流式常用试剂配制
流式细胞术样品制备技术(完整)
流式细胞术样品制备技术流式细胞术对细胞的分析检测必须基于单细胞的基础上，这是流式细胞术的基本要求。
因此就必须把实体组织制备成单细胞悬液。
在应用FCM技术中，制备出合格的单分散细胞是流式细胞术样本制备技术中重要的一环。
它要求这种分散细胞方法既要使细胞成为单个细胞，又能保持细胞的固有生物化学成分及生物学特性。
流式细胞术样品制备大致可分为下面五个步骤：①取材：取手术或活检组织必须具有代表性，如取手术肿瘤组织，必须取瘤细胞生长旺盛部位；组织等标本必须在取材后保持样本的新鲜；一般在室温1个小时之内处理好样本或及时用固定剂或低温对组织进行保存；②对细胞的待测生物化学成分进行荧光染色；③按照厂家提供的软件程序对样本进行获取、检测和存储；④再依照软件提供的程序对检测结果进行定量分析；⑤检测分析结果在生物、医学上的意义进行分析和评价。
第1节样本单细胞悬液的制备方法一新鲜实体组织样本的制备FCM对单细胞快速进行各种参数分析必须基于单细胞基础上，根据各种组织成分的特点，可选择不同的分散细胞方法，以期达到单细胞产额高、损伤少的目的。
尽管标本制备已形成了标准化的程序，但实际操作中总会出现这样或那样的问题。
在实体组织分散为单个细胞过程中，解离的方法可能瞬间地或持久地影响细胞的性质、形态、结构、功能等。
所以，在对各种不同组织进行分散选择方法时，应尽量减少对细胞的这种影响。
目前常用的分散组织细胞的方法有如下3种。
（一）酶消化法1 作用原理：对实体组织分散的作用原理主要有3方面：①可以破坏组织间的胶原纤维、弹性纤维等；②可以水解组织间的粘多糖等物质；③可以水解组织细胞间的紧密联结装置的蛋白质物质。
酶消化法是实体瘤、培养细胞分散为单细胞的主要方法之一。
常用的酶类试剂有：蛋白酶类——胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、链酶蛋白酶和中性蛋白酶等，都能解离组织中的细胞。
胰蛋白酶能水解脂键和肽键；胶原酶能降解几种分子类型的胶原；溶菌酶能水解糖蛋白和肽的糖苷键；弹性蛋白酶能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤维。
常用试剂及缓冲液的配制
65%(V/V)甘油
配 制 量： 配制方法：
配方： 65%(V/V) 丙三醇
100ml
1. 量取 65ml 甘油（丙三醇） 2. 加入 35ml ddH2O，混匀 3. 高温高压灭菌后，4℃保存 4. 或无菌操作，用灭菌 1.5ml 离心管趁热
分装，-20℃保存
10%(V/V)甘油
1M MgCl2
配 制 量： 配制方法：
配方： 1M MgCl2
1L
1. 称取 203.3g MgCl2·6H2O 固体置于烧 杯中
2. 加入 700ml ddH2O，充分溶解 3. 定容至 1L 4. 高温高压灭菌，室温保存
2M MgCl2
配 制 量： 配制方法：
配方： 2M MgCl2
1L
1. 称取 406.6g MgCl2·6H2O 固体置于烧 杯中
100ml
1. 量取 56.9ml ddH2O 2. 加入 43.1ml 浓 HCl（11.6N），混匀 3. 室温保存 注意：先加入水，再加浓盐酸
2.5N HCl
配 制 量： 配制方法：
配方： 2.5N HCl
100ml
1. 量取 78.4ml ddH2O 2. 加入 21.6ml 浓 HCl（11.6N），混匀 3. 室温保存 注意：先加入水，再加浓盐酸
pH＝ Y
I (ml)
5.8
91.5
6.0
86.8
6.2
80.8
6.4
72.2
6.6
61.9
6.8
50.3
7.0
38.5
7.2
28.3
7.4
19.8
7.6
13.4
7.8
实验常用试剂、缓冲液的配制方法.
实验常用试剂、缓冲液的配制方法1、1M Tris-HCl □组份浓度 1 M Tris-HCl （pH7.4，7.6，8.0）□配制量 1L□配置方法 1. 称量121.1gTris置于1L烧杯中。
2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3. 按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值。
pH值浓HCl 7.4 约70mL 7.6 约60mL 8.0 约42mL4. 将溶解定容至1L。
5. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
2、1.5 M Tris-HCl □组份浓度 1.5 M Tris-HCl （pH8.8）□配制量 1L□配置方法 1.称取181.7gTris置于1L烧杯中。
2. 加入约800mL的去离子水，充分搅拌溶解。
3. 用浓盐酸调pH值至8.8。
4. 将溶液定容至1L。
5. 高温高压灭菌后，室温保存。
注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1℃，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
3、10×TE Buffer □组份浓度 100 mM Tris-HCl，10 mM EDTA （pH 7.4，7.6，8.0）□配制量 1L□配置方法 1. 量取下列溶液，置于1L烧杯中。
1 M Tris-HCl Buffer（pH7.4，7.6，8.0） 100mL 500 mM EDTA（pH8.0） 20mL2. 向烧杯中加入约800mL的去离子水，均匀混合。
3. 将溶液定至1L后，高温高压灭菌。
4. 室温保存。
4、3 M 醋酸钠□组份浓度 3 M 醋酸钠（pH5.2）□配制量 100mL□配置方法 1. 称取40.8gNaOAc•3H2O置于100～200mL烧杯中，加入约40mL的去离子水搅拌溶解。
2. 加入冰乙酸调节pH值至5.2。
流动注射试剂配制(简版)
流动注射分析仪试剂配制简表氰化物①0.025M氢氧化钠（载流和吸收液）1g氢氧化钠/升，脱气，保存在塑料瓶中，临用现配。
②缓冲溶液（PH=4.0）97g磷酸二氢钾/升，脱气。
③氯胺-T4g氯胺-T/升，脱气，保存在棕色瓶中，临用现配。
④异烟酸/巴比妥酸显色剂12g氢氧化钠、13.6g无水巴比妥酸、13.6g异烟酸逐一溶解于1升水中，使用国产异烟酸时溶液必须过滤。
⑤蒸馏试剂（PH=3.8）3.3g乙酸锌、13.21g酒石酸、3.5g氢氧化钠逐一溶解于1升水中。
总氰化物①0.025M氢氧化钠（载流和吸收液）1g氢氧化钠/升，保存在塑料瓶中，脱气，临用现配。
②缓冲溶液（PH=4.0）97g磷酸二氢钾/升，脱气。
③氯胺-T4g氯胺-T/升，脱气，保存在棕色瓶中，临用现配。
④异烟酸/巴比妥酸显色剂12g氢氧化钠、13.6g无水巴比妥酸、13.6g异烟酸逐一溶解于1升水中，使用国产异烟酸时溶液必须过滤。
⑤蒸馏试剂50ml磷酸/升。
挥发酚①蒸馏试剂300ml磷酸/升。
②4-氨基安替比林显色剂0.64g4-氨基安替比林/升，脱气，临用现配。
③铁氰化钾缓冲液（PH=10.3）2g铁氰化钾、3.1g硼酸、3.75氯化钾逐一溶解后加1.88g氢氧化钠，调节PH到10.3±0.1，定容到1升并脱气。
④载流去离子水，脱气。
阴离子表面活性剂①载流200ml甲醇/升，脱气。
②碱性硼酸钠28.6g硼酸钠、6g氢氧化钠溶解1升水中。
③亚甲基蓝储备液1.5g亚甲基蓝/升，过滤。
④亚甲基蓝中间液100ml亚甲基蓝储备液、100ml碱性硼酸钠加入到500ml分液漏斗中，再加入20ml 氯仿，震荡摇匀，静置分层，将氯仿放出，重复9次，再用30ml氯仿冲洗分液漏斗内壁，无需震荡，弃去氯仿即可。
将液体转移到一升容量瓶中，加入4ml 硫酸，定容到一升，过滤。
⑤碱性亚甲基蓝60ml亚甲基蓝中间液、200ml甲醇、200ml碱性硼酸钠到1升，脱气。
流式细胞术实验方法(周期,凋亡,表面抗原等)
流式细胞术实验方法PI 染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。
4、离心，弃上清液。
5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。
7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。
8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。
9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。
GFP PI染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。
3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。
以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9）细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。
2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。
3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。
用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。
4、离心弃上清液。
5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。
6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。
细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。
离心，弃上清。
4、 PBS 1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。
流式常用试剂配制精选文档
流式常用试剂配制精选文档TTMS system office room 【TTMS16H-TTMS2A-TTMS8Q8-一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入 10％的NaN3。
3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至，使用前新鲜配制。
5、消化液：％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或％胰蛋白酶与％ EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4Cl ，KHCO3 ，EDTA?2Na ，溶于100ml水中，调PH 至，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：L PBS液（PH ）＋1％BSA＋％Na2N3。
8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH ）＋1％FBS（或BSA）＋％NaN3＋％saponin（Sigma的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、％NaN3的PBS（PH ）。
10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加～ PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2OKH2PO4葡萄糖溶于800ml双蒸水2）％酚红溶液：取酚红置玻璃研钵中，逐滴加入 NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入 NaOH 10ml。
流式细胞仪检测常用试剂配制
流式细胞仪检测常用试剂配制1．氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)贮存液(10×)：80.2g NH4Cl (1.5M)8.4g NaHCO3(100mM)3.7g EDTA Na2(10mM)蒸馏水900 ml调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)加蒸馏水至1升4℃保存6个月以内工作液(1×)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存注: 1) 贮存液不可小于10×, 否则会形成碳酸铵而失效2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代3) 有些科研工作者习惯采用1/10浓度的EDTA, 即 1mM EDTA Na2或0.32mM EDTA Na42．PBS(phosphate-buffered saline, 磷酸缓冲液)配制0.23 g NaH2PO4(无水; 1.9 mM)1.15 g Na2HPO4(无水; 8.1 mM)9.00 g NaCl (154 mM)加蒸馏水至 900 ml若需要, 用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4过滤除菌, 4℃保存注: 1) 不调pH值, pH通常约为7.32) 有些实验室将PBS配成 10×浓缩液, 用时稀释3．1% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液配制0. 5g 多聚甲醛加至45ml蒸馏水中, 加4ml 10N的NaOH, 加温至65℃. 待粉末完全溶解(通常在30分钟以内)后, 加5ml10× PBS, 调节pH值至7.4, 0.2mm滤膜过滤除去未溶颗粒.注: 4℃可保存2周4．用氯化铵溶血剂的溶血方法1)100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀2) 避光孵育10~15分钟3) 离心, 去上清, PBS洗2次4) 抗体染色后, PBS洗5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2℃-直至上机检测5．血小板活化检测1. 先固定后染色1) 将100ml全血加入1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛中(100ml全血至少可做20tests)2) 2℃-8℃固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬5) 取50ml重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟6) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时2. 先染色后固定1) 5ml全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟2) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2℃-8℃避光30分钟, 但不可超过24小时注: 1) 抗凝剂可选用EDTA或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用2) 染色或固定应在采血后10分钟内进行3) 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活,造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定4) 1987年 Shattil SJ等的经典方法：¨ 采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。
实验室常用试剂、缓冲液的配制方法
附录一实验室常用试剂、缓冲液的配制方法(一) 1 M Tris-HCl(1 L)1.称量121.1 g Tris置于1 L烧杯中2.加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3.按下表量加入浓盐酸调节所需要的pH值；PH值浓HCl7.4 约70 mL7.6 约60 mL8.0 约42 mL4.将溶液定容至1 L；5.高温高压灭菌后，室温保存；注意：应使溶液冷却至室温后再调定pH值，因为Tris溶液的pH值随温度的变化差异很大，温度每升高1°C，溶液的pH值大约降低0.03个单位。
(二)0.5 M EDTA(1 L)1.称取186.1 g Na2EDTA·2H2O，置于1 L烧杯中；2.加入约800 mL的去离子水，充分搅拌；3.用NaOH调节pH值至8.0(约20 g NaOH)；注意：pH值至8.0时，EDTA才能完全溶解；4.加去离子水将溶液定容至1 L；5.适量分成小份后，高温高压灭菌；6.室温保存。
(三)50×TAE Buffer (pH8.5)(1 L)1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中；Tris 242 gNa2EDTA.2H2O 37.2 g2. 向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3. 加入57.1 mL的醋酸，充分搅拌；4. 加去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
(四)10× TBE Buffer (pH8.3)(1 L)1.称量下列试剂，置于1 L烧杯中；Tris 108 gNa2EDTA.2H2O 7.44 g硼酸55 g2.向烧杯中加入约800 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3.去离子水将溶液定容至1 L后，室温保存。
(五)40%丙烯酰胺(1 L)1.称量下列试剂，置于2 L烧杯中；丙烯酰胺Alrylamatide 380 g甲叉丙烯酰胺Bis-Alrylamatide 20 g2.向烧杯中加入约400 mL的去离子水，充分搅拌溶解；3.去离子水将溶液定容至1 L；4.37°C过夜，充分溶解。
流式细胞仪标本的制备
流式细胞仪标本的制备(一)原理活细胞表面保留有较完整的抗原或受体，先用特异性鼠源性单克隆抗体与细胞表面相应抗原结合，再用荧光标记的第二抗体结合，根据所测定的荧光强度和阳性百分率即可知相应抗原的密度和分布。
(二)操作步骤制备活性高的细胞悬液(培养细胞系、外周血单个核细胞、胸腺细胞、脾细胞等均可用于本法)↓用10％FCS RPMI1640调整细胞浓度为5×10６～１×10７／ml↓取40μl细胞悬液加入预先有特异性McAb(5～50μl)的小玻璃管或塑料离心管，再加50μl 1∶20(用DPBS稀释)灭活正常兔血清↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加洗涤液2ml左右1000rpm×5min↓弃上清，加入50μl工作浓度的羊抗鼠(或兔抗鼠)荧光标记物，充分振摇↓4℃30min用洗涤液洗涤2次，每次加液2ml左右1000rpm×5min↓加适量固定液(如为FCM制备标本，一般加入1ml固定液，如制片后在荧光显微镜下观察，视细胞浓度加入100～500μl固定液)↓FCM检测或制片后荧光显微镜下观察(标本在试管中可保存5～7天)(三)试剂和器材1.各种特异性单克隆抗体。
2.荧光标记的羊抗鼠或兔抗鼠第二抗体，灭活正常兔血清。
3.10％FCS RPMI1640, DPBS、洗涤液、固定液(见附录)。
4.玻璃管、塑料管、离心机、荧光显微镜等。
(四)注意事项1.整个操作在4℃下进行，洗涤液中加有比常规防腐剂量高10倍的NaN３，上述实验条件是防止一抗结合细胞膜抗原后发生交联、脱落。
2.洗涤要充分，以避免游离抗体封闭二抗与细胞膜上一抗相结合，出现假阴性。
3.加适量正常兔血清可封闭某些细胞表面免疫球蛋白Fc受体，降低和防止非特异性染色。
4.细胞活性要好，否则易发生非特异性荧光染色。
附:1. DPBS (×10, 贮存液)NaCl 80gKCl 2g 蒸馏水加至1000mlNa２HPO４11.5g 临用时用蒸馏水1∶10稀释KH２PO４2g2.洗涤液DPBS900mlFCS 50ml (终浓度5％)4％NaN３50ml (终浓度0.2％)3.固定液DPBS1000ml葡萄糖20g (终浓度2％)甲醛10mlNaN３0.2g (终浓度0.02％)间接抗体的对照问题：间接免疫荧光标记法取一定量的细胞悬液(约1X106 细胞／ml )，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原-抗体-抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。
流式细胞术样品制备(完整)
一、单层培养细胞分散为单个细胞
㈠贴壁的单层培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤： 1、将单层培养细胞(对数生长期)中的旧培养液倒掉。
2、加入少量0.25%胰酶，消化细胞，在倒置显微镜下观
察，见细胞稍变圆时，立即终止消化（假如含有10%胎 牛血清的培养基），收集细胞，离心后去上清，PBS液
洗涤细胞一次，离心去掉上清液，约留0.5ml细胞悬液， 用振荡器使细胞分散。
实验证实，用化学试剂处理组织导致细胞 成活率降低，细胞产额较低，细胞碎片和细胞 丛结的量不稳定，因此，化学试剂处理方法不 单独使用，可与其他方法联合使用。 机械法常常造成严重的细胞损伤，较低的 细胞产量，为使细胞碎片不影响FCM检测结果， 需采用适当的方法除去碎片或尽量减少碎片。 酶学法对实体肿瘤的分散解聚是较理想的， 但是会对所测化学成分造成不良影响，所以根 据使用目的去选择合适的单细胞悬液制备方法， 才能获得理想的样品和更好的FCM结果。
3、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
（二）悬浮培养细胞单细胞悬液的制备
操作步骤：
1、离心去除旧培养液，PBS液洗涤细胞一次，离心去掉 上清液，约留0.5ml细胞悬液，用振荡器使细胞分散。
2、如果不是及时上机检测，则需要对细胞进行固定，常 规固定液为70%乙醇，然后保存于4℃冰箱中。
注意事项： 一定将石蜡从组织中脱干净，检验是否将石蜡 脱净的方法是，弃去二甲苯，加入100%乙醇， 如无絮状物浮起，即视为石蜡已脱净，反之则 没有脱净。 消化时间不可过长，以免造成已释放出的细胞 核被消化掉。 切片不可过薄或过厚，过薄则碎片增多，影响 流式分析结果，过厚造成脱蜡不净或脱蜡时间 过长，一般以40-50μm为宜。
流式细胞仪常用技术方法)
流式细胞仪常用技术方法细胞周期/DNA分析（PI法）一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体）三、实验步骤1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）；4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次；5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min；7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光染色30min；8.用300目滤网过滤，上机检测。
细胞周期/DNA分析(BD公司CycleTEST PLUS DNA Reagent Kit)一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。
二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：没有染色的细胞（制备过程如下1-6）三、若做DNA倍体分析，需另设附加对照管肿瘤细胞和外周血单核细胞的混合管，比例至少为2：1四、实验步骤1. 将细胞消化后，用冷PBS洗细胞两次，300g×5min（若细胞数过少可提高转速到500g），为减少细胞损失可用1.5ml离心管离心；2. 弃上清留大约50ul下面的液体防止碰到细胞团，加入1ml Buffer Solution并低速混匀细胞。
流式常用试剂配制
一、流式细胞术常用试剂1、10％NaN3：将10gNaN3溶解于100ml蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3％BSA/PBS：100ml PBS中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10％的NaN3。
3、500mmol/L EDTA：将186g EDTA?Na2?2H2O溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4％多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4，使用前新鲜配制。
5、消化液：0.25％胰蛋白酶（用培养液或PBS配制）或0.25％胰蛋白酶与0.02％EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4Cl 4.16g，KHCO3 0.5g，EDTA?2Na 0.02g，溶于100ml水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml，4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）＋1％BSA＋0.1％Na2N3。
8、常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4）＋1％FBS（或BSA）＋0.1％NaN3＋0.1％saponin（Sigma 的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2％的BSA、0.1％NaN3的PBS（PH 7.4）。
10、PI染液（保存液，10×，用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加0.3ml～0.5ml PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCl 160gMgSO4?7H2O 2gKCl 8gMgCl?6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2O 3.04gKH2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4％酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。
流式细胞术的样品制备
流式细胞术的样品制备节概述待测标本的制备是流式细胞术分析的关键，本节分别直接免疫荧光标记、间接免疫荧光标记、微量全血法免疫荧光标记、双标记、培养细胞DNA荧光标记与细胞凋亡检测样品的制备。
知识点导航1.直接免疫荧光标记的样品制备用标有荧光素的特异抗体对细胞进行直接染色，然后用流式细胞仪检测，阳性者即表示有相应抗原存在。
实验步骤如下：(1)每份取100 μl单细胞悬液(细胞密度约1×106个细胞)。
(2)一份加入相应量的异硫氰酸荧光素或者藻红蛋白标记的特异性荧光直标单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗，作为阴性参照样品。
(3)室温下避光反应一定时间(时间长短根据试剂说明书要求进行)，通常在室温下反应15～30min 即可。
(4)加入500 μl磷酸缓冲液重悬成单细胞悬液即可上机检测。
2.间接免疫荧光标记的样品制备(1)取1×106个细胞/100μl，先加入一抗混匀，置室温下避光反应30 min。
(2)用PBS洗涤细胞2次，离心沉淀弃掉上清液(离心转数通常为800～1000 r/min，5 min)。
(3)用100 μl PBS重悬细胞，再加入FITC或者PE标记荧光二抗(用量均按说明书要求加入)混匀，室温下反应30 min。
(4)用PBS再洗涤细胞2次，加入500 μl PBS重悬成单细胞悬液，上机检测。
注意：以上两种染色方法的抗体加入量与反应时间，没有非常具体的规定，通常应根据试剂使用说明书的要求进行。
若说明书上未说明，应先进行预实验，掌握好剂量与最佳反应时间后，再进行流式样品的制备。
制备好的样品，若不能及时上机检测，用1％～4％的多聚甲醛固定，4℃下可储存5d。
3.微量全血法免疫荧光标记的样品制备目前制备全血细胞样品的方法很多，且很成熟，常用的方法是用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞，然后进行特异性荧光染色，其染色方法与前面介绍的方法相同。
下面要紧介绍与流式细胞仪配套的Q PREP(免疫学样品处理器)进行快速制备微量全血样品的方法：(1)微量全血直接荧光染色法：具体方法为①取肝素或者EDTA抗凝全血100 μl置12 mm×75 mm 专用塑料试管中；②每份加入20 μl特异性荧光单抗，另一份加入荧光标记的无关单抗作阴性参照，室温下避光染色15 min；③置 Q PREP 仪上溶解红细胞、稳固与固定白细胞，静置5 min；④上流式细胞仪检测。
人Tregs细胞流式检测
人FOXP3流式检测( 一)、实验材料实验设备: 流式上样管、混匀振荡器、离心机、移液器、Tips、流式细胞仪( 二)、样品制备：1、将静脉血20ｍl用ACD抗凝剂以容积比血：抗凝剂＝9：1抗凝处理。
2、按血：分离液＝1：2注入国产淋巴细胞分离液上层，400g 20℃离心30分钟。
3、中膜层重浮于4倍体积的RPMI1640并通过离心法200g，10min洗三次。
4、获得单个核细胞。
( 三)、试剂准备1、（请于实验步骤第三步时配置，建议现配现用）固定破膜剂工作液的配制：将eBioscience Fixation/Permeabilization Concentrate和eBioscienceFixation/Permeabilization Diluent按1：3的比例混匀。
例如：四个样本，则将1ml eBioscience Fixation/Permeabilization Concentrate加入到3m 的eBioscience Fixation/Permeabilization Diluent l里面混匀即得工作液。
此工作液放置不能超过一天。
2、破膜缓冲液的配制：将eBioscience Permeabilization Buffer (10X)和去离子水或双蒸水按1：9比例混匀，每次实验之前新鲜配制，现配现用，每管实验大概需要10ml左右。
( 四)、实验步骤1、每个标本分A,B两管，A管标记为试验管，B管标记为同型对照管。
每管各加入100ul制备的细胞（1-2x106）。
2、按照惯例先标记表面分子。
每管加入20ul的CD4， CD25混合抗体，4°C暗处孵育30分钟。
3、用冷的2ml的Flow Cytometry Staining Buffer溶液洗细胞4、300-400xg离心5分钟，倒掉上清液，用涡旋振荡机震荡一下。
5、每管中加入1ml新鲜配制的固定破膜剂工作液重悬细胞，用移液器吸打混匀。
Cellevent流式
流式：(试剂准备：cellenvent 死细胞染料血清，opti PBS 冰盒) 50ulDMSO+1管染色使终浓度为5uM/L，celle envent的浓度为2mM/L,48孔板每孔加入0.6ul cell envent进行染色。
1配制cell envent染色液。
用opti来配，每孔250ulopti+0.6ul cellenvent （共染44个孔，配46个孔11.5ml opti+27.6ul cellenvent）2.将染液加到细胞版，(加到新的48孔板，用排枪加) 37度孵育30min3.期间配制死细胞染液。
（11.5ml PBS+46ul 死细胞染料）4.洗板子，然后每孔加入250ul死细胞染料，然后冰上孵育30分钟。
5.吸出染液，用500ul入预冷的pbs将细胞吹打下来。
用300目筛子过滤细胞至流式管中。
6.上流式，分析数据注意事项 1.转染时注意对照的设置，要设置空白即不转染对照，并且以此作为参照设置凋亡细胞的门2.染色时要注意避光3.细胞上流式前必须过滤，防止堵塞仪器。
Staining protocol1. Add CellEvent™ Caspase-3/7 Green Detection Reagent at a final concentration ofbetween2–8 μM to the sample and/or appropriately induced cells and incubate for 30 minutesat 37°C.We recommend initial testing between 2–10 μM of CellEvent™ Caspase-3/7 GreenDetectionReagent; however, optimal concentration may be more or less depending on model.Note: It is best to prepare an intermediate dilution of CellEvent™ Caspase-3/7DetectionRegent in complete medium, mix it well by pipetting, and then add the diluted solution to thecells so that the final concentration of the reagent on the cells is 5 µM. Incubation can also beperformed successfully at room temperature (25°C).2. Optional: Cells can be preserved with a formaldehyde-based fixative at this stage. Fixationwith 3.7% formaldehyde for 15 minutes is recommended, but this can be altered based on thecell type.3. Optional: Cells can be stained with a nuclear or other counterstain at this step.4. Optional: To stabilize and prolong the signal, ProLong® Gold antifade reagent (Cat. no.P36934) can be used for ultimate overnight mounting. For quick mounting, SlowFade® Goldantifade reagent (Cat. no. S36937) can be used.6. Image the cells using the appropriate instrument filter sets such as those used for FITC andthe Alexa Fluor® 488 dye. The excitation/emission maxima for the CellEvent™ Caspase-3/7Green Detection Reagent is 502/530 (Figure 1, page 1).。
流式triton x100破膜染色实验步骤
流式triton x100破膜染色实验步骤一、溶液与试剂注: 利用反渗透去离子水(RODI)或同等级别的水制备溶液。
1X磷酸盐缓冲盐水（PBS）: 配制1 L的1X PBS: 添加100 ml 10X PBS(#12528)至900 ml水, 然后将其混合。
4%甲醛, 无甲醇(#47746)细胞通透缓冲液: 购买即用型(#39487)或者通过添加30µl Triton™X-100至10 ml抗体稀释缓冲液来制备10 ml。
4°C保存。
抗体稀释缓冲液：购买即用型流式细胞术抗体稀释缓冲液(#13616), 或在100 ml 1x PBS中溶解0.5 g牛血清白蛋白(BSA)(#9998)来制备0.5%BSA PBS缓冲液。
4°C保存。
推荐的二抗：要检测未偶联的抗体, 请选择与您的一抗（例如兔）的宿主物种匹配的二抗。
点击此处以获取被批准用于流式细胞术的二抗的最新列表。
二、固定与透化注: 固定前, 应分离贴壁细胞或组织, 使它成为单细胞悬浮液。
注: 理想的离心条件根据细胞类型和试剂容量有所不同。
一般, 1-5分钟150-300g将足以使细胞沉淀下来。
注: 如果使用全血, 则需在固定前裂解红细胞并通过离心分离来洗涤。
注：如果表位被甲醛和/或Triton™X-100破坏, 可以在固定前添加靶向CD标记物或其他胞外蛋白的抗体。
在固定和透化过程期间,这类抗体将保持与目的靶标结合。
如果您不确定, 请进行小规模实验。
通过离心使细胞沉淀下来, 移除上清液。
按每100万个细胞大约100µl 4%甲醛重悬细胞。
混匀以解离沉淀物并防止各个细胞交联。
室温(20-25°C)固定15分钟。
通过离心用过量1X PBS洗涤。
将上清液弃于合适的废液缸中。
在每一百万个细胞约100μl细胞透化缓冲液中重悬细胞。
在室温孵育10分钟。
继续进行染色或将细胞在PBS中-4°C保存过夜。
三、免疫染色注: 使用血细胞计数器或备选方法计数细胞。
流式细胞仪检测常用试剂配制
流式细胞仪检测常用试剂配制流式细胞仪检测常用试剂配制1．氯化铵溶血剂(Ammonium chloride lysing solution,)贮存液(10×)：80.2g NH4Cl (1.5M)8.4g NaHCO3(100mM)3.7g EDTA Na2(10mM)蒸馏水900 ml调节pH至7.4 (用1N HCl 或NaOH)加蒸馏水至1升4℃保存6个月以内工作液(1×)：蒸馏水1:9稀释, 新鲜配制, 冷藏保存注: 1) 贮存液不可小于10×, 否则会形成碳酸铵而失效2) NaHCO3可由10g KHCO3替代, EDTA Na2可由3.66g EDTA Na4(8.2mM)替代3) 有些科研工作者习惯采用1/10浓度的EDTA, 即1mM EDTA Na2或0.32mM EDTA Na42．PBS(phosphate-buffered saline, 磷酸缓冲液)配制0.23 g NaH2PO4(无水; 1.9 mM)1.15 g Na2HPO4(无水; 8.1 mM)9.00 g NaCl (154 mM)加蒸馏水至 900 ml若需要, 用1M NaOH或1M HCl调节pH至7.2~7.4过滤除菌, 4℃保存注: 1) 不调pH值, pH通常约为7.32) 有些实验室将PBS配成10×浓缩液, 用时稀释3．1% 多聚甲醛(paraformaldehyde)固定液配制0. 5g 多聚甲醛加至45ml蒸馏水中, 加4ml 10N的NaOH, 加温至65℃. 待粉末完全溶解(通常在30分钟以内)后, 加5ml 10× PBS, 调节pH值至7.4, 0.2mm滤膜过滤除去未溶颗粒.注: 4℃可保存2周4．用氯化铵溶血剂的溶血方法1)100ml 全血加2mL氯化铵溶血剂, 混匀2) 避光孵育10~15分钟3) 离心, 去上清, PBS洗2次4) 抗体染色后, PBS洗5) 1ml 1%多聚甲醛固定, 2℃-直至上机检测5．血小板活化检测1. 先固定后染色1) 将100ml全血加入1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛中(100ml全血至少可做20tests)2) 2℃-8℃固定30分钟. (固定的血小板可保存5天)3) 抗体染色前, 1200g室温离心5分钟4) 去上清, PBS洗1次, 1ml PBS重悬5) 取50ml重悬液, 加适当抗体, 避光孵育15-20分钟6) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2oC-8oC避光30分钟, 但不可超过24小时2. 先染色后固定1) 5ml全血加入适当抗体, 避光孵育15-20分钟2) 加1ml 1% 冷(2℃-8℃) 多聚甲醛, 2℃-8℃避光30分钟, 但不可超过24小时注: 1) 抗凝剂可选用EDTA或柠檬酸钠, 但不能用肝素, 因肝素对血小板有刺激活化的作用2) 染色或固定应在采血后10分钟内进行3) 先固定后染色可降低血小板的自发活化, 避免标本处理过程中的人为活化, 然而有些血小板活化抗原, 如PAC-1, CD62p等在固定剂的作用下会失活,造成表达率的降低, 因此需要先染色再固定4) 1987年 Shattil SJ等的经典方法：¨ 采血时掌心朝上，轻扎或不扎止血带，肘前静脉采血。
流式细胞术的样品制备
为使组织细胞分散下来，应用酶学方法必须注意条件的 选择和影响因素：
※ 酶需要溶解于适当的溶液中，而这种溶液不致于造成 酶 效价降低
※ 注意组织在消化液中的消化时间
※注意酶活性的PH值
※ 注意酶的适用浓度
※ 随时注意影响酶活性的其他因素
各种酶的分散程度都有一定的限制性，特别是在进行免 疫标记实验时，酶处理可能改变细胞膜的成分，从而影响细 胞亚群的区分。应指出，用于组织分散的很多酶是不够纯的， 不仅含有一种占主导的酶，而且在不同程度上也混有其他污 染物质，它们的活性可能有利于组织分散，也可能对组织的 结构或功能产生不利的影响。
FCM的实验对象是单细胞或单细胞核的 悬液，在FCM技术中制备出合格的单细胞悬液 是非常重要的一环，这些单细胞悬液主要来源 于单层细胞、血液、脱落细胞、实体组织及石 蜡包埋组织等。
流式细胞术的样品制备
一、实体组织单分散细胞的制备 ㈠新鲜实体组织
新鲜实体组织是手术或活检后根据 检测目的而采取的样品，此样品应及时 进行适当的保存处理，如及时用固剂或 低温对组织进行保存，以避免由于室温 过高、放置时间过长而造成组织自溶， 影响检测结果。
酶消化法是实体组织分散为单细胞的主要方法，常用 的酶类试剂有： • 蛋白酶类，(如胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，链蛋白酶和中性 蛋白酶等)都能够释放所有组织中的细胞； • 胰酶，能水解脂键和肽键； • 胶原酶，能降解几种分子类型的胶原； • 溶菌酶，能水解糖蛋白和肽的糖苷键； • 弹性蛋白酶，能消化连接组织的糖蛋白和弹性蛋白的纤 维，可用于解离血管、心脏和肝脏的细胞。
流式细胞术的样品制备
⒉机械法 机械法分裂实体组织包括：用剪刀剪碎或
用锋利的解剖刀剁碎，用匀浆器匀浆，用细注 射针头抽吸细胞或细胞器悬液以分散细胞，采 用网搓法同样也能获得大量的细胞，机械法易 造成细胞悬液中细胞碎片和细胞丛结量的不稳 定，所以机械法常与其他方法配合使用。
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流式常用试剂配制，、流式细胞术常用试剂1、10% NaN3:将10gNaN3 溶解于100ml 蒸馏水中，室温保存；活体实验或在辣根过氧化酶反应中可不使用NaN3。
2、3% BSA/PBS : 100ml PBS 中加入3g BSA，使之溶解，再加入0.2ml 10%的NaN3。
3、500mmol/L EDTA :将186g EDTA?Na2?2H z O 溶解于400ml蒸馏水中，用NaOH将PH调至8.0，补充蒸馏水至500ml，分装，高压灭菌，室温保存。
4、4%多聚甲醛：在磁力搅拌下，将4g多聚甲醛溶于100ml PBS，加入数滴NaOH，在通风柜中于60度加热，使其溶解，调整PH至7.4,使用前新鲜配制。
5、消化液：0.25%胰蛋白酶（用培养液或PBS 配制）或0.25%胰蛋白酶与0.02% EDTA的混合液。
6、红细胞裂解液：NH4CI 4.16g, KHCO 3 0.5g, EDTA?2Na 0.02g,溶于100ml 水中，调PH 至7.2，补充蒸馏水至500ml, 4度储存，使用时需恢复至室温。
7、流式细胞抗体稀释剂：0.1mmol/L PBS液（PH 7.4）+ 1% BSA + 0.1% Na2N3。
&常用细胞破膜剂：PBS液（PH 7.4） + 1% FBS （或BSA） +0.1%NaN3+ 0.1%saponin （Sigma 的效果不错）。
9、流式细胞染色洗涤液：含2%的BSA、0.1% NaN3 的PBS （PH 7.4）。
10、PI染液（保存液，10人用于细胞周期和凋亡检测）：10mg PI溶于10ml PBS，加入2mg 无DNA 酶的RNA酶，4度保存备用。
应用时，10倍稀释，每管加0.3ml〜0.5ml PI染液。
11、Hanks液的配制（BSS，主要用于培养液、稀释剂和细胞清洗液，不能单独作为细胞、组织培养液）原液ANaCI 160gMgSO4?7H2O 2gKCI 8gMgCI?6H2O 2gCaCl2 2.8g溶于1000ml双蒸水原液B1）Na2HPO4?12H2O 3.04gKH 2PO4 1.2g葡萄糖20.0g溶于800ml双蒸水2）0.4%酚红溶液：取酚红0.4g置玻璃研钵中，逐滴加入0.1N NaOH并研磨，直至完全溶解，约加入0.1N NaOH 10ml。
将溶解的酚红吸入100ml 量瓶中，用双蒸水洗下研钵中残留的酚红液，并入量瓶中，最后补加双蒸水至100ml。
将1）液和2）液混合，补加双蒸水至1000ml 即为原液B。
应用液：原液A 1份原液B 1份双蒸水18份混合后，分装于200ml小瓶中，高压灭菌。
临用前用无菌的5.6%NaHCO3调PH至7.2〜7612、磷酸盐缓冲液的配制（PB）A 液（0.2mol/L NaH 2PO4 水溶液）：NaH 2PO4?H2O 27.6g,溶于蒸馏水中，稀释至1000ml。
B 液（0.2mol/L Na2HPO4水溶液）：Na2HPO4?7H2O 53.6g加蒸馏水溶解，加水至1000ml。
不同PH值PB的配制：A液xml （参照下表）中，加入B液yml，为0.2mol/L的PB。
若再加蒸馏水至200ml，则成0.1mol/L PB。
PH x/ml y/ml5.793.56.55.892.0 8.05.990.0 10.06.0 87.7 12.36.185.0 15.06.281.5 18.56.377.5 22.56.473.5 26.56.568.5 31.56.662.5 37.56.756.5 43.56.851.0 49.06.945.0 55.07.0 39.0 61.07.133.0 67.07.228.0 72.07.323.0 77.07.419.0 81.07.516.0 84.07.613.0 87.07.710.0 90.07.88.50 91.07.97.00 93.08.0 5.30 94.7 13、PBS的配制配制PBS,只要在相应的PB基液中加入8.5g/L NaCI即可。
二、常用激活剂1、激活剂PMA :用DMSO配制成0.1mg/ml，分装20ul/管，一20度保存。
勿反复融冻。
实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1: 100稀释储存液，终浓度为20ng/ml。
2、激活剂离子霉素：用乙醇配制成浓度为0.5mg/ml的储存液，—20度保存。
实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1: 10稀释储存液，终浓度为1ug/ml。
3、Staphylococcal enterotoxin B(SEB):用无菌无叠氮钠PBS调节浓度0.5mg/mL , 4C储存，SEB 终浓度10ug/mL。
4、CD3 :包被在培养板中，在蛋白转运抑制剂存在下活化未稀释的血液细胞。
5、CD28 :加速不同刺激剂（包括SEB、CD3 等）的活化效应，浓度一般为10ug/ml。
6、阻断剂Bregeldin A :用DMSO配制成浓度为5mg/ml的储存液，分装20ul/管，—20度保存。
勿反复融冻。
实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1: 10稀释储存液，在激活过程最后4〜5小时使用BFA，终浓度为10ug/ml。
7、阻断剂莫能菌素：用DMSO配制成浓度为1mg/ml的储存液，4C储存至少4个月，实验时用无菌、无叠氮钠PBS 1: 10稀释储存液，终浓度为2umol/L。
三、常用抗体标记荧光染料的特性及其应用1、FITC :激发波长488nm，最大发射波长525nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）可用于荧光显微镜技术4）荧光强度易受PH值影响，PH值降低时其荧光强度减弱。
2、Alexa Fluor 488:激发波长488nm，最大发射波长519nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL1通道检测；3）具有超乎寻常的光稳定性，非常适用于荧光显微镜技术；4）在较宽的PH值范围内保持稳定（PH4〜10）3、Cy3:激发波长488nm,最大发射波长570nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于PE。
4、Cy5 :激发波长633/635nm，最大发射波长670nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备633nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL4通道检测；3）适用于荧光显微镜技术；4）同样为小分子染料，非常适合需小分子染料的流式细胞术，荧光强度低于APC。
5）与单核和粒细胞非特异性结合多，易出现假阳性结果。
5、PE:激发波长488nm，最大发射波长575nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备488nm氩离子激光器的流式细胞仪；2）在流式细胞仪的FL2通道检测；3）其荧光泯灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术，但适用于激光共聚焦显微镜技术。
6、PE-TR :激发波长488nm ,最大发射波长615 nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
7、PE-Alexa Fluor 610 :激发波长488nm，最大发射波长628nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL3通道检测；2）荧光强度高；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
& PE-Alexa Fluor 647 :激发波长488nm，最大发射波长668nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）不易湮灭；3）可适用于小功率激光器的流式细胞仪，也可使用于大功率激光器的大流式细胞仪。
9、PE-Cy5 :激发波长488nm，最大发射波长670nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4）可与FITC、PE搭配，荧光干扰小、补偿小，但不宜与APC搭配。
5）与单核细胞和粒细胞非特异性结合多。
10、PE-Cy5.5 :激发波长488nm，最大发射波长694nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）淬灭性强，不适用于传统的荧光显微镜技术；4）可与FITC、PE、APC搭配，荧光干扰小、补偿小，是APC比较理想的搭配。
11、PE-Alexa Fluor 700 :激发波长488nm，最大发射波长723nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）光淬灭性很强，要绝对避光。
12、P E-Cy7 :激发波长488nm，最大发射波长767nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可适用于大、小功率的流式细胞仪；3）光淬灭性很强，要绝对避光；4）可与FITC、PE搭配，与FITC无光谱重叠，与APC搭配荧光干扰小，补偿小，是比较理想的搭配。
13、T R :激发波长595nm,最大发射波长615nm。
1）其标记的抗体适用于配备Texas Red激光器的流式细胞仪；2）荧光不易淬灭，可用于荧光显微镜。
14、A PC :激发波长633/635nm,最大发射波长660nm。
1 ）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）在BD细胞仪的FL4通道检测，在Beckman Coulter细胞仪只有配备双激光器的FC500才能检测到15、APC-Cy5.5 :激发波长633/635nm,最大发射波长668nm。
1）其标记的抗体适用于所有配备氦氖激光器的流式细胞仪；2）主要用于四色以上的流式细胞术。
16: PerCP :激发波长488nm，最大发射波长677nm。
1）在Beckman Coulter流式细胞仪的FL4通道检测，BD细胞仪FL3通道检测；2）可于FITC、PE搭配，荧光光谱重叠少，对随细胞的特异性结合少，但量子产量较低，适用于较高表达物的检测。