11-金黄色葡萄球菌PFGE方案

金黄色葡萄球菌脉冲场凝胶电泳标准操作程序

1.菌悬液的制备

1）在Falcon 2054管上标记样品名称和空白对照，

分别加入约1-2mlCSB缓冲液。

2）在1.5ml eppendorf管上标记好对应样品的名称。

3）用棉棒从培养皿上刮取适量细菌，悬浊于CSB中，用eppendorf分光光度计测其OD值，调整至5.5～6.5之间。注：如果样品数量多，调完OD后先存放于4℃。

4）取250µl菌悬液于相应的1.5ml eppendorf管中。

5）加入2µl溶葡萄球菌酶（1mg/ml），用移液枪充分吹打。不需振荡摇匀。2.胶块的制备

1）准备10ml的1% SKG（称取0.1g SKG溶于TE，用微波炉加热至完全溶解，放在53℃～56℃水浴中）。

2）取250µl预热（53℃～56℃）的SKG，与250µl菌悬液混合，用移液枪轻轻吹打5次左右至液体混匀，避免产生气泡。混合前菌悬液可在水浴里预热10秒，并摇匀。

3）将混合物立即加入模具，避免产生气泡，在室温下凝固10～15分钟或置于4℃冰箱5分钟。

3.细胞的裂解

1）在50ml的screw-cap tube上做好标记。

2）配制细胞裂解液（CLB），参见表1。蛋白酶K原液须放在冰上或冰盒里。

表 1

样本数量CLB 蛋白酶K（20mg/ml）

1 4ml 30µl

10 40 ml 300µl

3）每个管子加入4ml蛋白酶K/CLB混合液。保证胶块在液面下而不在管壁上。

4）将管子放在54℃水浴摇床中孵育2小时，转速约170转/分钟。

5）将纯水和TE放在54℃水浴中预热。

4.洗胶块

1）从水浴摇床中拿出screw-cap管，盖上绿色的screened-cap，轻轻倒掉CLB。

2）每管中加入15ml预热的纯水。确保胶块在液面下而不在管壁或盖子上，放回54℃水浴摇床中，摇15分钟。

3）倒掉水，加入15ml预热的TE，在54℃的水浴摇床中重复洗3次，时间分别为15分钟，15分钟，30分钟。

4）倒掉TE，加入5ml TE，放在4℃冰箱保存备用。

第二天

5.胶块内DNA的酶切

1）准备30℃和37℃水浴。在1.5ml eppendorf管上标记好相应样品的名称。2）按照表2，配制SmaI的稀释缓冲液，混匀。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA置于冰上。

表2

试剂（Takara）µl/胶块µl /7胶块µl /12胶块

纯水160µl1120µl1920µl

10×T Buffer 20µl140µl240µl

BSA（0.1％）20 140 240

总体积200µl1400µl2400µl

3）按照表3，配置XbaI的稀释缓冲液。注意：须带手套操作，缓冲液和BSA 置于冰上。

表3

试剂（Promega）µl/胶块µl /3胶块

纯水178µl534µl

Buffer D 20µl60µl

BSA（10mg/ml） 2 6

总体积200µl600µl

4）在每个1.5ml eppendorf管中加入200µl稀释缓冲液。

5）用刀片切下2mm宽的胶块放入1.5ml eppendorf管中。确保胶块在液面下面。将剩余的胶块放回原来的TE中。

6）用同样的方法处理标准株H9812的胶块，放入XbaI缓冲液中。

7）将XbaI管子放在37℃水浴中，SmaI管子放在30℃水浴中孵育10-15分钟。8）在用稀释缓冲液孵育的过程中，按照以下的比例配制酶切缓冲液，混匀。表4

试剂（Takara）µl/胶块µl /7胶块µl /12胶块

纯水155µl1085µl1860µl

10×T Buffer 20µl140µl240µl

BSA（0.1％）20 140 240

SmaI 5 35 60

总体积200µl1400µl2400µl

表5

试剂（Promega）µl/胶块µl /3胶块

纯水173µl519µl

Buffer D 20µl60µl

BSA（10mg/ml） 2 6

XbaI 5 15

总体积200µl600µl

9）孵育完，用移液枪吸出液体，吸液时枪头应贴到管底，注意避免破坏胶块。

10）每管加入200µl内切酶混合液，确保胶块在液面的下面。

11）将XbaI管子放在37℃，SmaI管子放在30℃水浴中孵育3～4小时。

6.制备1％胶

1）称取1g SKG，溶于100ml 0.5×TBE缓冲液中。15孔模具需配制150ml体积的胶。

2）微波炉加热约2分钟，每20妙混匀，直至完全溶解。

3）放在53℃～56℃水浴，5～6分钟。

7.加样

1）调整梳子的高度，使梳子齿与胶槽的底面相接触。用水平仪调整胶槽使其水平。

2）从37℃水浴中取出胶块，平衡到室温。用枪头吸出酶切混合液，枪头应贴至管底，避免损伤或吸出胶块。

3）每管加入200µl 0.5×TBE，用枪头冲洗胶块。

4）把梳子平放在胶槽上，把胶块加在梳子齿上。如果用的是10个齿的梳子，把标准菌株H9812加在第1、5、10个齿上，若为15个齿的梳子则放在第1、5、10、15个齿上。

5）把梳子放入胶槽，确保所有的胶块在一条线上，并且胶块与胶槽的底面相接触。从胶槽的下部中央缓慢到入100ml熔化的在53℃～56℃平衡的1％SKG。避免气泡的生成；如果有，用枪头消除。在室温下凝固30分钟左右。

8.电泳：设置电泳参数。大、小胶均用此参数。

Initial switch time = 4.0 seconds

Final switch time = 40.0 seconds

14cm宽×13cm长的胶电泳时间为19小时

启动“Start Run”

第三天

9.图像的获取

1）取出胶，放在盛放400ml EB溶液的托盘内（EB储存液浓度为10mg/ml，1：