质粒DNA的小量快速提取(碱裂解法)
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• 9、室温下加入两倍体积的无水乙醇，振荡 混合，室温下静置5min
实验步骤
• 10、12000r/min离心10min，去上清液，加 1ml70%乙醇，短暂振摇，然后再 12000r/min离心5min
• 11、除去所有上清液，待残余乙醇挥发干 净后，加30μLTE缓冲液（PH=8.0）溶解沉 淀，再加1μlRNaseA（1mg/ml），37℃保 温15min，取出后即可用酶切分析或置于20℃保存备用 。
• 2、取1.5ml菌液，转入离心管中， 10000r/min离心1min，吸净上清液
• 3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶 液Ⅰ中，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀
实验步骤
• 4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口， 轻缓颠倒离心管5次，以混合内容物，禁止 剧烈震荡，冰浴2min
• 5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口， 反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂 解物中分散均匀，随后冰浴5min
• 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移 到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９ ５２年由Lederburg正式命名为质粒。
分离质粒DNA方法
• 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目 前常用的
• 碱裂解法； • 煮沸法； • SDS法； • 羟基磷灰石层析法等 • 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分
质粒DNA的小量快速提取 （碱裂解法）
P(BLA) ApaLI (2367)
APr
pUC19
2686 bp
ApaLI (178) ALPHA EcoRI (397) AvaI (413) XmaI (413) SmaI (415) BamHI (418) PstI (440) HindIII (448) P(LAC) ORI
注意事项
• 溶液3的作用：使PH值恢复至中性，质粒 DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合 物沉淀。
• 注意：溶液3加入后应立即混合，避免产生 局部沉淀。
思考题
• １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的 作用分别是什么？加入上述溶液时要注意 哪些问题？
• ２．实验中加入酚、无水乙醇和RNaseA的 作用分别是什么？
注意事项
• 溶液1的作用：分散细胞，蟄合金属离子使 金属酶失活。
• 注意：加入溶液1后，一定要彻底悬浮细菌 沉淀，否则所提质粒DNA的纯度及得率会 大大降低。
质粒类型
• 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质 粒 和 严紧型质粒
• 松弛型质粒：松弛型质粒的复制不需要质 粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供 的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑 制，质粒的复制依然进行。
• 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合 成抑制剂来增加。
主讲人：
组员：刘杰，杨宇光，陈 琪，刘婷婷
ApaLI (1121)
实验背景
• 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb 到200kb。
• 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。
• 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
注意事项
• 溶液2的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂， 核酸和蛋白质变性。
• 注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡， 以免打乱基因组DNA，造成提取的质粒中 混有基因组片段。此时菌液应变得清凉粘 稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受 到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体 过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
煮沸法扩增 曲线
煮 沸 法
碱裂 解法 抽提 质粒
实验原理分析
染色体DNA
碱
变
性 条
性
件
质粒DNA
缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除 去，然后用酚-氯仿抽提，进一步纯化质粒 DNA。上清液中的质粒DNA因不溶于70% 乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。
• 6、用微量台式高速离心机12000r/min离心 5min，将上清液转入另一离心管中
实验步骤
• 7、加等体积酚—氯仿，剧烈震荡1min后， 12000r/min离心5min，将上层液转入另一 离心管中
• 8、加等体积氯仿—异戊醇，剧烈震荡10s 后，12000r/min离心1min，将上层液转入 另一离心管中
子大小、碱基组成及结构等特点加以选择 的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提 取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各 个主要试剂的作用。
实验原理
• 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子， 具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染 色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环 状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复 制并能稳定遗传的遗传因子。
EDTA
对数期菌体
实验流程图
酚-氯仿抽 提（去蛋白）
乙醇沉淀 DNA
溶液1重悬 溶液2裂解
上清液（含 DNA）
溶液3中和
洗涤沉淀
TE溶解 DNA
溶质 液粒
DNA
实验步骤
• 1、将含有pQE30质粒的大肠杆菌TG1 10μL接种到10ml含氨苄青霉素（100μg/ml） 的LB培养液中，37℃振摇过夜
试剂
• 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
• 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
• 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
•来自百度文库酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 • ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM
质粒的应用
• 大多数基因工程使用松弛型质粒。 • 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受
毒害致死的基因。 • 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入
细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工程中具有极广泛的应 用价值。
质粒特点
• 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细 胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。
实验步骤
• 10、12000r/min离心10min，去上清液，加 1ml70%乙醇，短暂振摇，然后再 12000r/min离心5min
• 11、除去所有上清液，待残余乙醇挥发干 净后，加30μLTE缓冲液（PH=8.0）溶解沉 淀，再加1μlRNaseA（1mg/ml），37℃保 温15min，取出后即可用酶切分析或置于20℃保存备用 。
• 2、取1.5ml菌液，转入离心管中， 10000r/min离心1min，吸净上清液
• 3、将细菌沉淀重悬于100μl用冰预冷的溶 液Ⅰ中，用涡旋振荡器彻底悬浮细菌沉淀
实验步骤
• 4、加200μl新配制的溶液Ⅱ，盖紧管口， 轻缓颠倒离心管5次，以混合内容物，禁止 剧烈震荡，冰浴2min
• 5、加150μl用冰预冷的溶液Ⅲ，盖紧管口， 反复颠倒数次，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂 解物中分散均匀，随后冰浴5min
• 质粒通过细菌的结合作用，从雄性体转移 到雌性体， 是细菌有性繁殖的性因子. １９ ５２年由Lederburg正式命名为质粒。
分离质粒DNA方法
• 从大肠杆菌中分离质粒DNA方法众多，目 前常用的
• 碱裂解法； • 煮沸法； • SDS法； • 羟基磷灰石层析法等 • 各方法分离是依据宿主菌株类型、质粒分
质粒DNA的小量快速提取 （碱裂解法）
P(BLA) ApaLI (2367)
APr
pUC19
2686 bp
ApaLI (178) ALPHA EcoRI (397) AvaI (413) XmaI (413) SmaI (415) BamHI (418) PstI (440) HindIII (448) P(LAC) ORI
注意事项
• 溶液3的作用：使PH值恢复至中性，质粒 DNA复性，染色体DNA与蛋白质-SDS复合 物沉淀。
• 注意：溶液3加入后应立即混合，避免产生 局部沉淀。
思考题
• １．简要叙述溶液Ⅰ、溶液Ⅱ和溶液Ⅲ的 作用分别是什么？加入上述溶液时要注意 哪些问题？
• ２．实验中加入酚、无水乙醇和RNaseA的 作用分别是什么？
注意事项
• 溶液1的作用：分散细胞，蟄合金属离子使 金属酶失活。
• 注意：加入溶液1后，一定要彻底悬浮细菌 沉淀，否则所提质粒DNA的纯度及得率会 大大降低。
质粒类型
• 质粒按复制方式分为两种类型：松弛型质 粒 和 严紧型质粒
• 松弛型质粒：松弛型质粒的复制不需要质 粒编码的功能蛋白，完全依赖于宿主提供 的半衰期较长的酶。即使蛋白质合成受抑 制，质粒的复制依然进行。
• 严紧型质粒复制需要一个质粒编码的蛋白， 质粒的拷贝数不能通过用氯霉素等蛋白合 成抑制剂来增加。
主讲人：
组员：刘杰，杨宇光，陈 琪，刘婷婷
ApaLI (1121)
实验背景
• 质粒是染色体外的DNA分子，大小可为1kb 到200kb。
• 大多数来自细菌的质粒是双链、共价闭合 环状的分子，以超螺旋形式存在。它是细 菌内的共生型遗传因子。
• 其复制和遗传独立于细菌染色体，但复制 和转录依赖于宿主编码的蛋白和酶。
注意事项
• 溶液2的作用：使细胞壁在碱性条件下破裂， 核酸和蛋白质变性。
• 注意：此步需轻柔混合，不要剧烈震荡， 以免打乱基因组DNA，造成提取的质粒中 混有基因组片段。此时菌液应变得清凉粘 稠，所用时间不应超过5min，以免质粒受 到破坏。如果未变得清亮，可能由于菌体 过多，裂解不彻底，应减少菌体量。
煮沸法扩增 曲线
煮 沸 法
碱裂 解法 抽提 质粒
实验原理分析
染色体DNA
碱
变
性 条
性
件
质粒DNA
缠结的染色体DNA与不稳定的大分子RNA、 蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除 去，然后用酚-氯仿抽提，进一步纯化质粒 DNA。上清液中的质粒DNA因不溶于70% 乙醇后通过离心得到质粒DNA沉淀。
• 6、用微量台式高速离心机12000r/min离心 5min，将上清液转入另一离心管中
实验步骤
• 7、加等体积酚—氯仿，剧烈震荡1min后， 12000r/min离心5min，将上层液转入另一 离心管中
• 8、加等体积氯仿—异戊醇，剧烈震荡10s 后，12000r/min离心1min，将上层液转入 另一离心管中
子大小、碱基组成及结构等特点加以选择 的，其中碱变性法既经济且收得率较高,提 取的质粒DNA可用于酶切,连接与转化。
实验目的
• 掌握碱裂解法提取质粒的原理、步骤及各 个主要试剂的作用。
实验原理
• 质粒是一种染色体外能够稳定遗传的因子， 具有双链共价闭环结构的DNA分子。是染 色体外小型（1-200kb）的共价、闭合、环 状的双链DNA分子（cccDNA），能自主复 制并能稳定遗传的遗传因子。
EDTA
对数期菌体
实验流程图
酚-氯仿抽 提（去蛋白）
乙醇沉淀 DNA
溶液1重悬 溶液2裂解
上清液（含 DNA）
溶液3中和
洗涤沉淀
TE溶解 DNA
溶质 液粒
DNA
实验步骤
• 1、将含有pQE30质粒的大肠杆菌TG1 10μL接种到10ml含氨苄青霉素（100μg/ml） 的LB培养液中，37℃振摇过夜
试剂
• 溶液Ⅰ： 50mM 葡萄糖 25mM Tris·HCl（pH8.0） 10mM EDTA
• 溶液Ⅱ：（新鲜配制） 0.2N NaOH 1% SDS
• 溶液Ⅲ： 5M KAC 10ml 冰醋酸 11.5ml 水 28.5ml
•来自百度文库酚，氯仿，乙醇 RNase 琼脂糖 • ＴＥ： 10mM Tris-HCl(pH8.0) 1mM
质粒的应用
• 大多数基因工程使用松弛型质粒。 • 严紧型质粒用来表达一些可使宿主细胞受
毒害致死的基因。 • 质粒的特点使质粒成为携带外源基因进入
细菌中扩增或表达的重要媒介物，这种基 因运载工具在基因工程中具有极广泛的应 用价值。
质粒特点
• 质粒能在细菌中垂直遗传并且赋予宿主细 胞一些表型，是比病毒更简单的原始生命。