卵母细胞体外成熟的机制与临床应用
犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展
犬卵母细胞体内发育及体外成熟的研究进展曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【摘要】In this paper, the factors affecting the development of canine oocytes in vivo and in vitro maturation are reviewed, and its culture methods are summarized in order to provide a theoretical basis for overcoming the obstacles of canine related assisted reproductive technology and protecting precious and endangered species.%本文就犬卵母细胞体内发育及体外成熟的影响因素进行综述, 并对其培养方法进行了总结, 以期为克服犬相关辅助生殖技术的障碍, 保护珍贵和濒危犬种提供理论基础.【期刊名称】《特产研究》【年(卷),期】2019(041)001【总页数】6页(P109-114)【关键词】犬;卵母细胞;体内发育;体外成熟【作者】曹满园;张宇飞;王丽英;曹俊国;李文;韩玉萍;许保增;王守富【作者单位】中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;中国农业科学院特种经济动物分子生物学重点实验室,长春 130112;吉林农业大学,长春 130118【正文语种】中文【中图分类】Q954.42犬科动物多为季节性、单次发情动物，但经驯养的家犬，其季节性发情特点逐渐消失，全年均可出现发情，尤其春、秋季节的发情比例较高[1]。
试论牛卵母细胞体外受精技术
试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。
体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。
针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。
1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。
该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。
1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。
在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。
1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。
将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。
1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。
《外源谷胱甘肽促进绵羊卵母细胞体外发育及其改善砷暴露后发育异常的研究》范文
《外源谷胱甘肽促进绵羊卵母细胞体外发育及其改善砷暴露后发育异常的研究》篇一一、引言随着畜牧业的快速发展，绵羊的繁殖效率及胚胎质量已成为养殖业的重要关注点。
然而，环境污染物如砷等重金属元素对绵羊生殖系统的影响日益凸显，导致卵母细胞发育异常，进而影响胚胎质量和繁殖效率。
谷胱甘肽作为一种重要的生物活性物质，具有抗氧化、抗凋亡等作用，其在促进卵母细胞体外发育方面具有巨大潜力。
本研究旨在探讨外源谷胱甘肽对绵羊卵母细胞体外发育的促进作用及其在砷暴露后改善发育异常的效果。
二、材料与方法1. 材料实验所用绵羊卵母细胞、培养基及其他试剂均采购自专业供应商。
砷暴露实验中使用的砷化合物及其浓度根据相关文献设定。
2. 方法（1）卵母细胞采集与处理：从健康成年绵羊卵巢中采集卵母细胞，进行体外成熟培养。
（2）实验分组：将卵母细胞分为对照组、谷胱甘肽处理组和砷暴露组，以及谷胱甘肽预处理后砷暴露组。
（3）培养与观察：在设定条件下进行体外培养，观察并记录各组卵母细胞的发育情况。
（4）数据分析：采用统计学方法对实验数据进行处理和分析。
三、实验结果1. 谷胱甘肽对绵羊卵母细胞体外发育的促进作用实验结果显示，外源谷胱甘肽处理组的卵母细胞在体外发育过程中的成熟率、受精率及胚胎发育率均显著高于对照组，表明谷胱甘肽对绵羊卵母细胞的体外发育具有显著的促进作用。
2. 砷暴露对绵羊卵母细胞发育的影响砷暴露组的卵母细胞在体外发育过程中出现明显的发育异常，包括成熟率降低、受精障碍及胚胎发育受阻等。
这表明砷暴露对绵羊卵母细胞的发育具有显著的负面影响。
3. 谷胱甘肽对砷暴露后卵母细胞发育异常的改善作用谷胱甘肽预处理后砷暴露组的卵母细胞在体外发育过程中的各项指标均有所改善，与砷暴露组相比，成熟率、受精率及胚胎发育率均有显著提高，表明谷胱甘肽具有改善砷暴露后卵母细胞发育异常的作用。
四、讨论本研究结果表明，外源谷胱甘肽能够显著促进绵羊卵母细胞的体外发育，提高其成熟率、受精率及胚胎发育率。
牛卵母细胞体外成熟的培养体系及影响因素研究
较广‘ ， 泛 缓冲系 以 Ｈ ｐｓ ｅｅ 或碳 酸氢盐为好 ， 酸盐缓 冲系较 磷
差。
４ 血 清对体外成熟的影响 ． ２
血 清成 分较为复杂 ． 不同Ｊ清 缸
其 成 分 也 有 明显 区别 进 而 导致 不同 的 培 养 效 果 。 清 内含 有 血
挥 巨大作用。 本文将 就现阶段牛 卵母细胞体外成熟培养体系 及影响因素的研 究情况加 以综述 。
草 食 动 物
牛 巧 母 细 胞 体 夕 成 熟 酌 ＝ 养 体 ｐ 卜 ｌ ：
系及 影响 素酌 研
曹 亮ｌ ＿ ３，聂 旭
１０ ３ ） ５ ￣ ０ ６
牛 卵母 细胞 培养 常用 的基 础 培养 液有
（ ． 阳农业 大 学畜牧 兽 医学 院 ，沈 阳 １ ０ ６ ；．黑龙 江省 家 畜繁 育指导 站 。哈尔 滨 １ ０ ６ ； １沈 １ １２ １ ５ ０ ９ ３黑龙 江省 农 垦总局 动 物卫 生监 督所 。 尔滨 ． 哈
牛 体 外 生 产 Ｏ Ｐ中 ， 应 用 ３ ～３ ℃ 。 Ｖ） 多 ８ ９ ２ 体 外 培 养 气 相 卵 母 细 胞 成 熟 培 养 现 多 用 两 种 气 相 ： 一 种是含 ５ ％的 Ｃ Ｏ 、相对 湿 度 １０ ０ ％的 空 气 ，另 一 种 是 含 ５ ％
４３ 生殖激素 对体 外成熟 的影 响 ．
目前牛 卵母细胞 体外成 熟培 养 （Ｖ Ｊ Ｉ Ｍ 技术 体系 已经建
立 起 来 ， 在 不 断 的探 索 与 完善 当 中 。 国 内外 的 研 究 热 点 主 并
４１ 基础 培 养液 ．
Ｔ Ｍ１９ Ｈ ｍ’ １ ， ａ ｓ Ｆ ２和 Ｃ ｌ ，其 中 Ｔ Ｍ１９应 用 Ｃ ９ ， ａ ｓ ０ Ｈ ｍ’ １ Ｒａ ａ Ｃ ９
绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展
绵羊和山羊卵母细胞体外成熟研究进展王中伟，岳顺利，周佳勃∗东北农业大学生命科学学院,黑龙江哈尔滨（150030）E-mail:wzw006336@摘要：本文介绍当前在绵羊和山羊卵母细胞采集和体外成熟方面的研究进展。
卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量。
卵母细胞采集方法分为从死亡动物和活体采卵两大类。
死亡动物采卵主要有抽吸法和切割法。
缺点是得到的是不同发育阶段的卵母细胞，而且要牺牲供体的生命。
先进的活体采卵技术有两种分别是腹腔镜采卵和超声波引导阴道穿刺采卵。
它们优点是对母羊损伤小、利用率高。
卵母细胞冷冻保存有助于提高优质卵母细胞的利用率。
最后还阐述了影响卵母细胞质量和产量的因素，例如，激素、血清、卵泡液、生长因子等一些因素的作用。
关键词：绵羊，山羊，卵母细胞，采卵，体外成熟中图分类号：S8111 引言中国养羊业历史悠久，绵羊和山羊品种多样，羊产品也十分丰富。
绵羊和山羊不但具有经济价值，而且可以作为许多疾病研究的很好的实验动物模型。
近些年，国内外在家畜生殖技术研究，特别是在绵羊和山羊的生殖技术方面取得了很大进展，例如第一个体细胞核移植成功的动物就是绵羊。
此外，这些应用在绵羊和山羊上的生殖技术还可用于保护野生濒临灭绝的小型反刍动物[1]。
众所周知，卵母细胞体外成熟（IVM）是进行体外胚胎生产（IVP）、克隆以及辅助生殖（ART）的基础。
本文介绍了目前绵羊和山羊卵母细胞成熟技术的研究进展和影响因素。
2 卵母细胞的采集和保存2.1采集前的促性腺激素处理绵羊或者山羊卵巢经过促性腺激素处理后能够提高可采集卵泡的数量，性未成熟羔羊经促性腺激素处理后也可做为供体[2]。
研究表明，促性腺激素处理羔羊得到的卵母细胞数量高于同样处理的成年山羊，但是二者卵母细胞的体外发育的情况却相似[3]。
绵羊经FSH处理两天得到的卵母细胞的回收率和卵裂率大于处理三天。
在绵羊同步发情实验中发现，恒定剂量处理比递减剂量FSH处理获得的卵母细胞质量更好而且对冷冻保存的耐受能力更强[4]。
胚胎工程技术在动物育种中的应用
胚胎工程技术在动物育种中的应用彭露【摘要】随着社会不断进步,传统的动物育种手段已经不能完全满足人们对动物育种的需求,胚胎工程技术作为动物育种的新兴技术,已经在动物育种中得到广泛应用.文章简要介绍了胚胎工程技术中的体外受精技术、胚胎分割技术、胚胎移植技术和胚胎性别鉴定技术,以期为胚胎工程技术在动物育种中更好的应用提供理论依据.【期刊名称】《湖南畜牧兽医》【年(卷),期】2018(000)001【总页数】4页(P48-51)【关键词】胚胎工程;动物;育种;繁殖【作者】彭露【作者单位】湖南省永州市零陵区畜牧水产局,湖南永州425000【正文语种】中文【中图分类】S814.8随着人们对胚胎工程技术研究的不断深入，体外受精、胚胎移植、胚胎分割、胚胎性别鉴定等技术在商业化市场上已到了普遍的应用，其对生产效益的提升也受到了相关人员广泛的关注。
除了在生产上，胚胎工程技术对于提高动物的繁殖水平，缩短育种年限，保存优良遗传资源等方面的效果已日益凸显，因此胚胎工程技术也已成为了动物育种的主要技术手段。
1 体外受精体外受精技术是指在动物体外特定的环境中进行的精卵结合的受精过程。
目前为止，国内外对于动物体外受精技术的研究已经有一百余年的发展历史，最初的体外受精尝试是在1878年由美国的Scherk利用豚鼠和家兔进行的，此后，经过更多科学家对体外受精的研究与尝试，终由美国科学家Brackett通过体外受精技术，培育出了世界上第一头体外受精牛。
随后，更多的家禽动物也通过此方式相继繁殖成功，目前，体外受精技术已在世界范围进行了商业应用，并获得了巨大的经济回报。
在动物育种中的优势主要体现在如下三个方面：首先就是充分发挥优良母畜的繁殖潜力，以奶牛为例，一头奶牛的卵巢中大约含有几万个生殖细胞，但是受到生育过程的限制，一头奶牛一生中只能繁育出十几头奶牛后代，这对于优质奶牛来说，无疑是资源的浪费，通过体外受精技术，可以充分利用优良母畜的优良基因，充分发挥优良母畜的生殖潜力。
Sirt2在哺乳动物卵母细胞成熟过程的调节作用与机制研究
量代谢等多种生理过程。近年来，关于 Sirt2 调节哺乳动物卵母细胞发育能力的相关研究受到越来越多的关注。
本文主要综述了 Sirt2 的生物学特性和在哺乳动物卵母细胞成熟过程中的作用与调节机制，旨在为提高哺乳动
物卵母细胞质量及胚胎发育提供参考。
关键词：Sirt2；卵母细胞；成熟；哺乳动物
中图分类号：S814
文献标识码：A
DOI 编号：10.19556/j.0258-7033.20200810-04
随着动物胚胎生物技术的快速发展，对于高质量卵
母细胞的需求日益增加。卵母细胞体外成熟技术成为获
得成熟卵母细胞的重要途径，但现有体外成熟培养体系
生产的卵母细胞质量和发育潜能远低于体内成熟的卵母 细胞 [1]。因此，研究卵母细胞成熟机制，优化体外成熟
微管蛋白是纺锤体的主要组成部分，是最丰富的非 组蛋白之一，正常纺锤体的装配和功能需依赖微管动力 学的调控，微管通过动粒与染色体着丝粒连接参与染色体 分离过程。敲低小鼠卵母细胞的 Sirt2 后，出现大量游离 的着丝点，造成着丝粒 - 微管间的稳定性降低 [5]。BubR1 是 纺 锤 体 组 装 检 验 点（SAC） 的 主 要 成 分。Qiu 等 [29] 研究发现，Sirt2 通过去乙酰化 SAC 蛋白 BubR1-K243 影响着丝粒 - 微管之间的相互作用。另有研究表明， RAB35/RAB23/KIF17/KIF18a 等 蛋 白 能 够 通 过 影 响 Sirt2 调控微管蛋白乙酰化水平变化 。 [30-32] 因此，Sirt2 能够通过影响组蛋白和微管蛋白乙酰化状态，调控染色 体分离与纺锤体组装，促进卵母细胞成熟。 3.2 Sirt2 调节氧化应激 Sirt2 可通过调控卵母细胞的 抗氧化能力抵抗氧化应激，影响卵母细胞成熟。ROS 是影响卵母细胞质量和发育潜能的主要因素之一，过多 的 ROS 会影响卵母细胞成熟并阻滞胚胎发育。而细胞 抗氧化系统成分，如超氧化物歧化酶（SOD）、锰超氧 化物歧化酶（MnSOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘 肽（GSH）等，可使卵母细胞避免体外成熟过程中 ROS 诱导的有害作用。Xu 等 [18] 研究发现，抑制牛卵母细胞 中 Sirt2 的表达可乙酰化 FoxO3a，降低其下游抗氧化基 因 SOD2 和 CAT 的表达，导致氧化还原稳态的紊乱。反
未成熟人卵母细胞体外成熟的临床应用进展
未成熟人卵母细胞体外成熟的临床应用进展徐玉萍【摘要】未成熟人卵母细胞体外成熟(IVM)具有治疗简单、药物使用少,减轻患者经济负担、避免卵巢过度刺激等优点,是治疗不孕症的新手段,也为赠卵以及女性生育力保存提供了新的途径,已成为生殖医学领域日益热门和关注的课题.综述目前IVMI临床应用范围、应用的安全性、IVM的临床妊娠率,并展望其发展前景.【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》【年(卷),期】2011(030)005【总页数】4页(P380-383)【关键词】多囊卵巢综合征;卵母细胞;卵巢;妊娠;治疗【作者】徐玉萍【作者单位】230022,合肥,安徽医科大学第一附属医院生殖医学中心【正文语种】中文近年来，随着辅助生殖技术（ART）的广泛开展，相应并发症的发病率逐渐增高，如卵巢过度刺激综合征（OHSS）及妇科肿瘤等，而同时仍有一部分不孕症患者由于卵巢低反应或卵母细胞成熟障碍等原因不能获得优质的成熟卵子，因而不能妊娠。
一方面是要求不断减少促性腺激素对卵巢的刺激，另一方面是要求获得优质的成熟卵子，这就要求未成熟卵母细胞体外成熟（IVM）技术必须不断提高并得到广泛应用。
而早在1939年，Pincus和Saunders证实人未成熟卵母细胞在体外能自发成熟，1969年Edwards进一步发现人体外成熟卵母细胞能完成体外受精[1]。
1983年人类卵母细胞的首例IVM婴儿成功诞生[2]。
从此IVM作为ART中的一项前沿技术，越来越多地被应用于临床，减少了促性腺激素的使用，帮助了卵母细胞成熟障碍的患者获得妊娠。
对难治性PCOS不孕患者可采用ART，且行体外受精（IVF）治疗时，其获卵数较多，临床妊娠率亦与其他因素不孕者相当，但OHSS发生率较高，减少IVF中卵泡刺激素（FSH）使用量可降低OHSS发生危险，但部分PCOS患者对低剂量FSH无反应或反应很轻，不能达到辅助生育的目的。
传统的IVF-胚胎移植（ET）虽然是治疗PCOS的有效手段之一，但目前临床上尚无有效的手段避免卵巢刺激过程中出现的OHSS。
猪卵母细胞体外成熟技术研究进展
安徽农业科学。ｏｒａ ｏ Ａ ｈｉ ｍ ． ｃ．０６ ３ （１ ：５６ ５８ ５６ Ｊｕｎｌ ｆ ｎｕ Ａ ｉ Ｓｉ ０ ，４ ２ ）５５ —５５ ，５０ ２
责任 编辑
孙红忠
责任校对
孙 红忠
猪 卵母 细 胞体 外成 熟技 术研 究 进展
项智锋， 李艳， 清华 （南 技 院 物 学 院河 新 ４０） 王 河 科 学 动 科 学 ，南 乡 ５０ ３ ３
摘要 猪 卵母 细胞体 外成熟 （ ） ⅣＭ 为猪胚胎 的体 外 生产及 相关胚胎 工程技 术如 胚胎 细胞和 体 细胞核 移植 、 转基 因和性 别控 制提供 了廉 价原料 ， 是现代 胚胎 工程技 术 的研 究热点之 一。 多年 来科研 人 员为 了进 一步提 高卵母 细胞体 外培养 成熟率 以及 更深入 地 了解 卵母 细胞 成 熟机 制 ， 对影响 卵母 细胞体 外成熟的 因素进 行 了大量的研 究。综述 了影 响猪 卵母 细胞体 外成 熟的相关 因素。 关键词 体外成 熟； 卵母 细胞 ； 胚胎 工程 中图分 类号 ￥ １． ８４６ 文 献标识码 Ａ 文章编号 ０１ — ６１２０）１ ５５ — ３ ５７ ６１（０６２ — ５６ ０
５ 卵母细胞 采集方法
卯母细胞的采集方法有抽吸法和切剖法。在从离体卵
巢 上 采集 卵母细 胞 时 ， 因采集 方法 不 同 ， 得 卵母 细胞 体外 所
近几年 的研 究发现 ， 经产母猪 卵母细胞 在成熟 率及胚 胎 发育能力方面 明显 优于 青 年母 猪＿ 。处 于不 同的发 育 阶段 ｌ Ｊ
１ 猪的品种
存温度及贮存 时间影 响卵母 细胞 的体外成 熟。Ｗａｅ 和 ｌｒ ｔ
Ｇａ ｓ ｒ ｅ研究 了不 同保存 温 度 （、６２ 、 ｙ ５１、５３ ０和 ３ ） 不 同贮 ７ｑ 及 ｃ 存时 间（，、 、 ２６ １ １ ２ 对猪 卵母 细胞 体外成熟 的影 响 ， ０ ４和 ６ ） ｈ 发 现不 管 采用 哪种 温度 ， 随着贮存 时间 的延长 ， 细 胞 的成 卵母
实验八、卵母细胞的体外培养
实验八、卵母细胞的体外培养一、实验目的了解卵母细胞体外培养操作要领，掌握卵母细胞体外培养的方法。
二、实验材料1、卵巢、冷冻精液、M199培养液、血清、促性腺激素、雌激素、石蜡油、A23187、1%BSA、Tyrode’s改良液。
2、器械：培养皿、15ml试管、胶塞、注射针头、培养箱、吸管、离心管。
三、实验内容（一）卵母细胞的获得从屠宰场废弃卵巢中抽取卵母细胞已为大多研究者所接受。
真空泵法是一种有效的猪卵母细胞采集方法。
手动抽吸法在卵母细胞的成熟率方面优于真空泵法。
应用乙醚、乌拉糖、846麻醉药（耳静脉注射只）等麻醉后，再按外科手术要求打开腹腔。
将母兔背朝下方固定于兔手术台上。
在兔腹部最后两对乳头的腹中线部剪毛，用沾满肥皂液的纱布清洗局部，再用剃须刀片刮毛，先后用碘酒和酒精棉球由内向外进行消毒。
然后盖上创巾并固定。
用手术刀在腹部正中线处皮肤切开2～3cm长的术口，再在腹壁肌白线上切一小口，用中指垫着以手术剪来扩大剪口。
打开腹腔后，沿着子宫轻轻引出输卵管及卵巢。
与卵巢下脂肪组织处，用长夹夹住以固定卵巢。
仔细观察卵巢的变化。
记录排卵点（卵巢排过卵后的小红点）。
先在卵巢上找到卵泡，用手指固定卵巢，用10ml注射器配上9号针头，吸一些冲卵液（也可用生理盐水代替）,把针头插入卵泡中吸去取卵母细胞。
从卵巢中获得的卵母细胞为什么通常是未成熟：因为卵细胞形成过程中的减数第二次分裂是在精卵结合过程中完成的，所以只有完成受精后卵细胞才是成熟的，当然也已经完成受精了。
人工获取的卵细胞一般都是只完成了减数第一次分裂。
卵母细胞受精过程卵母细胞(oocyte)：在卵子发生过程中进行减数分裂的卵原细胞。
分为初级卵母细胞、次级卵母细胞和成熟的卵母细胞，它们分别是卵原细胞分化和DNA复制分裂后产生、第一次减数分裂和第二次减数分裂的产物。
（二）卵母细胞的体外培养1、培养液的准备用于卵母细胞体外成熟的基础培养液应用最广泛的是M199。
影响人卵母细胞体外成熟因素的研究进展
影响人卵母细胞体外成熟因素的研究进展高佩安;王飞;王庆果【摘要】@@ 卵母细胞体外成熟培养(In Vitro Maturation,IVM)是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养,达到次级卵母细胞(MII),能够正常发育、受精和着床,包括完整的卵泡培养[1]和单纯的卵丘复合体培养.在现代生殖领域中,IVM为降低患者促排卵并发症、降低治疗费用提供了解决途径,利用该技术可为一些高龄、卵巢早衰、卵巢切除和遗传病患者提供生殖机会,同时也有助于深入了解卵巢内不同发育阶段卵泡的发育机制和特点,但目前IVM的成功率还很低.【期刊名称】《泰山医学院学报》【年(卷),期】2009(030)007【总页数】4页(P552-555)【关键词】卵母细胞;体外成熟;影响因素【作者】高佩安;王飞;王庆果【作者单位】泰山医学院;泰山医学院;泰山医学院【正文语种】中文【中图分类】R321.1卵母细胞体外成熟培养(In Vitro Maturation，IVM)是指将GV期或GV前期的卵母细胞在体外培养，达到次级卵母细胞(MII)，能够正常发育、受精和着床，包括完整的卵泡培养[1]和单纯的卵丘复合体培养。
在现代生殖领域中，IVM为降低患者促排卵并发症、降低治疗费用提供了解决途径，利用该技术可为一些高龄、卵巢早衰、卵巢切除和遗传病患者提供生殖机会，同时也有助于深入了解卵巢内不同发育阶段卵泡的发育机制和特点，但目前IVM的成功率还很低，要从根本上提高其成功率，必须对卵母细胞发育的相关影响因素进行研究和探讨。
1 体外因素1.1 促性腺激素促性腺激素(Gn)是参与卵泡发育调节的主要蛋白质激素。
研究显示Gn能通过诱导c-fos、c-myc、c-myb、c-erbB-2等癌基因的表达而调控颗粒细胞的分化和甾体激素分泌[2]。
Gn能通过cAMP途径促进颗粒细胞增生，卵丘细胞膨散。
卵泡刺激素(FSH)对卵母细胞的作用可能是通过刺激卵丘细胞分泌促卵母细胞成熟因子，该因子的产生就有赖于cAMP水平的变化[3] 。
褪黑素在卵母细胞发育中的作用及体外成熟培养中的应用
褪黑素在卵母细胞发育中的作用及体外成熟培养中的应用刘婷婷;章志国【摘要】褪黑素是一种广谱抗氧化剂,不仅可以通过与特异性受体结合产生一系列的生物学效应,而且可以直接穿过生物细胞膜进入细胞内,清除细胞内活性氧簇,降低氧化应激反应.另有研究证实,褪黑素可通过其抗氧化作用促进卵母细胞发育成熟,提高卵母细胞的发育潜力.近年来,褪黑素抗氧化作用逐渐成为研究的重点.然而在体外成熟培养(in vitro maturation,IVM)的培养基中添加褪黑素促进卵母细胞成熟,提高卵母细胞的发育潜力的机制还不清楚.综述褪黑素在卵母细胞发育中的作用及在卵母细胞IVM中的应用.【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》【年(卷),期】2014(033)005【总页数】4页(P375-378)【关键词】细胞,培养的;生殖技术,辅助;活性氧;褪黑素;人未成熟卵母细胞;体外成熟培养【作者】刘婷婷;章志国【作者单位】230022合肥,安徽医科大学第一附属医院生殖中心;230022合肥,安徽医科大学第一附属医院生殖中心【正文语种】中文人未成熟卵母细胞体外成熟培养（in vitro maturation，IVM）是人类辅助生殖技术（assisted reproductive technology，ART）的重要组成部分，常作为多囊卵巢综合征（polycysticovarysyndrome，PCOS）、卵巢早衰以及某些肿瘤患者等的主要助孕手段［1］。
但与常规体外受精（in vitro fertilization，IVF）相比，IVM的妊娠率仍处于较低的水平，限制了IVM技术的常规应用。
迄今为止，世界范围内仍没有广泛认可的IVM治疗方案，其主要原因为人未成熟卵母细胞在IVM 过程中易受到氧化应激的作用，影响了卵母细胞的正常发育［2］。
因此，降低IVM过程中的氧化应激反应是优化IVM技术的突破点之一。
褪黑素（N-乙酰基-5-甲氧基色胺）作为一种广谱抗氧化剂，不仅可以通过与特异性受体结合产生一系列的生物学效应，而且可以直接穿过生物细胞膜进入胞内，清除胞内活性氧簇（reactiveoxygen species，ROS），因此卵泡液中褪黑素的存在可以抑制卵母细胞生长发育过程中的氧化应激反应，促进卵母细胞的发育成熟。
人未成熟卵母细胞体外成熟的影响因素
条有效 的治疗途径 ， 为生殖 医学领 域 Ｅ益关 注的研 究热 成 ｔ
率及成熟率 。而且注射 Ｈ Ｇ可 以诱导 Ｌ Ｃ Ｈ峰 的 出现 ， 准备 了 子宫 内膜 ， 促使子宫 内膜与胚胎 同步 发展 。Ｃ ｉ ｈａ ｎ等 的研究
显示 ， 取卵前应 用 ｈ Ｇ １ ０ Ｕ， 在 Ｃ ００ ０Ｉ 可提 高 Ｐ Ｏ 患 者未成熟 Ｃ Ｓ
获得世界首例胚胎 ， 从此生殖工程又开辟 了一个新 的领域 ， 即 Ｉ Ｍ。１９ Ｖ ９２年 Ｃ ａ …利用 Ｉ Ｍ技 术在世界 上获得 了首例临 ｈ等 Ｖ
床妊娠 。迄今为止 ， 界上有 多家 中心开展 不成 熟卵 的研 究 世
及临床应用 ， 临床妊娠 率 （０ 一３ ％） 不满意 ， 但 ２％ ５ 仍 其影 响 因素很多 ， 如是否使用促性腺激素（ ｎ 、 Ｇ ） 绒毛膜促性腺激素 （ Ｃ ） 子宫 内膜的准备 ， ＨＧ， 培养液及培养 时间等。本文综述 了 影响未成熟 卵母细胞体外成熟的相关因素。
内膜 ＜９ｍ／ 目前 ， ｌ。 ｌ 大多数生殖 中心在 ＩＭ 治疗周 期 中都 会 Ｖ 根据内膜厚度给予适 当的外源性 Ｅ 和孕酮来提 高妊娠率 。
取卵前应用卵泡刺 激素（ Ｓ 和 Ｈ Ｇ的患者与 未应 用 Ｆ Ｈ， Ｆ Ｈ） Ｃ Ｓ 仅用 Ｈ Ｇ的患者 的卵母 细胞 的成 熟率 、 Ｃ 受精率和 妊娠 率均无
人未成熟卵母细胞 体 外成 熟 （ｎｖ ｒ ｔｒｔｎ Ｉ Ｍ） ｉ ｉｏｍａ ａｏ ， ｔ ｕ ｉ Ｖ 技 术 已广泛应用于临床 ， 为多囊卵巢综合 征 （ Ｃ Ｓ 患者开辟 了 ＰＯ ）
一
１２ 取 卵前 Ｈ Ｇ的使 用 取卵前应用 Ｈ Ｇ可以促进卵丘颗 ． Ｃ Ｃ
粒细胞松散 ， 卵子的核成熟 ， 缩短 卵子 的 ＩＭ 时 间 ， 高取卵 Ｖ 提
cAMP调节剂对卵母细胞体外成熟效果的调节机制研究进展
cAMP调节剂对卵母细胞体外成熟效果的调节机制研究进展齐雅天1，房晓欢1，李飒1，李俊杰1,2*（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.河北省牛羊胚胎技术创新中心，河北保定 071000）摘 要：卵母细胞体外成熟是家畜体外胚胎生产关键技术之一。
卵母细胞的环磷酸腺苷（cAMP）水平能够通过调节核质同步成熟进程影响卵母细胞发育能力，因此，cAMP对卵母细胞体外成熟质量的影响受到广泛关注。
本文针对常用的cAMP调节剂及其调节卵母细胞体外成熟的机制进行综述，以期为改善卵母细胞体外成熟效果提供依据。
关键词：卵母细胞；体外成熟；cAMP；进展中图分类号：S814.8 文献标识码：A DOI编号：10.19556/j.0258-7033.20200627-02卵母细胞体外成熟（IVM）是体外胚胎生产的关键技术之一，对于人类辅助生殖技术和优良种畜快速扩繁具有重要意义[1]，其成熟效果直接影响着后续体外受精、体细胞核移植、转基因、胚胎干细胞与胚胎移植等技术的效果，对于胚胎基因组激活和早期胚胎发育至关重要。
卵母细胞成熟包括细胞核与细胞质成熟2个方面[2]，但哺乳动物卵母细胞在常规IVM培养时，易导致细胞核成熟先于细胞质成熟，造成核质成熟不同步，影响卵母细胞成熟质量[3]。
研究发现，卵母细胞体内成熟时高水平的环磷酸腺苷（cAMP）是抑制核成熟的关键调节因子[4]。
因此，常在IVM前增加预成熟阶段升高cAMP，抑制核成熟，使细胞质充分发育，有助于提高卵母细胞发育能力[5]。
Zhang等[6]研究发现，使用cAMP调节剂可维持小鼠卵母细胞内高cAMP水平，从而抑制核成熟，提高卵母细胞核质同步成熟效果。
本文通过对卵母细胞内cAMP的动态变化、常用cAMP调节剂及其调节卵母细胞成熟的机制进行综述，以期为提高卵母细胞体外成熟效果提供依据。
1卵母细胞成熟过程中cAMP变化及对卵母细胞体外成熟的影响哺乳动物卵母细胞来源于胚胎期出现的卵原细胞，卵原细胞经多次有丝分裂发育为初级卵母细胞，后经2次减数分裂得到成熟的卵母细胞。
哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展
中国畜牧兽医 2024,51(3):1171-1182C h i n aA n i m a lH u s b a n dr y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展李有为1,程亚倬2,商继勇2,张廷龙1,孙铭菊2(1.青岛农业大学海都学院,莱阳265200;2.青岛农业大学动物医学院,青岛266109)摘 要:体外成熟是哺乳动物胚胎工程获得成熟卵母细胞的主要途径,卵母细胞质量直接影响早期胚胎发育,妊娠的建立及维持,胎儿的发育等㊂哺乳动物卵巢表面数量众多的小卵泡可以作为胚胎工程卵母细胞的来源,但从哺乳动物卵巢获取的卵母细胞成熟差异较大,存在处于发育各个时期的卵母细胞,小卵泡卵母细胞体外成熟质量差,发育能力不足㊂如何提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力以充分挖掘优良母畜的遗传资源,提高胚胎工程效率成为研究热点㊂基于此,文章概述哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展,比较大㊁小卵泡卵母细胞物质积累差异㊁卵泡的卵泡液成分及含量差异以及卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异,分析哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,分析总结提高哺乳动物小卵泡体外成熟卵母细胞发育能力的措施,包括抑制核成熟㊁成熟前培养㊁颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养,期望能够为小卵泡卵母细胞发育调控机制的研究及发育能力的提高提供理论指导㊂关键词:哺乳动物;小卵泡;卵母细胞;体外成熟中图分类号:S 814.6文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.03.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-12基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2020Q C 193);重庆市妇幼保健院开放课题(2020K F K T 005);青岛农业大学高层次人才科研基金(663/1120012)联系方式:李有为,E -m a i l :l i yo u w e i 008@163.c o m ㊂通信作者孙铭菊,E -m a i l :s u n 8911@163.c o m R e s e a r c hP r o gr e s s o n i n v i t r o M a t u r a t i o no f S m a l l F o l l i c l e -d e r i v e dO o c yt e s i n M a m m a l i a n L IY o u w e i 1,C H E N G Y a z h u o2,S H A N GJ i y o n g 2,Z H A N G T i n g l o n g 1,S U N M i n g ju 2(1.H a i d uC o l l e g e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,L a i y a n g 265200,C h i n a ;2.C o l l e g e o fV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Q i n g d a o 266109,C h i n a )A b s t r a c t :I nv i t r o m a t u r a t i o ni st h e m a i n w a y f o r m a m m a l i a ne m b r y oe n g i n e e r i n g too b t a i n m a t u r e o o c y t e s .T h e q u a l i t y o f o o c y t e s d i r e c t l y a f f e c t s e a r l y e m b r y o n i c d e v e l o pm e n t ,e s t a b l i s h m e n t a n dm a i n t e n a n c eo f p r e g n a n c y ,a n df e t a ld e v e l o p m e n t .T h e l a r gen u m b e ro f s m a l l f o l l i c l e so n t h e s u r f a c e o f m a m m a l i a n o v a r i e s c a n p r o v i d e o o c y t e s t h a t a p p l y t o e m b r y o e n g i n e e r i n g ,b u t t h eo o c y t e so b t a i nf r o mt h eo v a r y a r ea td i f f e r e n ts t a g e st h a ts h o w sd i f f e r e n t m a t u r e c a p a c i t y ,a n d t h e q u a l i t y o f i n v i t r o m a t u r a t i o n o f o o c yt e s f r o ms m a l l f o l l i c l e s a r e p o o r a n d d e f i c i e n t i nd e v e l o p m e n t a l a b i l i t y .H o wt o i m p r o v e t h e i n v i t r o m a t u r a t i o n a b i l i t y o f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s t of u l l y t a p i n t ot h e g e n e t i cr e s o u r c e so fe x c e l l e n tf e m a l ea n i m a l sa n di m pr o v et h e e f f i c i e n c y o fe m b r y o e n g i n e e r i n g h a s b e c o m e ar e s e a r c h h o t s p o t .B a s e d o n t h i s ,t h er e v i e w s u m m a r i z e s t h e r e s e a r c h p r o g r e s so f i n v i t r o m a t u r a t i o no f s m a l l f o l l i c l eo o c yt e s i n m a m m a l i a n ,c o m p a r e s t h e d i f f e r e n c e s i n a c c u m u l a t i o n o f o o c y t em a t e r i a l ,t h e d i f f e r e n c e s i n t h e c o m po s i t i o n a n d c o n t e n t o f f o l l i c u l a r f l u i d ,a n d t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n f o l l i c u l a r g r a n u l o s a c e l l s a n d c u m u l u s c e l l si n l a r g e a n d s m a l l f o l l i c l e s ,a n a l y z e s t h e r e a s o n s f o r t h e p o o r q u a l i t y ofm a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l e中国畜牧兽医51卷o o c y t e s i n v i t r o m a t u r a t i o n,a n a l y z e s a n d s u m m a r i z e s t h em e a s u r e s t o i m p r o v e t h ed e v e l o p m e n t a l a b i l i t y o f m a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l eo o c y t e s i nv i t r o m a t u r a t i o n,i n c l u d i n g i n h i b i t i o no fn u c l e a r m a t u r a t i o n,p r e-m a t u r a t i o n c u l t u r e o f o o c y t e a n d c o-c u l t u r e o f o o c y t e s w i t h g r a n u l o s a a n d c u m u l u s c e l l s,w h i c ha i m e s a t p r o v i d i n g t h e o r e t i c a l g u i d a n c e f o r t h e r e s e a r c ho f t h ed e v e l o p m e n t r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s a n d t h e i m p r o v e m e n t o f d e v e l o p m e n t a l c a p a c i t y. K e y w o r d s:m a m m a l s;s m a l l f o l l i c l e s;o o c y t e s;i n v i t r o m a t u r a t i o n家畜卵母细胞随着卵泡长大而生长成熟,获得发育能力,卵母细胞良好的生长成熟是决定雌性生产及繁殖能力的重要指征㊂卵母细胞体外成熟培养(I VM)是利用体外培养体系模拟体内卵母细胞成熟环境,将未成熟的卵母细胞培养至第二次减数分裂中期(MⅡ)的过程㊂卵母细胞体外成熟是研究哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎发育的基础,是辅助生殖的关键,是保护和扩繁优良家畜的重要前提㊂进行体外成熟培养的卵母细胞取自卵巢表面卵泡,但卵巢表面大腔卵泡数量非常有限,不能满足科研和临床需求,数量众多的小卵泡作为卵母细胞来源受到更多学者关注㊂但小卵泡卵母细胞的体外成熟质量差,发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[1-3]㊂研究者们试图探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因及提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,但这些问题仍未被完全阐明,也未见系统的论述㊂因此,作者系统论述哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义,从卵母细胞生长的卵泡微环境方面分析小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力差的原因,概述提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,为改善哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟培养系统提供新思路,继而提升优良家畜繁殖利用效率,促进胚胎工程技术的发展和应用㊂1哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力显著低于大卵泡卵母细胞㊂研究表明,直径2.5~4.0m m的猪卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于4.5~6.0m m卵泡卵母细胞[1];山羊卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>3m m卵泡卵母细胞[2],且只有来自直径1.5m m以上山羊卵泡的卵母细胞才具有完成减数分裂的能力[4];在牛的研究中发现卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>8m m卵泡卵母细胞[3,5]㊂人小卵泡(直径<10m m)卵母细胞体外成熟和发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[6]㊂因此,哺乳动物胚胎工程利用的卵母细胞大都取自大卵泡进行体外成熟培养,如在猪上选取卵巢表面卵泡直径3~6m m的卵母细胞[7]㊂哺乳动物卵泡的生长经历原始卵泡㊁初级卵泡㊁次级卵泡㊁三级卵泡和成熟卵泡阶段,随着卵泡生长,卵母细胞生长成熟㊂胎儿期哺乳动物卵巢中存在数百万卵泡,但仅有少数卵泡能够发育成熟并排出成熟卵母细胞,其余大部分小卵泡在不同生长时期发生闭锁或退化㊂胚胎工程技术的研究和推广应用需要大量廉价和高质量的卵母细胞,卵巢表面大卵泡数量有限,因此需要高效利用数量众多的小卵泡㊂探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力和利用率,能够充分挖掘优良母畜的繁殖潜能,为动物繁育技术的发展提供理论指导,促进畜牧业健康㊁稳定㊁持续发展;改良卵母细胞体外成熟培养体系,为相关科学研究提供大量廉价的试验材料,促进胚胎工程技术的发展;同时在指导人类辅助生殖小卵泡的利用,减少激素刺激的副作用,提高辅助生殖成功率方面有重要意义㊂2小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因哺乳动物卵母细胞生长成熟依赖卵泡形成的微环境,卵泡外包卵泡膜,生长至有腔卵泡阶段,卵泡内形成卵泡腔,卵泡腔内含卵泡液,卵母细胞外包卵丘细胞位于卵泡腔中,卵丘细胞连接卵泡腔周围的颗粒细胞,卵泡内的卵泡液㊁卵丘细胞和颗粒细胞维持卵母细胞的生长成熟㊂因此,下文从卵母细胞自身生长程度㊁卵泡液成分和含量㊁卵丘及颗粒细胞功能三方面比较大小卵泡的差异,探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因㊂2.1大、小卵泡的卵母细胞物质积累差异卵母细胞随着卵泡长大而生长,染色质逐渐凝集,转录活性逐渐减低,完成胞质物质的积累以获得成熟和发育能力,小鼠染色质凝集型卵母细胞无转录活性[8],直径>3m m猪卵泡中的卵母细胞转录27113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展逐渐沉默[9-10]㊂转录逐渐沉默过程中,卵母细胞完成转录物的积累,支持后期的成熟和胚胎发育,这是大㊁小卵泡卵母细胞体外发育能力差异的重要因素㊂高通量测序技术为卵母细胞生长成熟机制的研究提供技术支持,利用转录组测序分析不同大小卵泡的牛卵母细胞,发现在卵泡发生过程中重要差异表达基因,如调节转录的转录因子2(T A F2)㊁染色质重塑相关的蛋白磷酸酶1的催化亚基-β同工酶(P P P1C B)㊁能量代谢相关的溶质载体家族25-腺嘌呤核苷酸转运子成员31(S L C25A31),细胞内分子运输相关的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸二酯酶(N A G P A)㊁半胱氨酸/组氨酸富含1(C Y H R1)和溶质载体家族39-锌转运子成员12(S L C3A12)[3]㊂来自人类原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞在参与调节卵母细胞休眠和激活途径的基因表达上存在差异[11]㊂在小鼠中,染色质凝集的卵母细胞与弥散性染色质构型卵母细胞相比有380个差异表达基因,且大多数基因下调[12]㊂猪卵母细胞转录组数据分析差异表达基因显示,与小卵泡组相比,大卵泡卵母细胞中有60个基因上调,262个基因下调[13]㊂因此,大小卵泡卵母细胞基因表达的差异与卵母细胞成熟和发育能力的获得密切相关,但具体关系及起决定性作用的因子仍需要进一步探究㊂卵母细胞内成熟及发育相关因子的研究尚不充分,仅局限于特定因子的比较和分析㊂卵母细胞成熟促进因子(M P F)介导多种信号调控卵母细胞成熟㊂在猪小卵泡中M P F活性以及参与卵母细胞成熟的细胞周期依赖性激酶1(C D K1)㊁增殖细胞核抗原(P C N A)㊁细胞外信号调节激酶2(E R K2)的表达量显著低于大卵泡卵母细胞[14]㊂卵母细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(c-MO S)参与维持减数分裂阻滞并具有调节M P F活性的作用[15-16],猪小卵泡生发泡(G V)期卵母细胞中c-M O S基因转录水平低[17]㊂猪小卵泡卵母细胞中调控卵丘扩展的基因(如骨形态发生蛋白(B M P15)㊁生长分化因子9 (G D F9)㊁透明质酸合成酶2(H A S2)㊁肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(T N F I P6)等)表达量低,使卵丘扩展能力不足,同时引起表皮生长因子受体(E G F R)信号通路下调,卵母细胞发育能力低[18]㊂环磷酸腺苷(c AM P)是哺乳动物中保守且普遍存在的第二信使,在卵泡发育及卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,卵母细胞减数分裂的阻滞和恢复依赖于c AM P㊂小卵泡卵母细胞c AM P含量低于大卵泡卵母细胞[19],小卵泡卵母细胞对c AM P的感应不如大卵泡,在体外成熟培养过程中添加c AM P 的类似物d i b u t y r y l c AM P(d b-c AM P),培养11h 时大卵泡c AM P含量是小卵泡卵母细胞的3倍[20]㊂卵母细胞旁分泌因子G D F9和B M P15具有调控卵泡生长[21],促进卵丘细胞和颗粒细胞的生长㊁分化,阻止卵丘细胞凋亡,促进卵母细胞成熟㊁排卵㊁受精和胚胎发育的作用[22-23]㊂G D F9和B M P15的表达模式在不同物种之间存在差异,绵羊㊁牛㊁负鼠和仓鼠在原始卵泡卵母细胞中开始表达,而大鼠㊁小鼠和人类在初级卵泡开始表达,发育至次级卵泡开始激增[24-25]㊂猪小卵泡卵母细胞中G D F9水平低于大卵泡卵母细胞,在经过体外成熟培养后大卵泡卵母细胞G D F9表达量仍显著高于小卵泡卵母细胞[26]㊂G D F9基因敲除后,卵泡生长阻滞在初级卵泡阶段,小鼠雌性不育[27],B MP15基因敲除(B MP15-/-)的小鼠生殖能力降低,排卵减少, G D F9+/-和B MP15-/-的小鼠卵泡发生㊁卵丘细胞和受精能力均出现异常[28-29]㊂另外,细胞内谷胱甘肽(G S H)是预测猪卵母细胞细胞质成熟的分子标志物,猪大卵泡卵母细胞内G S H含量显著高于小卵泡卵母细胞[30]㊂卵母细胞内脂滴等代谢物含量㊁表观遗传修饰的差异等都是导致大㊁小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力差异的可能原因,需要更为系统的研究和阐述㊂以上研究揭示了大㊁小卵泡卵母细胞转录物㊁活性因子及调控成熟信号等的差异,表明卵母细胞内物质积累对卵泡卵母细胞生长㊁卵母细胞成熟及发育能力的获得㊁生殖的重要性,小卵泡卵母细胞物质积累不足是导致发育能力低的重要原因㊂2.2大、小卵泡的卵泡液成分及含量差异卵泡液是血清的超滤液,是穿过血滤泡屏障的血浆成分转移以及颗粒和卵母细胞分泌活动的产物,卵泡液成分包括激素㊁生长因子㊁活性氧㊁蛋白质㊁肽和氨基酸等㊂卵泡液中含有多种激素,在卵泡及卵母细胞的生长发育过程中起着关键调控作用,大㊁小卵泡内激素含量不同,卵泡对激素水平的感应不同是导致卵母细胞发育能力不同的重要因素之一㊂研究比较不同物种发现小卵泡内促卵泡激素(F S H)含量高[8,19,31],同时小卵泡颗粒细胞高表达促卵泡激素受体(F S H R),促进小卵泡进一步生长[32]㊂F S H能够激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/叉头转录因子O亚族1(P I3K/A k t/F O X O1)信号通路,引起固醇元件结合转录因子2(S R E B P2)上调,促进3-羟3711中国畜牧兽医51卷基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG C R)表达调控卵泡内颗粒细胞合成胆固醇[33-35],F S H还具有增强表皮生长因子(E G F)诱导E G F R酪氨酸磷酸化的作用[36],F S H-E G F R能激活S MA D2/3信号通路,调控卵丘扩展和类固醇生成[37]㊂因此,F S H 在小卵泡中含量高,可促进小卵泡的进一步生长,在大卵泡内F S H主要是促进卵母细胞核成熟㊂抗缪勒氏激素(AMH)的表达仅局限于腔前和小腔卵泡颗粒细胞,通常在小腔前卵泡中出现表达高峰,伴随着腔前卵泡直径的增加,颗粒细胞和卵泡液中AMH水平降低,优势卵泡不再产生AMH[38-39]㊂AMH在调控卵母细胞发育中的作用是增加腔前卵泡中雄烯二酮的含量,抑制颗粒细胞增殖[40-41],另外通过抑制F S H诱导的芳香酶活性共同抑制雌二醇(E2)合成[42],表明AMH对优势卵泡的选择是必需的㊂大卵泡孕酮(P4)和E2含量均高于小卵泡,促黄体生成素受体(L H R)和雌激素,及类固醇合成酶,主要是细胞色素P450酶(芳香化酶和17α羟化酶)表达量高,其作用是为激素应答做准备[30,43]㊂E2可与卵母细胞分泌因子共同作用,通过调控钠肽通路促进卵丘细胞环磷酸鸟苷(c GM P)产生[44-45],高水平c GM P维持减数分裂的阻滞,促进卵母细胞胞质充分成熟㊂卵泡液中重要成分还包括卵母细胞及颗粒细胞分泌的重要生物活性因子,B i j t t e b i e r等[46]利用蛋白组学鉴定猪卵泡液和血清中与卵丘细胞扩展相关的蛋白因子,但因技术的限制仅鉴定了13种差异表达蛋白,精确度也较低㊂因此,仍需利用转录组及蛋白组学等技术系统研究猪卵泡液关键因子及相互作用,揭示卵泡因子之间的互作以及揭示卵母细胞成熟分子调控机制㊂2.3大、小卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异卵泡生长过程的重要变化包括颗粒细胞数量的增加以及颗粒细胞和卵丘细胞的分化,猪小腔卵母细胞周围的卵丘细胞数量显著低于中等卵泡卵母细胞[47],小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量不足,发挥功能受限,必定会影响卵母细胞发育能力㊂卵丘细胞分泌因子包括过氧化氢酶㊁超氧化物歧化酶㊁血管内皮生长因子㊁G S H㊁特异性转录因子和环核苷酸(c AM P㊁c GM P)等,分泌因子在维持氧化稳态,抑制凋亡,调控细胞增殖和凋亡,以及卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用,能够促进卵母细胞成熟发育[48]㊂常见的颗粒细胞分泌因子包括利钠肽(N P s)㊁类表皮生长因子(E G F-l i k ef a c t o r s)㊁前列腺素(P G E)等[49]㊂其中利钠肽家族成员C-型利钠肽(C N P)由卵泡壁粒细胞分泌,结合卵丘细胞表面的利钠肽受体2(N P R2)[50],诱导c GM P的表达,具有维持卵母细胞减数分裂阻滞的作用[51],利钠肽受体系统对卵巢生长和卵母细胞减数分裂的有序发生起重要作用,决定雌性生殖能力[52-53]㊂直径1~2m m 猪卵泡卵丘细胞内N p r2m R N A水平显著低于直径3~6m m卵泡卵丘细胞[19]㊂促黄体生成素(L H)和F S H作用的重要通路是通过转活化E G F信号通路在调控卵丘细胞增殖分化中发挥作用㊂已经在啮齿类动物[54-56]㊁人[57]㊁灵长类[58]㊁牛[59]和猪[60]颗粒细胞中证实类表皮生长因子的表达,如双调蛋白(A R E G)㊁上皮调节蛋白(E R E G)和β-细胞素(B T C)㊂这些类E G F生长因子以自分泌或旁分泌形式通过E G F R作用于壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞[55-56,60-61],在卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用㊂E G F及类表皮生长因子能够提高体外成熟卵母细胞成熟率㊁受精和早期胚胎发育能力[8,62]㊂直径<3m m的山羊卵泡卵丘卵母细胞复合体(C O C s)中E G Fm R N A水平低于直径>3m m的卵泡[63],而缺少E G F类生长因子C O C s不会发生扩展[64-65],猪小腔卵泡卵母细胞对E G F类生长因子的反应能力及结合能力低[18,65]㊂P G E2水平的升高是调控卵丘扩展和卵母细胞成熟及排卵的关键㊂抑制P G E2的合成,卵丘细胞扩展㊁卵母细胞成熟和排卵率降低,缺少P G E2或P G E2受体表达的小鼠不能排卵[66-68]㊂利用前列腺素合成抑制剂也能阻断兔㊁奶牛和灵长类动物的排卵,将前列腺素合成抑制剂直接注射到猕猴的优势卵泡中,卵泡则不能应答L H的刺激进而不能排卵,注射抑制剂的同时注射P G E2会恢复排卵[69]㊂综上,大㊁小卵泡卵母细胞㊁卵泡液㊁颗粒与卵丘细胞存在显著差异(图1):①小卵泡内卵母细胞转录活性强;基因表达与大卵泡卵母细胞有差异;c AM P含量低;c-MO S㊁M P F活性低;旁分泌因子G D F9/B M P15少;G S H含量少;②小卵泡卵泡腔内卵泡液含量及成分与大卵泡卵泡液差异显著;F S H㊁AMH含量高;P4㊁E2含量低;③小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量少;N P㊁PG E2㊁E G F家族生长因子少;N P R2表达少㊂此外,大㊁小卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞㊁卵泡液以及卵母细胞之间的信息交流,促进支持卵泡和卵母细胞的生长成熟,它们之间47113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展的相互联系及结合程度不同都可能造成卵母细胞发育能力差异㊂卵泡和卵母细胞生长成熟极其复杂,人们对其认识极其有限,卵泡内生命活动及其调控机制仍需要进一步阐明㊂与大卵泡相比,ʏ表示小卵泡内物质含量多;ˌ表示小卵泡内相应物质含量少C o m p a r e dw i t hl a r g ef o l l i c l e s ,ʏi n d i c a t e da h i gh e rc o n t e n to fs u b s t a n c e si ns m a l lf o l l i c l e s ;ˌi n d i c a t e dl o w c o n t e n to f c o r r e s p o n d i n g s u b s t a n c e s i n s m a l l f o l l i c l e s 图1 哺乳动物大、小卵泡内物质差异F i g .1 D i f f e r e n c e s i n s u b s t a n c e s b e t w e e n l a r ge a n d s m a l lf o l l i c l e s i nm a m m a l s 3 提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力的措施在体内卵泡环境,卵母细胞长时间停滞在第一次减数分裂前期,一旦置于体外成熟培养环境,卵母细胞很快自发恢复减数分裂,完成核成熟㊂哺乳动物卵泡长至大腔卵泡时期卵母细胞才生长完全,胞质完全成熟,体外成熟培养导致小卵泡卵母细胞在胞质未成熟之前提前恢复减数分裂,使得卵母细胞发育能力低㊂基于上述小腔卵泡卵母细胞发育能力不足的原因分析,体外成熟培养过程中,提高小腔卵泡卵母细胞发育能力的举措主要是在支持生长的培养基中进行前培养或者抑制卵母细胞的核成熟,保证卵母细胞足够的胞质成熟时间,以及卵母细胞与卵丘细胞或颗粒细胞共培养,弥补小腔卵泡卵母细胞生长的不足,以提高小卵泡卵母细胞质量㊂3.1 抑制核成熟提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力很多研究在卵母细胞体外成熟培养的早期阶段利用抑制剂抑制生发泡破裂(G V B D )的发生,以提高猪卵母细胞胞质的成熟,但对卵母细胞发育能力的提高非常有限㊂抑制核成熟研究最多的是卵母细胞内c AM P -蛋白激酶A (P K A )-M P F 通路的调控,在猪和小鼠卵母细胞成熟过程中使用d b -c AM P ㊁利用抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(I B M X )㊁西洛酰胺抑制磷酸二酯酶(P D E )进而抑制c AM P 的降解,添加毛喉素(F S K )激活腺苷酸活化酶,这些都能够维持卵母细胞内高水平的c AM P ,抑制细胞核过早发生成熟,提高猪小卵泡(1~2m m )卵母细胞发育能力[70-71]㊂添加C D K 抑制剂r o s c o v i t i n e 抑制M P F 的活化,能显著提高猪[72]㊁山羊[73]㊁水牛[74]小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力㊂相似的,添加b u t yr o l a c t o n eⅠ抑制C D K 1也能够提高牛卵母细胞成熟[75]㊂颗粒细胞产生的C N P 被用作天然的卵母细胞核成熟抑制剂㊂在小鼠㊁山羊㊁猪和牛的研究中证实5711中国畜牧兽医51卷C N P能够抑制卵母细胞减数分裂的恢复,体外成熟培养过程添加C N P可提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力[76-78]㊂添加C N P能够维持卵丘细胞间的通讯;诱导卵母细胞染色质结构的改变;增加卵母细胞直径㊁线粒体D N A拷贝数㊁线粒体活性和活性氧水平;降低G S H水平;增加卵丘细胞功能[44,79]㊂另外,在体外延迟减数分裂自发恢复的安全有效方法是培养体系中加入卵泡液或添加卵泡液因子,利用卵泡液成分抑制核成熟,同时支持卵母细胞胞质成熟和核成熟,猪的体外成熟培养体系大都添加卵泡液㊂添加卵泡液因子也是提高卵母细胞体外成熟质量的重要方法,体外培养直径2~4m m猪卵泡卵母细胞添加c AM P㊁B M P15和G D F9的同时添加A R E G可提高卵母细胞体外成熟发育能力[18], B M P15㊁G D F9及E G F㊁胶质细胞衍生神经营养因子(G D N F)的组合均能提高卵母细胞发育能力[64,80-81]㊂除此,在培养恒河猴小卵泡(直径0.5㊁0.5~2.0m m)卵母细胞过程中发现添加人绒毛膜促性腺激素(h C G)[82]㊁A R E G[83]能够提高核成熟㊂3.2成熟前培养提高小卵泡卵母细胞发育能力成熟前培养是利用支持生长的培养基促进卵母细胞进一步生长,包括卵泡的培养和卵母细胞的前培养㊂卵泡培养能够实现早期初级卵泡甚至原始卵泡的生长,进一步完成体外卵母细胞的成熟培养,但成熟率不能达到要求㊁培养体系复杂㊁时间长㊁成本较高,并不适合于服务胚胎工程生产,在这里不做赘述㊂卵母细胞的成熟前培养常用的方法是低浓度的激素,如猪小卵泡卵母细胞在体外成熟的1/250浓度的F S H和L H的生长培养基中培养24h,随后在成熟培养基中培养20h可提高猪卵母细胞发育能力[84]㊂与抑制核成熟相似的是成熟前培养也是给予胞质充分的时间以促进其成熟,所以在前培养过程中一般在调控激素水平的基础上结合使用抑制核成熟因子㊂如在培养的前10h添加F S H㊁E2和I B M X,后10h添加P4㊁F S H㊁E2和I B M X,在随后的22h 培养过程中更换为L H㊁E G F和P4可提高猪小卵泡(3~5m m)卵母细胞发育能力[60]㊂前培养过程添加垂体腺苷酸环化酶激活多肽(P A C A P)刺激细胞产生c AM P,能够提高1~3m m猪卵泡卵母细胞发育能力[85]㊂绵羊小卵泡(2~4m m)卵母细胞添加C N P的培养基进行6h前培养,在添加A R E G和P G E2的培养基培养18h,能够提高卵裂率和囊胚率[49]㊂在临床上,将多囊卵巢综合征患者小卵泡(直径<6m m)添加C N P进行前培养,然后再利用体外成熟培养系统能够显著提高小卵泡卵母细胞成熟率和发育能力[77,86-87],同时避免了激素对患者的副作用㊂在此培养系统基础上添加A R E G则能够进一步提高多囊卵巢综合征患者小卵泡卵母细胞发育能力[88]㊂3.3颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养提高小卵泡卵母细胞发育能力为弥补小卵泡内颗粒及卵丘细胞数量及所分泌因子不足导致的卵母细胞发育能力降低㊂研究者通过共培养及添加相应分泌因子的方式或者改善培养方式来提高卵母细胞体外成熟的发育能力㊂用3~6m m卵泡卵母细胞颗粒细胞团与1~ 2m m卵泡卵母细胞共培养,能够提高猪小卵泡卵母细胞直径,同时促进卵母细胞的成熟[47]㊂在绵羊中研究发现,如果将来自小卵泡(0.5~1.0m m)的卵母细胞与直径3.0~4.0m m卵泡卵母细胞卵丘细胞共培养,则近48%的小卵泡卵母细胞能够恢复减数分裂并能够发育到MⅡ阶段[89]㊂山羊小卵泡(直径<3m m)卵母细胞与裸卵共培养也能够提高卵裂率和囊胚率[90]㊂这些研究表明,卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞以及卵母细胞自身对卵母细胞成熟和发育能力的获得都是有利的,同时,在共培养的基础上再添加其他因子也能提高卵母细胞体外成熟和发育能力㊂除上述措施外,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力的措施还有很多,包括添加抗氧化㊁抗凋亡㊁增强线粒体功能㊁增强表观遗传修饰㊁促进卵丘扩展㊁自噬等作用的物质㊂褪黑素[91]㊁辅酶Q10[92]㊁血管内皮生长因子[93]能够提高卵母细胞体外成熟的发育能力,特别是质量差的小卵泡卵母细胞㊂亚麻酸能够提高山羊小卵泡(<2m m)卵母细胞减数分裂能力和发育至囊胚的能力[94]㊂培养猪小卵泡(1~3m m)卵母细胞时添加烟酸或烟酰胺,可改善卵母细胞体外成熟和发育能力[95]㊂促进胞质成熟,弥补小卵泡的不足能够部分提高小卵泡卵母细胞发育能力,但并不能达到大卵泡卵母细胞发育成熟的程度,还有很大的提升空间㊂4总结与展望卵母细胞生长成熟是一个异常复杂的生物过程,需要卵母细胞与邻近的颗粒细胞㊁卵丘细胞及卵6711。
卵母细胞体外成熟技术的临床应用进展
卵母细胞体外成熟技术的临床应用进展李涵;杨志勇【摘要】In vitro maturation (IVM) refers to the maturation of immature oocytes at different stages.Immature oocytes obtained in different origins have different subsequent embryonic development capacity and pregnancy rates as well health live births rates.IVM as an efficient treatment has been used in those patients with polycystic ovary syndrome,ovary high response or low response,and fertility preservation.Several thousands of healthy IVM babies have been born in the world.The improvement of clinical IVM technology focuses on IVM medium,the optimization of the culture environment and operation process.With the improvement of IVF efficiency and IVM culture system,the new treatment option was proposed that the combination of natural cycle/ mild stimulation IVF treatment with immature oocyte retrieval and the followed IVM.This IVF combined with IVM may represent a viable alternative to the present standard treatment,or as a potential first-line treatment in future.%卵母细胞体外成熟(in vitro maturation,IVM)是将处于不同时期的未成熟卵母细胞体外培养成熟的技术,临床不同来源的未成熟卵母细胞在胚胎发育潜能、妊娠率和活产率等方面存在差异.IVM作为一种有效治疗手段可应用于治疗多囊卵巢综合征、卵巢高反应及低反应患者、癌症患者生育力保存等,该技术已在全世界应用并有数千名健康婴儿出生.临床IVM技术的改进主要包括IVM培养基的改良、培养环境及操作流程的优化.目前,随着体外受精(IVF)效率的提高和培养体系的改进,自然周期或温和刺激可能更适合于进行IVF治疗的女性.新的治疗方案提出将自然周期/温和刺激IVF与IVM结合,温和刺激IVF联合IVM治疗方案不仅有望成为目前标准治疗的可行替代方案,而且可能是潜在的一线治疗选择.【期刊名称】《国际生殖健康/计划生育杂志》【年(卷),期】2017(036)005【总页数】5页(P412-416)【关键词】卵母细胞;细胞培养技术;生殖技术,辅助;受精,体外【作者】李涵;杨志勇【作者单位】200032上海,同济大学附属第十人民医院生殖医学中心;200032上海,同济大学附属第十人民医院生殖医学中心【正文语种】中文20世纪60年代人类卵母细胞体外成熟技术（in vitro maturation，IVM）取得里程碑式进展，人卵母细胞体外受精（in vitro fertilization，IVF）也由IVM卵母细胞建立。
哺乳动物卵母细胞体外培养研究进展(发育生物学论文)
哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展生科1202班张文娅201224140212摘要：卵母细胞体外成熟培养已经成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是性别控制、体外受精、核移植和转基因等技术成功前提和关键[1]。
关键字：哺乳动物；卵母细胞哺乳动物卵巢内含有大量的原始卵泡，其数量因物种和发育阶段而不同，如出生小鼠大约为一万个，人和家畜约为几百万个。
到初情期后，小鼠约四千个，牛羊约十万个，猪约四十多万个，但大部分卵泡中途闭锁退化，在一个生殖周期中发生排卵的卵泡只有一个或几个[2]。
所以说，哺乳动物卵巢的开发潜力很大。
1 卵母细胞的获取卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）是指从卵巢中获取未成熟卵，经过适宜的体外培养条件，卵母细胞发育成熟并具有受精和胚胎发育能力。
哺乳动物卵母细胞体外成熟质量对卵母细胞的激活、受精及其后继的胚胎发育均有重要影响[3]。
获取大量的优质卵母细胞是实现卵母细胞体外成熟培养的先决条件，也是胚胎生物技术研究的基础。
1.1 活体采集活体卵母细胞的采集主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。
20世纪80年代初，Sirard首次将内窥镜用于牛卵泡卵母细胞的采集，同年Copata也以同样的方法获得成功；荷兰Pieterse等首次利用超声波技术通过子宫壁从活牛卵巢采集到卵母细胞。
盲采法由熟悉操作的人一只手通过操控采卵器进行阴道弯隆穿刺，另一只手直肠内配合引导采卵器并把握卵巢吸取含有卵子的卵泡液进行取卵[4]。
盲采法回收率达65%以上。
内窥镜法是在腹腔镜探头的观察下，通过操作杆和采卵针收集卵母细胞的方法。
内窥镜法对卵母细胞的回收率达40%-80%，超声波法回收率达60%。
盲采法是使用最多的一种方法。
活体采集对操作人员的技术要求比较高。
1.2 离体采集离体采集卵母细胞最大的优势在于取材方便，相比活体采卵技术，显著降低了卵母细胞的获取成本和对操作人员的技术要求，能够满足实验对大批量卵母细胞的需求。