Real-time-qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手-生物吧
Real-Time PCR操作手册 0904
7 合成引物: 送往 Sangon 合成引物,大约需三个工作日。
8 引物稀释: 原液 100 μM 工作液 5 μM mixture Forwad primer Reverse primer ddH2O
5 μl 5 μl 90 μl
三) 推荐反应体系
试剂 2 × SYBR Green PCR Master mix cDNA (1-100 ng RNA 反转录所得 cDNA) H2O 5 μM Primer mix 终体积
此时可以设计 Real-time PCR 反应程序,点击兰色行的加号添加反应循环步骤,点击白色行加号添加每 一个循环内的步骤。 上图为 real-time PCR 的默认程序, ① 将第二个循环中第一步 95℃的时间调整为 15 秒,第二步改为 60℃(这些条件都需要根据所用的试 剂不同做出相应的调整), ② 另外我们需要添加熔解曲线步骤,点击红圈标出的加号,添加第三个循环,并把 dwell time 改为 1, setpoint 列改为 95℃, ③ 再点击加号添加第四个循环,并把 dwell time 改为 1,setpoint 列改为 55℃,
5 选择引物序列: 打开 Map 标签页,查看找到的引物序列,此时引物有红蓝两色显示,在 optimal primer pairs only 前
打勾,则只显示红色并基本上按得分高低排列引物,此时尽可能选择靠近 3’端的引物;再打开 Result 标签页,复制 Forwad primer 和 Reverse primer 序列到 Word 文档中,比对引物查看其是否跨越至少 1 个 外显子,再打开 Primer 标签页查看选中的序列的罚分值,若引物正好跨越外显子,且得分比较低(红 色基本可用)则可用。
Real-Time PCR 操作手册
Agilent Real-time qPCR 检测 操作手册说明书
Real-time qPCR 检测操作手册1/ 6一、实验概述Real-time Quantitative PCR Detecting System ,即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统,简称qPCR 。
是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团,利用荧光信号积累实时监测整个PCR 进程,最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法,实现了PCR 从定性到定量的飞跃。
二、实验流程三、实验材料: 1.主要试剂试剂名称 试剂来源 Cat.No. Trizol 上海普飞 3101-100 M-MLV promega M1705 dNTPs promega U1240 oligo dT 上海生工 B0205 Bulge-LoopTM miRNA广州锐博 详见实验报告 qPCR Primer Set Rnase Inhibitor promega N2115 Primer(R&F) 上海生工 详见实验报告 SYBR Master MixtureTAKARADRR041B2/ 6样本收集Trizol 法抽取RNARNA 反转录获取cDNAReal-time qPCR2.主要器材器材名称来源Cat.NoNanodrop 分光光度计Thermo 2000/2000C稳压电泳仪上海天能EPS-600超细匀浆机FLUKO公司F6/10Real time PCR 仪器Agilent公司MX3000p反转录耗材Axygen四、实验步骤:1.总RNA 抽提(1)收取样品,Trizol 裂解。
细胞样品:收集细胞(6 孔板 80%细胞密度),2000 rpm 离心5min,去上清,细胞沉淀中加入1mL Trizol,充分混匀后室温静置 5 min,然后转移至新的 1.5 mL EP 管中;组织样品:将待研磨的组织样品从液氮或者-80℃冰箱中取出,无菌刀片于干冰上将组织样品切割成约 3 mm×3 mm×3 mm 大小,置于装有 1 mL Trizol 裂解液的 1.5mL EP 管中。
Real-Time PCR详细介绍
荧光定量PCR实验指南来源:易生物实验浏览次数:901网友评论0 条荧光定量PCR实验指南关键词:荧光实验指南第一部分一、基本步骤:1、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对;2、引物、探针的设计;3、引物探针的合成;4、反应体系的配制;5、反应条件的设定;6、反应体系和条件的优化;7、荧光曲线和数据分析;8、标准品的制备;二、技术关键:1、目的基因(DNA和mRNA)的查找和比对;从/网点的genbank中下载所需要的序列。
下载的方式有两种:一为打开某个序列后,直接点击“save”,保存格式为“.txt”文件。
保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后,再打开DNAstar软件中的Editseq软件,点击“file”菜单中的“import”,打开后点击“save”,保存为“.seq”文件。
另一种直接用DNAstar软件中的Editseq软件,点击“file”菜单中的“openentrezsequence”,导入后保存为“.seq”文件,保存的名称中要包括序列的物种、序列的亚型、序列的注册号。
然后要对所有的序列进行排序。
用DNAstar软件中的Seqman软件,点击“sequence”菜单中的“add”,选择要比较的“.seq”的所有文件,点击“add”或“adda ll”,然后点击“Done”导入要比较的序列,再点击“assemble”进行比较。
横线的上列为一致性序列,所有红色的碱基是不同的序列,一致的序列用黑色碱基表示。
有时要设定比较序列的开始与结尾。
有时因为参数设置的原因,可能分为几组(contig),若想全部放在一组中进行比较,就调整“project”菜单下的“parameter”,在“assembling”内的“minimum math percentage”默认设置为80,可调低即可。
再选择几个组,点击“contig”菜单下的“reassemble contig”即可。
realtime pcr操作流程
realtime pcr操作流程英文回答:Real-time PCR, also known as quantitative PCR (qPCR), is a widely used technique in molecular biology to detect and quantify DNA or RNA molecules. It is a sensitive and accurate method that allows researchers to measure gene expression levels, identify genetic variations, and detect pathogens.The general workflow of a real-time PCR experiment involves several steps:1. Sample preparation: This step involves extracting DNA or RNA from the sample of interest. Various methods can be used for sample preparation, such as phenol-chloroform extraction, column-based purification kits, or automated extraction systems. The quality and purity of the extracted nucleic acids are crucial for the success of the PCR reaction.2. Primer design: Primers are short DNA sequences that specifically bind to the target DNA or RNA region of interest. They are designed using bioinformatics tools and should have high specificity and minimal secondary structures. The forward and reverse primers are designed to flank the target sequence, and ideally, they should have similar melting temperatures.3. Reaction setup: The PCR reaction mixture is prepared by combining the extracted nucleic acids, primers, a DNA polymerase enzyme, and a fluorescent dye or probe. The reaction mixture is typically prepared in a PCR tube or plate. It is important to maintain proper aseptic techniques to prevent contamination.4. Thermal cycling: The PCR reaction goes through a series of temperature cycles in a thermal cycler machine. These cycles typically include denaturation, annealing, and extension steps. The denaturation step separates the DNA double strands, the annealing step allows the primers to bind to the target sequence, and the extension stepsynthesizes new DNA strands using the primers as templates. The number of cycles depends on the initial amount oftarget nucleic acid and the desired level of amplification.5. Data collection and analysis: Real-time PCR instruments monitor the fluorescence emitted by the fluorescent dye or probe during each cycle. The fluorescence signal increases proportionally to the amount of amplified DNA or RNA. The data can be plotted in a graph called the amplification curve, which shows the exponential growth of the target sequence. The threshold cycle (Ct) value, which represents the cycle number at which the fluorescence signal crosses a predetermined threshold, is used to quantify the initial amount of target nucleic acid.Real-time PCR is a versatile technique that can be adapted to various applications, including gene expression analysis, pathogen detection, and genetic testing. Itoffers high sensitivity, specificity, and quantification accuracy, making it an essential tool in molecular biology research and diagnostic laboratories.中文回答:实时荧光定量PCR(real-time PCR),也被称为定量PCR (qPCR),是分子生物学中广泛使用的一种技术,用于检测和定量DNA或RNA分子。
qPCR操作步骤教案资料
q P C R操作步骤QPCR(Real-time Quantitative PCR Detecting System)即实时荧光定量核酸扩增检测系统,也叫实时定量基因扩增荧光检测系统。
标准的两步法:RNA提取→随机引物反转录→反转录产物10倍稀释→real-time PCR.注意:1 高质量的RNA获取,这里的高质量不是强调RNA降解,而是强调RNA的纯度,不能含有基因组DNA,以及其他杂质污染。
基因组DNA的存在会导致定量偏高,给你错误的结果,所以一般用于定量PCR的RNA必须使用DNase 处理,消除DNA污染。
而RNA中的杂质的污染会限制real-time PCR的反应,导致扩增失败,给你假阴性的结果。
RNA的降解不是关键,一个是因为定量PCR 的引物扩增目的长度本身很短,150-250个bp,并不用于扩增目标基因的全长。
此外是因为存在内参基因,所以RNA降解会通过内参基因的测定来平衡。
毕竟一旦发生降解,所有的RNA以同样的速度降解,而相对比率不会改变。
2 减少加样误差,在使用SYBR Green MIX的时候,一定要先按照反应的量(比如8个孔)把所有的试剂一次性配成MIX然后分装,留出5微升的反应体系给模板,使用5微升是因为只有5微升以上,加样枪的误差才会比较小,如果你仅仅是吸取一微升的话,手重一点或者轻一点都会造成极大的加样误差,严重影响你的定量精确度。
3 选择合适的内参基因,一般用于定量PCR的内参基因有好几种,但却没有完全通用的内参基因。
具体到不同来源的细胞,比如不同组织来源,或者是动物等等,内参基因会有差异,最好的办法是,在你的样品上先测试内参基因,找到变化最小,最稳定的一个。
4 合适的引物设计,避免出现引物二聚体,非特异性扩增等。
Q-PCR实验流程:一、①实验前准备,每天早上到实验室后,先把超净工作台的紫外灯打开15-20分钟。
②超净台前做实验,需佩戴干净的橡胶手套/一次性薄膜手套,RNA抽提需带口罩。
real time-QPCR实验指导
实时荧光定量PCR实时荧光定量PCR,简称RT-QPCR, 属于Q-PCR的一种,目前该技术已得到广泛应用,如:扩增特异性分析、基因定量分析、基因分型、SNP分析等。
荧光定量PCR最常用的方法是DNA结合染料SYBR GreenⅠ的非特异性方法和Taqman 水解探针的特异性方法。
本视频使用LightCycler® 480 SYBR Green I Master试剂盒介绍SYBR Green I 的非特异性方法。
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的具有绿色激发波长的荧光染料,可与所有的各种序列的双链DNA 分子结合。
在游离状态下,SYBR Green I 发出微弱的荧光,但一旦与双链DNA结合,嵌入至dsDNA,荧光大大增强。
因此,SYBR Green I的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关,PCR 扩增不同时期中,dsDNA 含量不同,SYBR Green I 荧光信号强度不同。
可以根据荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量,并可根据对照进行相关的计算和分析。
实验前准备实验开始前,需准备好实验所需的各种试剂和耗材。
试剂包括:特异性PCR引物,新鲜提取备用的总RNA。
使用的试剂盒有:用于合成cDNA第一链的罗氏试剂盒Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit,包含了cDNA反应所需要的所有实验组分以及相关的正对照反应组分。
配套LightCycler® 480使用的试剂盒LightCycler® 480 SYBR Green I Master,包含了PCR所需的各种实验组分,如1号管中包含热启动Taq DNA Polymerase 及反应缓冲液,dNTP mix,SYBR Green I染料和MgCl2正式试验开始前,冰上解冻各个试剂及试剂盒组分,置于冰上待用。
注意:SYBR Green I Master需避光放置。
Real-timeqPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手_生物吧
Real-timeqPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手_生物吧Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测,很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑,不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起,包括real-time qPCR 的原理,实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教你从各个方面了解real-time qPCR,彻底的从菜鸟到高手!一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR 进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点,real-time qPCR由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年,美国PE公司(已经并入Invitrogen公司)成功研制了Taqman技术,1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统,通过检测每个循环的荧光强度,通过Ct值进行数据分析。
Real time PCR操作步骤:从采样到数据处理
Real time PCR操作步骤:从采样到数据处理1.采样:1.1采样前的准备:DEPC水,灭菌手术刀剪,75% 酒精,2 mL无RNA酶离心管,2个盛有DEPC水的烧杯,一个用于冲洗样品,一个用于放置手术刀剪,以减少外界污染。
1.2采样过程中的注意事项:采样人员需带好口罩和手套,并且尽量少讲话。
当鸡放血致死后,立即解剖,并优先取RNA试验用样品。
取样量约100 mg左右(根据RNA提取方法不同可改变取样量),尽量保证每管取样大小和部位接近一致(可事先取些样品,有个大概的标准即可)。
RNA样品采集于离心管中,立即投入液氮(或者RNA保存液中)冻存,最后统一转入-70 ℃冰箱。
根据实验条件选择RNA样品的保存方式,优先选择液氮保存。
建议:如果直接投入液氮保存,离心管盖子要盖严,以免液氮渗入管中,导致离心管在转入-70 ℃冰箱时管盖崩开使样品损失。
2.总RNA提取提取组织和细胞总RNA推荐使用Trizol法。
2.1 Trizol提取总RNA的操作步骤以下操作需在超净台中进行,超净台使用前需用75% 酒精擦拭台面,紫外灯照射半小时后,打开风机排除臭氧,减少对实验人员的伤害。
此外,要提前制冰备用。
1)每50-100 mg样品加1 ml Trizol,使用高通量研磨仪研磨30 s。
2)研磨后样品放置5 min,4 ℃12 000 g离心10 min,上清液转移到另一个1.5 ml无RNA酶离心管中(已冰上预冷)。
3)加入200 µL氯仿,用力摇晃15 s,室温放置5 min。
4) 4 ℃ 12 000 g离心15 min,上清液转移至另一个1.5 ml无RNA酶离心管中(已冰上预冷)。
5)加入500 µL异丙醇,上下颠倒混匀,室温静置10 min,沉淀RNA。
6) 4 ℃ 12 000g离心10 min,弃上清。
7)加入1 ml 75% 乙醇(DEPC水配制),用移液器反复吸打乙醇,洗涤RNA沉淀。
realtimepcr简易操作流程
Real-time PCR(实时聚合酶链反应)是一种用于检测和定量DNA或RNA的技术。
它可以在PCR(聚合酶链反应)进行的实时监测PCR 产物的累积量。
real-time PCR技术适用于病毒检测、基因表达分析、SNP检测等许多领域。
real-time PCR技术的操作流程相对简单,但需要一定的实验操作技巧和严格的操作规范。
以下是real-time PCR的简易操作流程:1. 样品准备- 从实验对象中收集所需的组织样品或细胞样品。
- 样本的处理和提取要遵循标准的生物安全操作规程,确保样品的纯度和完整性。
2. DNA/RNA提取- 根据实验需求选择合适的DNA/RNA提取试剂盒和方法,从样品中提取目标DNA或RNA。
- 保证提取的DNA/RNA质量和浓度满足real-time PCR的要求。
3. Primer和探针设计- 根据目标基因序列设计引物和探针,确保其特异性和有效性。
- 引物和探针的设计应遵循一定的原则和标准,可以使用专业的设计软件或委托专业实验室进行设计。
4. PCR体系设置- 根据实验设计和引物/探针的特性设置PCR反应体系,包括引物和探针的最佳浓度、PCR反应缓冲液、酶和模板DNA/RNA的加入量等。
- 严格按照实验方案中的要求和比例进行PCR反应体系的设置,确保反应的准确性和稳定性。
5. PCR反应- 将PCR反应体系加入到real-time PCR仪器中,根据实验方案设置好PCR程序。
- 在PCR过程中,实时监测PCR产物的累积量,记录和分析反应曲线。
6. 数据分析- 根据实验目的和方法选择合适的real-time PCR数据分析软件,对实验数据进行处理和分析。
- 分析数据并计算目标基因的相对表达量或浓度,进行统计学分析和结果解读。
7. 结果呈现- 将实验结果以图表或表格的形式清晰呈现出来,配以必要的文字解释。
- 结果的呈现应简洁明了,突出实验的关键发现和结论。
real-time PCR技术的操作流程虽然相对简单,但在实际操作中仍然需要严格遵循操作规范和注意实验细节。
实验技术:RealtimePCR
实验技术:RealtimePCR作为在实验室奋斗的“奋青”们,都知道Realtime PCR(RT-PCR)是并列于western blot的基础实验之一。
不会做PCR的人都不好意思说自己在搞科研,呵呵哒。
作为一门核心技术,也是相对来说出结果快速的技术,本次小笔将一改逗比风格,高冷正经脸来分享该技能,各位接好了啊。
RT-PCR原理的话简单来说,就是采用荧光基团标记的特异性探针来跟踪PCR产物,做到全程监控,后期结合电脑软件分析定量得出待测样品的初始量。
步骤如下:1. RNA提取和测定(1)平衡:-80℃取出TRIZOL裂解的细胞(也可以当时裂解;如果是组织,需要超声破碎后再进行后续步骤),置于室温使其完全溶解(3-5min左右);(2)分离:随后按照裂解液:氯仿(5:1)的比例加入氯仿,剧烈震摇30 S(自认为手劲儿大的就手动摇,扛不住的话也可以涡旋仪,当然我是一直手动的哈哈)后,室温静置3min,4℃,13,000rpm离心10 min,取上清置于干净的RNAfree的EP管中。
【小提示:取上清的时候很容易将中间层的絮状物吸出,导致蛋白质污染,可以采用PhaseLock Gel的离心管,有效分层水相和有机相,避免吸取的上清混杂杂质。
】(3)沉淀:在上清中加入等体积的异丙醇,轻微上下翻动混合,冰上孵育20min后,4℃,14,000rpm离心20 min,管底部有可见沉淀,即为RNA(如果裂解的细胞较少,沉淀可能肉眼看不见)。
(4)清洗干燥:轻柔的倒掉上清,每管加入1 ml 75%乙醇溶液(采用DEPC水配置),混匀,4℃,14,000 rpm离心15 min。
小心倒掉上清,于超净台边缘干燥5min。
(5)溶解测定:根据具体的RNA的量,加入适当的DEPC水溶解(沉淀可见,加入的DEPC水多一些,反之少加),静置后即可于nanodrop检测浓度(一般我们暂定A260/A280比值在1.8-2.0即可使用)。
Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析)
•
绝对定量:从荧光到拷贝数
The well contains 400 target copies
Y= mx+b
Ct values
0
Ct‘s
1
2
3
4
5
6
7
Log copy number
相对定量:参照因子 Calibrator
用以比较结果的基准
time t =0 t=12 t=24 t=48
total RNA total RNA
t=0 t=1h
2.0 1 0.1
t=6h t = 24 h
相对定量研究软件
• • • 同时分析多达10块反应板的基因表达数据 – 多至960个数据点的单击分析 – 数据直观 通过ΔΔCT (比较 Ct)法完全自动分析数据 无须将数据导出至电子数据表或多次数据导出
终点检测 终点检测
等位基因分型 等位基因分型 阴性阳性鉴定 阴性阳性鉴定
Workflow
mirVana™ miRNA Isolation Kit
TaqMan® MicroRNA RT kit TaqMan® MicroRNA Assays
TaqMan® Universal Master Mix,No UNG
Five Fully Integrated Systems for Real-Time PCR
•
•
正常与突变探针在同一管里反应的点突变检测
基因分型检测
FAM VIC Homozygote for FAM-specific allele
VIC FAM Homozygote for VIC-specific allele
FAM VIC
Heterozygote for both alleles
real time quantative PCR(RT-PCR,qPCR)实时定量PCR详细操作流程
1.SYBR Green使用浓度:太高抑制Taq酶活性,太低,荧光信号太弱。
2.引物特异性高,否则扩增有杂带。
3.反应温度和时间,根据酶和引物决定。
4.其他与常规PCR相同。
noise band建议刚好越过实验中设置的阴性孔。
不同的基因不需要相同的阈值,但是每块板上同一对引物扩增的基因使用相同的阈值。
横坐标:扩增循环数纵坐标:荧光强度每个循环进行一次荧光信号收集荧光信号阈值:前15个循环信号作为荧光本地信号baseline,即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值。
荧光阈值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。
Ct:PCR扩增过程中,扩增产物的荧光值达到设定的阈值时所经过的扩增循环次数。
Ct值极具重现性。
定量时多取15-35较好。
1.dye kit:roche lightcycle 480 sybr green 1 masterKit中小瓶:Master 2x, 储存于-20℃,避光,避免反复冻融,使用前上下颠倒混匀,避免气泡,不能震荡Water,PCR grade储存于-20℃配制好的PCR反应液,可于室温稳定保持24h,需避光。
2.template:在20μl体系中,说明书中推荐20ng纯化的cDNA,50-100ng genomic DNA,108拷贝plasmid DNA。
根据以往经验,150-200ng cDNA(也许未纯化)为佳。
模板太多,会影响荧光发光。
如果模板不纯,则模板量不能超过2μl,预变性时间改为10min,可降低模板中杂质的影响。
3.primer:最终工作浓度为0.2-1μM, 推荐0.5μM。
引物浓度的原则是,达到目标荧光浓度时,最低引物浓度,导致最低crossing points,Cp值。
4.products: 产物长度最好不超过500bp5. system✧配制体系时,不能触摸PCR板的上表面以及封口膜,戴手套✧Master mix避光✧冰上加样✧准备好混合样品后,吹打混匀,不能震荡20μlMaster mix 10F(10μM)1(0.5μM)R(10μM)1(0.5μM)Template 1(150ng)DDW PCR grade 76.program:Incubation 95℃ 5min or 10min Amplification 95℃ 10s55-60℃(选58℃),5-20s(选20s)72℃5-30s(选30s)40 or 45 cyclesMelting Curve 95℃ 5s,65℃1min,97℃Cooling 40℃ 10s。
qpcr实验步骤详细
qpcr实验步骤详细引言real-time定量聚合酶链反应(qPCR)是一种快速、敏感并具有高度准确性的分子生物学技术,广泛应用于基因表达、DNA定量和病原体检测等领域。
本文将详细介绍qPCR的实验步骤。
材料和试剂•qPCR仪器设备•PCR反应管•DNA模板•引物•DNA聚合酶•dNTP混合液•磷酸盐缓冲液•MgCl2•荧光探针•模板DNA稀释液实验步骤步骤1:实验室准备准备实验室工作台,并清洁工作台表面以消除任何潜在的污染源。
确保所有实验器材和试剂处于合适的工作温度。
步骤2:qPCR反应物的制备1.在干燥的PCR反应管中,向每个样品管中加入以下组分:•磷酸盐缓冲液:根据试剂盒说明书加入适量的磷酸盐缓冲液。
•dNTP混合液:加入适量的dNTP混合液。
•MgCl2:根据试剂盒说明书加入适量的MgCl2。
•引物:根据实验需要加入适量的引物。
•DNA聚合酶:根据试剂盒说明书加入适量的DNA聚合酶。
2.轻轻混合反应管,以确保所有反应物均匀混合。
步骤3:样品处理1.准备待测样品DNA。
可以通过提取DNA、RNA逆转录制备cDNA等方法获取。
2.将待测样品DNA加入PCR反应管中。
步骤4:qPCR条件设置1.预热qPCR仪器到适当的温度。
2.设置qPCR仪器的程序:•95°C:预热反应管,持续2-5分钟。
•95°C:变性步骤,持续15-30秒。
•Tm温度(引物特异性):退火步骤,持续30秒-1分钟。
•72°C:延伸步骤,持续30秒-1分钟。
•重复步骤2-4,通常为25-40个循环。
步骤5:数据收集和分析1.使用qPCR仪器实时收集PCR数据。
2.通过仪器软件对数据进行分析。
结论经过上述步骤,我们可以成功进行qPCR实验。
这项技术可用于快速、准确地定量检测和分析DNA样品,对于研究基因表达调控、疾病诊断和药物研发等领域具有重要意义。
请注意,本篇文章是一种原创性的解释文章,旨在介绍qPCR实验步骤。
real time pcr
real time pcrReal-time PCRReal-time PCR,即实时荧光定量PCR(qPCR),是一种强大的分子技术,能够在实时状态下监测和测量DNA的扩增。
该技术通过对传统PCR的改进,实现了对特定DNA序列的高精度、高灵敏度和快速检测与定量。
Real-time PCR的核心特征实时监测Real-time PCR在每次扩增循环后测量PCR产物的积累,从而能够在反应的对数增长阶段进行量化。
这种实时监测的特性使得该技术能够准确反映DNA 扩增的动态过程。
通过实时监测,研究人员可以在反应进行过程中观察到DNA 扩增的每一个阶段,而不必等到反应结束后再进行分析。
这种特性不仅提高了实验的效率,还减少了由于后续处理步骤可能引入的误差。
此外,实时监测还允许研究人员在反应过程中进行调整,以优化实验条件,提高结果的准确性。
量化能力该技术提供了一种可靠的量化关系,即初始目标DNA序列的数量与产生的扩增子(amplicon)数量之间的关系。
这种量化能力使得Real-time PCR在需要精确测量DNA或RNA数量的应用中具有显著优势。
通过标准曲线法或绝对定量法,研究人员可以准确地计算出样本中目标序列的初始拷贝数。
这对于需要精确定量的实验,如基因表达分析、病毒载量测定等,具有重要意义。
量化能力的提高也使得Real-time PCR在药物开发、临床诊断等领域得到了广泛应用。
高灵敏度Real-time PCR具有极高的灵敏度,能够检测到极少量的目标DNA。
这种高灵敏度特性使得该技术在病原体检测、基因突变分析等需要高灵敏度的场景中尤为重要。
通过使用特异性探针和优化的反应条件,Real-time PCR可以检测到低至单拷贝水平的目标序列。
这对于早期疾病诊断、微量样本分析等应用至关重要。
高灵敏度的检测能力还使得Real-time PCR在环境监测、食品安全检测等领域得到了广泛应用。
多功能性Real-time PCR不仅可用于定性分析(即检测目标DNA或RNA的存在与否),还可用于定量分析(即测量目标DNA或RNA的拷贝数)。
Real-timePCR实验步骤(自己总结)
Real-timePCR实验步骤(⾃⼰总结)Real-time PCR实验步骤北京协和医学院⾩外⼼⾎管病医院⼼外科⼼⾎管病国家重点实验室吴益和实验中必须坚持的⼀些好习惯总的注意事项:1. 加⼊试剂之前,把它混匀⼀下,以免放置时间长了浓度不均2. 移液枪⽤完之后要归到最⼤计量的位置,防⽌久⽽久之弹簧失去弹性3. 所有的试剂都⾃⼰配,出了问题才好找原因⼀、防⽌RNA酶污染的措施1. 所有的玻璃器⽫均应在使⽤前于180℃的⾼温下⼲烤6hr或更长时间。
2. 塑料器⽫可⽤0.1% DEPC⽔浸泡或⽤氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使⽤)。
3. 有机玻璃的电泳槽等,可先⽤去污剂洗涤,双蒸⽔冲洗,⼄醇⼲燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后⽤0.1% DEPC⽔冲洗,晾⼲。
4. 配制的溶液应尽可能的⽤0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。
然后⽤⾼压灭菌除去残留的DEPC。
不能⾼压灭菌的试剂,应当⽤DEPC处理过的⽆菌双蒸⽔配制,然后经0.22µm 滤膜过滤除菌。
5. 操作⼈员戴⼀次性⼝罩、帽⼦、⼿套,实验过程中⼿套要勤换。
6. 设置RNA操作专⽤实验室,所有器械等应为专⽤。
⼆、常⽤的RNA酶抑制剂1. 焦磷酸⼆⼄酯(DEPC):是⼀种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。
它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋⽩质变性,从⽽抑制酶的活性。
2. 异硫氰酸胍:⽬前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。
它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋⽩中解离出来,⼜对RNA酶有强烈的变性作⽤。
3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离⼦和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,⼏乎能完全抑制RNA酶的活性。
4. RNA酶的蛋⽩抑制剂(RNasin):从⼤⿏肝或⼈胎盘中提取得来的酸性糖蛋⽩。
RNasin 是RNA酶的⼀种⾮竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。
Real-time PCR
实时PCR实时PCR(real-time PCR),属于定量PCR(Q-PCR)的一种,以一定时间内DNA的增幅量为基础进行DNA的定量分析。
real time PCR 的定量使用荧光色素,目前有二种方法。
一种是在ds DNA中插入特异的荧光色素,例如SYBR Green荧光染料;另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种荧光探针(probe),如Taqman 探针。
、两种方法原理不同。
SYBR Green荧光染料游离时不发光,当反应体系中存在双链DNA时,SYBR Green与双链DNA结合,此时才发光。
Taqman探针带有一个荧光基团和一个淬灭基团,荧光基团连接在探针的5’末端,而淬灭基团则在3’末端。
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的5'-3'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,此时荧光基团发出的荧光信号可以被检测到。
real time PCR 与 reverse transcription PCR 相结合,能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。
这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR(quantitative RT-PCR)”反应体系oligo: 多聚体,相当于mRNA引物AMV RT:禽类成髓细胞瘤病毒逆转录酶MMLV RT:莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶dNTPs:脱氧核苷酸RNase:RNA酶抑制剂PCR Buffer:RT-PCR缓冲液MgCl2:2价镁离注意事项:绝对定量:几种可能:1. 你的cDNA浓度是不是通过紫外分光测定的?紫外的干扰因素很多,只能作为浓度参考,也就是可能会导致你的内参Ct有差异,正常现象。
2. 反转录的效率,如果你的内参扩增产物在靠近mRNA的3'端影响不大,如果在里面或者5'端,Ct值存在差异正常。
Real-TimePCR:从原理到步骤详解、再到终极数据分析
Real-TimePCR:从原理到步骤详解、再到终极数据分析作者:解螺旋·猫大如需转载请注明来源:解螺旋·医生科研助手导语小伙伴们,今天我们来解析一下Real-Time PCR,从原理到步骤详解再到数据分析,一个都不能少!在正式开讲之前呢,猫大必须要安利一个网址:/primerbank/ 。
对,这就是著名的哈佛引物库!目前 PrimerBank 收录了超过 306,800 对 Real-Time PCR 引物,涵盖了大部分人类和小鼠基因。
小伙伴们可以用GenBank Accession,NCBI protein Accession,NCBI Gene ID,Gene Symbol,PrimerBank ID 或者关键词去库里搜索引物。
而且还整合了blast 功能,可以拿目的基因序列去 primerbank 的数据库里进行blast。
据说其中收录的26,855 对小鼠引物经过Real Time PCR 验证后,其中22,187 对引物是可用的,成功率有82.6%但是猫大建议小伙伴们,在库里搜索到引物之后呢,别忘了用 oligo 6 评价一下引物,多练习一下 oligo 6 的使用也是很好的嘛。
好,下面开讲 Real-Time PCR,我们就从 Real-Time PCR 的发展史说起,包括Real-Time PCR 的原理,实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教你从各个方面了解Real-Time PCR 。
由于内容比较多,这五个部分会分成 3 讲。
首先是 Real-Time PCR 的原理,实验设计和实际操作。
Real-Time PCR 发展史Real-Time PCR 的技术的发展是伴随着 Real-Time PCR 仪的研制。
1995 年,美国ABI 公司(已经并入Invitrogen 公司)成功研制了Taqman 技术,并推出了首台荧光定量PCR 检测系统7700,通过检测每个循环的荧光强度对PCR 进程进行实时检测。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性,平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益,请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间:9:00-18:30)。
Real-time-qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手-生物吧Real-time qPCR手册---手把手教你从菜鸟到高手时间:2012-03-05 21:22来源:生物吧作者:刘浩点击: 13338 次由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的由于Real-time qPCR的众多优点,现在已经是生命科学领域的一项常规技术。
越来越多的研究文章中涉及RT-PCR的实验,也基本上被real-time qPCR所代替。
由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测,很多没有做过real-time qPCR的研究者常常感到高深莫测,不知从何入手;甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑,不知所措。
本文就从real-time qPCR的发展史说起,包括real-time qPCR的原理,实验设计,实际操作,数据分析,常见问题解答五个方面,手把手教你从各个方面了解real-time qPCR,彻底的从菜鸟到高手!一、Real-time qPCR发展史Real-time qPCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。
由于在PCR扩增的指数时期,模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系,所以成为定量的依据。
由于常规的PCR 的缺点,real-time qPCR由于其操作简便,灵敏度高,重复性好等优点发展非常迅速。
现在已经涉及到生命科学研究的各个领域,比如基因的差异表达分析,SNP检测,等位基因的检测,药物开发,临床诊断,转基因研究等。
在Real-time qPCR技术的发展过程中,定量PCR仪的发展起了至关重要的作用。
1995年,美国PE公司(已经并入Invitrogen公司)成功研制了 Taqman技术,1996年推出了首台荧光定量PCR检测系统,通过检测每个循环的荧光强度,通过Ct值进行数据分析。
从而荧光定量PCR获得广泛应用。
现在的定量PCR仪有ABI7000、7300、7500,7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、 PRISM@StepOneTM系列;BIO-RAD的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列;Stratagene MxTM系列;Roche LightCycler@系列;Eppendorf Masercycler@;Corbett Rotor-GeneTM;Cepheid SmartCycler@和BIOER的LineGene系列。
随国内生命科学的快速发展,科研水平不断提高,发高水平文章已不再是新鲜事。
与其同时,国内公司经过长期不懈的努力,也有自主研发的real-time PCR仪器生产比如西安天隆科技公司的TL系列仪器。
二、Real-time qPCR概述1. Real-time qPCR原理实时PCR就是在PCR扩增过程中,通过荧光信号,对PCR进程进行实时检测。
一般来讲,定量PCR仪包括:实时荧光定量PCR仪主要由样品载台、基因扩增热循环组件、微量荧光检测光学系统、微电路控制系统、计算机及应用软件组成。
其中基因扩增热循环组件工作原理与传统基因扩增仪大致相同,不同厂家不同型号的产品分别采用空气加热、压缩机制冷、半导体加热制冷等工作方式。
独特是这个微量荧光检测系统。
有由荧光激发光学部件、微量荧光检测部件、光路、控制系统组成。
常用的荧光激发方式有两种:卤钨灯和LED;荧光检测元件常用两种方式:光电倍增管和冷光CCD摄像机,光单色元件有滤光片和光栅。
在实时PCR扩增过程中,荧光信号被收集,转化为成为扩增和熔解曲线。
具体数据就是基线,荧光阈值和Ct值。
2. Real-time qPCR的数学原理首先来看一个real-time qPCR中的重要参数Ct值(Ct value),阈值(threshold),和基线(baseline)。
一般来讲,第3-15个循环的荧光值就是基线,是由于测量的偶然误差引起的。
阈值一般是基线的标准偏差的10倍。
在实际操作中也可以手动调节,位于指数期就可以。
Ct值就是荧光值达到阈值时候的PCR 循环次数。
所以是一个没有单位的参数。
那么为什么说Ct值跟初始模板的量成反比呢?我们来看PCR的扩增方程:从线性方程上看,斜率(slope)为就可以算出扩增效率(0.99)。
一般来讲PCR扩增效率在90%-110%都是可以用于数据分析的。
效率低于100%,是由于PCR反应中存在抑制因素;而高于 100%可能一些污染、非特异性扩增或者是引物二聚4. Real-time qPCR和常规PCR的区别实时检测(在对数扩增时期)而不是终点检测敏感性高需要样品少特异性高精确定量实验设计其实比实验本身更重要!好的实验设计可以事半功倍,节省时间!尤其做生物实验,一定要查询尽可能完全的相关资料,整理好思路,设计好实验路线。
当然实验过程中出现各种各样的变化,但有足够多的背景知识,就可以分析原因,才有可能创新。
对于一个real-time qPCR而言,首先就是实据分析(这一部分单独说明)。
1. 实验材料的处理和准备以最基本的基因表达差异分析为例。
实验材料分为对照组(CON)和处理组(TRT)。
组内要有生物重复,可以数据分析此处理是否有统计意义。
在材料收集过程中,尽量避免RNA的降解(尤其对于绝对定量的样品)。
一般传统的收集材料的方法是样品采集立刻液氮速冻,然后迅速转移到超低温冰箱保存,但这种方法携带不方便,由于对于异地取材。
现在新技术的发展,也有一些非液氮类的样品储存液,比如百泰克的RNAfixer 。
2. 引物设计一般real-time PCR引物的设计遵循下面一些原则:扩增产物长度在80-150bp。
引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
产物不能形成二级结构。
产物长度一般在15-30碱基之间。
G+C含量在40%-60%之间。
碱基要随机分布。
引物自身不能有连续4个碱基的互补。
引物之间不能有连续4个碱基的互补。
引物5’端可以修饰。
引物3’端不可修饰。
引物3’端要避开密码子的第3位。
Taqman@探针的设计稍有不同,一般有公司设计合成。
遵循下面以下原则:尽量靠在上游引物;长度30-45bp,Tm比引物高至少5℃;5’端不要是G,G会有淬灭作用,影响定量四、Real-time qPCR操作过程1. RNA提取和反转录在抽提RNA过程中任一环节的不正确操作都可能导致RNA酶的污染。
由于RNA酶的活性很难完全抑制,预防其污染是十分必要的。
在实际的操作中应遵循下面一些原则:1. 全程佩戴一次性手套。
皮肤经常带有细菌和霉菌,可能污染RNA的抽提并成为RNA酶的来源。
培养良好的微生物实验操作习惯预防微生物污染。
2. 使用灭菌的,一次性的塑料器皿和自动吸管抽提RNA,避免使用公共仪器所导致的RNA酶交叉污染。
例如,使用RNA探针的实验室可能用RNA酶A或T1来降低滤纸上的背景,因而某些非一次性的物品(如自动吸管)可能富含RNA酶。
3. 在提取裂解液中,RNA是隔离在RNA酶污染之外的。
而对样品的后续操作会要求用无RNA酶的非一次性的玻璃器皿或塑料器皿。
玻璃器皿可以在150°C的烘箱中烘烤4小时。
塑料器皿可以在0.5M NaOH 中浸泡10分钟,用水彻底漂洗干净后高压灭菌备用。
当然,这些也不是绝对的要求。
如果是操作熟练。
完全可以用初次开封的离心管和枪头,新过滤的超纯水,进行RNA的提取。
2.Mix配制一般来讲,进行real-time qPCR MasterMix都是2×的浓缩液,只需要加入模板和引物就可以。
由于real-time qPCR灵敏度高,所以每个样品至少要做3个平行孔,以防在后面的数据分析中,由于Ct相差较多或者SD太大,无法进行统计分析。
通常来讲,反应体系的引物终浓度为100-400mM;模板如果是总RNA一般是10ng-500,如果cDNA,通常情况下是1ul或者1ul的10倍稀释液,要根据目的基因的表达丰度进行调整。
当然这些都是经验值,在操作过程中,还需要根据所用MasterMix,模板和引物的不同进行优化,达到一个最佳反应体系。
在反应体系配置过程中,有下面几点需要注意:1. MasterMix不要反复冻融,如果经常使用,最好溶解后放在4度。
2. 更多的配制Mix进行,减少加样误差。
最好能在冰上操作。
3. 每管或每孔都要换新枪头!不要连续用同一个枪头加样!4. 所有成分加完后,离心去除气泡。
5. 每个样品至少3个平行孔。
参比或者校正染料(reference dye,passive dye)常用的是ROXTM(现在已经是ABI的注册商标了!)或者其他染料,只要不影响检测PCR产物的荧光值就可以。
参比染料的作用是标准化荧光定量反应中的非PCR震荡,校正加样误差或者是孔与孔之间的误差,提供一个稳定的基线。
现在很多公司已经把ROXTM配制在MasterMix或者 Premixture里。
如果反应曲线良好或已经优化好反应体系,也可以不加ROXTM染料校正。
通常来讲,real-time qPCR的反应程序不需要像常规的PCR那样,要变性、退火、延伸3步。
由于其产物长度在80-150bp 之间,所以只需要变性和退火就可以了。
SYBR@Green等染料法,最好在PCR扩增程序结束后,加一个溶解程序,来形成溶解曲线,判断PCR产物的特异性扩增。
而溶解程序,仪器都有默认设置,或稍有不同,但都是一个在产物进行溶解时候,进行荧光信号的收集。
3. 仪器设置所有仪器的操作都基本一致。
设置的时候包括反应板设置(plate setup)和程序设置(program setup)。
我们以 ABI StepOne为例,详细看一下反应设置:A. 首先是实验目的选择:定量还是其他。
我们命名为“BioTeke”,进行“定量”实验。
B. 实验方法的选择:我们选用的比较Ct的SYBR Green方法, Fast程序,以cDNA为模板进行。
C. 目的基因的设置:有几个目的基因和目的基因的名称。
D. 样品的设置:包括哪个是实验组,哪个是对照组。
以及负对照的设置和生物重复的设置。
E. 对照组和内参基因的设置:这个是为后面的定量做准备F. 反应程序的设置:PCR反应程序的设置要根据不同公司的MasterMix。
比如BioTeke的95℃ 2分钟就可以激活DNA聚合酶(ABI的需要10 分钟)。
循环反应是95℃15秒,60℃15秒的40个循环。