级缢痕。
所有这些染色体的特异性构成一个物种的染色体组型。
该方法已为临床医学、病毒学、药理学、遗传毒理得方面广泛应用。
１．材料与方法1.1材料1.1.1：实验材料：人的外周血淋巴细胞1.1.2药品：RPMI-1640培养基（取1640粉末10.5g溶解在1000ml 的重蒸水中配制成溶液，并加入NaHCO3 1.0-1.2g,用CO2校正pH7.0-7.2，用0.22 μm灭菌滤膜抽滤除菌,待用），肝素（称取126单位/ml的粉末160毫克溶于40ml的生理盐水中，得到550单位/ml的溶液，高压消毒），秋水仙素（称取秋水仙素4mg溶于生理盐水中过滤灭菌，置于冰箱4℃保存），PHA（利用盐浸取法获得），双抗（由100单位/ml青霉素和100单位/ml链霉素制成最终浓度为100单位/ml），磷酸缓冲液（浓度为0.1mol/L，pH7.4-7.6）1.1.3 器具灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量桶，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜，载玻片。
1.2.方法1.2.1超净工作台中，100ml培养基含以下成分和比例：RPMI-1640 4ml小牛血清 1mlPHA 0.2ml肝素 0.05ml双抗浓度为100单位/ml用3.5％NaHCO3（无菌）调pH至7.2－7.4，分装到20ml的玻璃瓶中，用橡皮塞塞紧，置于0℃条件下保藏。
用前从冰箱内取出，放入37℃恒温锅中温育10min。
1.2.2采血：用2ml注射器吸取肝素0.05ml管壁，酒精消毒皮肤，肘静脉采血约0.3ml，在酒精灯火焰旁立刻将注射针直接穿过培养瓶的橡胶塞，向5ml培养基中注入轻摇匀后置37℃恒温箱培养1.2.3培养：时间为72h，培养期间，定期轻摇匀，使细胞充分接触培养基。
1.2.4秋水仙素处理：终止培养前2—4小时，在培养液中加入秋水仙碱（用1ml注射器5号针尖滴加2滴，使终浓度为0.07μg/ml）1.2.5收集细胞：将培养物转入洁净离心管中，以3000r/min离心5min，弃上清液。
1.2.6低渗处理: 加入预温37℃的 1ml KCl, 吹打混匀沉淀, 37℃水浴20min。
1.2.7 离心：1000r/m 离心5min, 倒去上清液，收集白细胞。
1.2.8 固定：固定液为甲醇:醋酸为3:1配制。
每只离心管中加入固定液2~4ml,片刻后用滴管轻轻冲打成细胞悬液，在室温中固定15min后,离心吸弃上清液,留下白细胞。
1.2.9 再固定: 重复2.7和2.8一次。
1.2.10再离心：1000r/min离心5min, 弃去上清液，留下白细胞制片。
1.2.11制悬液：弃上清液后，视细胞数量多少加入适量固定液制成细胞悬液。
1.2.12滴片：吸取细胞悬液自10~20cm高滴在从冰箱中取出的一张干燥洁净的载玻片上，轻吹散，吹干。
1.2.13 染色：用磷酸缓冲液（pH 7.4），稀释过的姬姆萨染液染色20min，倒去染液，用蒸馏水轻轻冲洗。
1.2.14镜检：待稍干后，显微镜观察。
低倍镜下寻找分散良好、染色适中的分裂相，再在高倍镜下观察，选择染色体清晰，分散度好的细胞进行显微摄影，进行核型分析。
２.实验结果：2.1显微镜下观察到的人外周血淋巴细胞2.2核型分析：人类每个体细胞有46条染色体，22对常染色体和一对性染色体，男子是46，XY；女子是46，XX。
求取已下三个参数：（1）染色体的相对长度（2）臂比率（3）着丝点指数求取的染色体的相对长度、臂比率、着丝点指数见上次实验报告中。
2.3常规染色体核型分析根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A.B.C.D.E.F.G 7组共24种类型。
本实验的人外周血淋巴细胞采于一女性。
A组：包括1～3号染色体，用M表示。
B组：包括4～5号染色体，用SM表示。
C组：包括6～12号染色体，用SM表示；和X染色体。
D组：包括13～15号染色体，用St表示。
E组：包括16～18号染色体，用SM表示。
F组：包括19～20号染色体，用SM表示。
G组：包括21～22号染色体，用Ot表示；和性染色体。
3.讨论和分析：染色体是遗传物质的载体，存在于分裂间期细胞的细胞核内。
人的染色体有23对、46条，其中22对叫常染色体，男性与女性的常染色体都是一样的；余下的一对叫性染色体，男女不一样，男性的这对性染色体由一个X染色体和一个Y染色体组成，写成XY，女性的则由两条相同的X染色体组成，写成XX。
根据染色体的形态、大小、及着丝粒的位置，将人的外周血淋巴细胞的46条染色体分为A、B、C、D、E、F、G 7组共24种类型。
在做本实验的过程中应注意：（1）接种的血样越新鲜越好，最好是在采血后24小时内进行培养。
（2）人的外周血淋巴细胞培养的最适温度是36.5℃-37.5℃，培养液的最适PH是7.2-7.4。
（3）培养过程中如发现血样凝集，可将培养瓶轻轻振荡，使凝块散开，继续放回37℃恒温箱内培养。
（4）制片过程中，如发现细胞膨胀的不大，细胞膜没有破裂。
染色体没有凝集在一团伸展不开，可将固定时间延长数小时或过夜。
通过本次实验，掌握了人体微量血液体外培养制备染色体标本的方法。
整个实验周期长，操作繁琐，多环节，易受不确定因素干扰。
使得实验过程中仍存在一些问题，例如：由于未经显带且有破碎，试验结果不是很明显，并不能从图得到非常正确的结论。
参考文献[1] 郭善利刘林德.《遗传学实验教程》.科学出版社[2] 张贵友. 《普通遗传学实验指导》. 清华大学出版社[3] 王建波.《遗传学实验教程》. 武汉大学出版社[4] 戴灼华王亚馥栗翼玫. 《遗传学》.高等教育出版社[5] 刘祖洞江绍慧.《遗传学实验》. 高等教育出版社[6] 陈志南. 《细胞工程》科学出版社Human peripheral blood lymphocyte culture Abstract: The chromosome numbers of various organisms is constant. Most of higherplants and animals are diploid, each individual cell contains two sets of the same chromosome. Chromosome is seen under a microscope cell mitosis occurred in the course structure. In this study, to master the human body through the micro-blood in vitro method of preparation of chromosome samples and to learn from human peripheral blood lymphocytes karyotype analysis. Human peripheral blood lymphocytes in almost all the G1 phase or G0 phase is not divided. When the in vitro culture conditions by adding PHA (PHA), lymphocytes stimulated into lymphoblastoid cells to resume proliferation ability, and then entered mitosis. After short-term culture, colchicine treatment, hypotonic and fixed, you can get a large number of mitotic cells, which carry out karyotype analysis. Experiments found that: Every human body cells have 46 chromosomes, 22 pairs of autosomes and a pair of sex chromosomes, men are 46, XY; woman is 46, XX. This method has been to clinical medicine, virology, pharmacology and genetic toxicology, etc. widely used.Key words: Chromosome mitotic human karyotype analysis of peripheral blood lymphocytes。