第三代测序技术

第三代测序
◦ 另一类非Sanger 原理的DNA 测序技 术在 2008 年成为现实，这类基于单 个分子信号检测的 DNA 测序被称为 单分子测序 (single molecule sequencing, SMS) ，或第三代测序 (third generation sequencing, TGS) 。 据预测， SMS 将比 NGS 具有更快的 速度和更低的成本，从而使研究人 员能够实现目前无法进行的研究工 作。尽管从现在的进展来看， SMS 还未能完全实现预期目标，但已经 做出了许多重要的努力。这些新技 术包括 Helicos 的 tSMS ， PacBio 的 SMRT， Oxford 的 Nanopore 以及其 它一些尚处于实验室阶段的技术， 如电镜测序，蛋白质晶体管测序等 等。
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突变鉴定（SNP检测）

单分子测序的分辨率具有不可比拟的优势，而且 没有PCR扩增步骤，就没有扩增引入的碱基错误， 该优势使其在特定序列的SNP检测，稀有突变及 其频率测定中大显身手。例如在医学研究中，对 于FLT3基因是否是急性髓细胞白血病（AML）的 有效治疗靶标一直存在质疑。研究人员用单分子 测序分析耐药性患者基因，意外发现耐药性与 FLT3基因下游出现的稀有新突变有关，重新证明 了FLT3基因是这种最常见白血病—急性髓细胞白 血病（AML）的有效治疗靶标，打破了一直以来 对于这一基因靶标的疑惑。凭借PacBio平均 3000bp的读长，获得了更多基因下游的宝贵信息， 而基于单核酸分子的测序能够检测到低频率（低 至1%）罕见突变，正是这项成果的关键所在
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SMRT技术测序流程
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纳米孔单分子技术
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三 第三代测序技术特点




1、它实现了DNA聚合酶内在自身的反应速度，一秒可以 测10个碱基，测序速度是化学法测序的2万倍。 2、它实现了DNA聚合酶内在自身的延续性，一个反应就 可以测非常长的序列。二代测序现在可以测到上百个碱 基，但是三代测序现在就可以测几千个碱基。 3、它的精度非常高，达到99.9999%。 4、直接测RNA的序列。既然DNA聚合酶能够实时观测， 那么以RNA为模板复制DNA的逆转录酶也同样可以。 RNA的直接测序，将大大降低体外逆转录产生的系统误 差。 5、第二个是直接测甲基化的DNA序列。实际上DNA聚 合酶复制A、T、C、G的速度是不一样的。正常的C或者 甲基化的C为模板，DNA聚合酶停顿的时间不同。根据 这个不同的时间，可以判断模板的C是否甲基化。
自从2006年第一台454 GS FLX 测序平台上市以来，基于非 Sanger测序原理的第二代高通 量测序 (next-generation sequencing, NGS) 技术迅速成为 了基因组学研究的重要工具， 其中包括Illumina Solexa 、ABI SOLiD 、Roche 454 以及Life Tech的半导体测序仪Ion Torrent PGM & Proton 。这些平台原理 各有不同，在通量、读长、准 确度、速度和成本方面各具优 势，均在基因组de novo ，重测 序、转录组、表观遗传学研究 中发挥了重要作用，并逐渐应 用于个性化医疗和遗传诊断等 临床服务
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六 第四代测序技术——纳米孔 测序技术

原理：分子在通过纳米孔道时，会对通 过纳米孔的电流，或横穿过纳米孔的电 流（隧穿电流）产生影响，而每种不同 的分子通过时，对电流产生的影响具有 可区别的差异。于是利用这种差异，纳 米孔测序技术就可以识别基因中碱基 （对）的排列顺序。
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纳米孔技术可以广泛地归纳为两类：生物类和固态类。 α溶血素是一种能天然性地连接到细胞膜中继而导致细胞溶解 的蛋白质，它第一个被用来做成生物纳米孔模型。模型中，一 层生物膜将溶液分为两个区域，α溶血素蛋白嵌入生物膜中形 成纳米孔。当DNA分子穿过纳米孔时阻断电流会发生变化，这 时灵敏电子元件就能检测电流的变化。但是，由于四种碱基的 理化性质比较接近，所以读取序列实际上比想象的困难得多。 此外，有效减少电子噪音仍旧是个挑战，通过降低DNA的位移 速率可以部分减少噪音。最近牛津纳米孔与许多团队在解决这 些问题上取得了一些进步。 第二类纳米孔是以硅及其衍生物进行机械制造而成。使用这些 合成的纳米孔可以降低在膜稳定性和蛋白定位等方面的麻烦， 而这些正是牛津纳米孔公司所创立的生物纳米孔系统一直遇到 的问题。例如，Nabsys就发明了一套系统，他们以汇聚的离子 束将硅片薄膜打成纳米孔，用于检测与特异性引物进行了杂交 的单链DNA穿过纳米孔时的阻断电流变化。IBM创建了一个更 为复杂的系统，能有效地使DNA位移暂停，并在暂停的时候通 过隧道电流检测识别每个碱基
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百度文库
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甲基化研究

SMRT技术采用的是对DNA聚合酶的工作状态进 行实时监测的方法，聚合酶合成每一个碱基， 都有一个时间段，而当模板碱基带有修饰时， 聚合酶会慢下来，使带有修饰的碱基两个相邻 的脉冲峰之间的距离和参考序列的距离之间的 比值如果大于1，由此就可以推断这个位臵有修 饰。甲基化研究中关于5mC和5hmC（5 mC的羟基化形式）是甲基化研究中的热点。但 现有的测序方法无法区分5mC和5hmC。美 国芝加哥大学利用SMRT测序技术和5hmC的选 择性化学标记方法来高通量检测5hmC。通过 聚合酶动力学提供的信息，可直接检测到DNA 甲基化，包括N6甲基腺嘌呤、5mC和5 hmC，为表观遗传学研究打开了一条通路。

第二大阵营为纳米孔测序，代表性的公司为英国 牛津纳米孔公司。新型纳米孔测序法（nanopore sequencing）是采用电泳技术，借助电泳驱动单 个分子逐一通过纳米孔 来实现测序的。
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TSMS技术
Helicos Bioscience (MA, USA) 于2008年推出的HeliScope单分子测序平台被认为是第一个商 品化的第三代测序仪。其测序原理tSMS是由斯坦福大学的S. R. Quake等科学家提出的。
PacBio ：美国太平洋生物科学公司 Helicos 生命科学公司 Oxford ：牛津纳米孔公司
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二 第三代测序技术原理

第三代测序技术原理主要分为两大技术阵营：第 一大阵营是单分子荧光测序，代表性的技术为美 国螺旋生物(Helicos)的TSMS技术和美国太平洋生
物(Pacific Bioscience)的SMRT技术。

tSMS是一种利用光学信号进行DNA碱基识别的边合成边测序 (sequencing by synthesis, SBS) 技术，与二代测序中的Illumina Solexa测序有类似之处，但该技术无需对样本进行 PCR扩增，简化了测序文库的构建过程，也避免了DNA扩增中出现的错误。
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SMRT技术
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三代测序技术的比较
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五 第三代测序技术的应用
基因组测序 甲基化研究 突变鉴定（SNP检测）

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基因组测序

由于具有读长长的特点，SMRT测序平台在基因组测序中 能降低测序后的Contig数量，明显减少后续的基因组拼接 和注释的工作量，节省大量的时间[25]。Christophern等 [26]仅仅用0.5*的Pacbio RS系统长度的数据与38*的二代测 序(NGS)的测序数据，对马达加斯加的一种指猴基因组进 行拼装，大幅度提高了数据的质量和完整度，同时借助 Pacbio RS的帮助将原有的Contig数量减少了10倍。 DavidA．等利用Pachio RS平台C2试剂通过全球合作几天 内就完成了从德国大肠杆菌疫情中获得的大肠杆菌样品 以及近似菌株的测序和数据分析，最终获得了2900bp的 平均读长以及99.998%的一致性准确度。在对霍乱病菌的 研究中，第三代测序技术已初现锋芒。研究人员对5株霍 乱菌株的基因组进行了测序研究，并与其他23株霍乱弧 菌的基因组进行对比。结果发现海地霍乱菌株与2002年 和2008年在孟加拉国分离得到的变异霍乱弧菌ElTorO1菌 株之间关系密切，而与1991年拉丁美洲霍乱分离株的关 系较远。相对NGS的优势就是能更快获得结果，因此该 系统在鉴定新的病原体和细菌的基因组测序方面得到很 广泛的应用
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固态纳米孔测序法

虽然α溶血素七聚体相当不错，但用于悬浮纳 米孔的磷脂双分子层并不稳定且难以操控。固 体或是人造纳米孔被认为是下一代纳米孔技术 一方面因为它们无需使用有机材料做支撑物， 而主要是它们更加稳定。固态纳米孔还能在单 个设备上平行地多重使用，这是生物纳米孔无 法达到的。人造纳米孔组装在固态物质上，如 氮化硅，硅或金属氧化物，及最近使用的石墨 烯。石墨烯是一种新的单原子厚度的材料，是 所知的最薄的膜。宾夕法尼亚大学的Marija Drndic小组发表了DNA通过石墨烯膜纳米孔的 检测实验，该膜的厚度为1 - 5纳米，纳米孔的 直径为5 - 10纳米。
第三代测序技术是指单分子测序技术。DNA测序时，不 需要经过PCR扩增，实现了对每一条DNA分子的单独测 序
13级生物工程
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一 二 三 四 五
第三代测序技术的出现 第三代测序技术原理 第三代测序技术特点 三代测序技术的比较 第三代测序技术的应用
附：六 第四代测序技术
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一 第三代测序技术的出现

第二代测序