典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 9 期
染色体上，构建了能同时降解六六六和甲基对硫磷 的工程菌 BHC-A-mpd。BHC-A-mpd 表达出有活性 的底物广谱性有机磷水解酶，能降解多种有机磷农 药； 在遗传稳定性方面也优于以质粒为载体构建的 基因工程菌，且生长特性与原始菌株没有差别。但 工程菌 BHC-A-mpd 是否存在安全性问题，需要进一 步研 究。 Wu 等［18］ 用 PCR 从 一 株 六 六 六 降 解 菌 BHC-A 扩增出完整的氯化氢酶基因 lin A，克隆到含 有 mini-Tn5 的 自 杀 性 质 粒 Put4K 上，通 过 三 亲 接 合，将脱氯化氢酶基因 lin A 整合到一株高效降解多 菌灵菌株 Rhodococcus sp． DJL-6 的染色体 DNA 上， 得到了同时降解多菌灵和六六六的工程菌株 DJL6A。该工程菌的 lin A 基因可以持续稳定遗传。可 见转座子介导同源重组法在解决遗传稳定性方面具 有良好的表现，但工程菌的安全性和是否能保持遗 传稳定性，还需要进一步研究。 1. 3 表面活性剂类污染物降解的基因工程菌的构
2011 年第 9 期
关向杰等： 典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
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由于单一石油类高效降解菌应用的局限性等原因， 研究者利用生物技术构建石油类污染物工程菌及其 应用，并取得了一系列成果。
早在 20 世纪 70 年代，Chakrabayty［6］在同一菌 株中植入降解乙烷、辛烷和癸烷，降解二甲苯，降解 萘和分解樟脑的 4 种假单胞菌的不同质粒，由此得 到的工程菌具有超常规的能力，能够同时降解脂肪 烃、芳烃、萜和多环芳烃，且降解石油的速度快、效率 高，在几个小时内能降解完海上溢油中 2 /3 的烃类， 而自然菌种则需要用一年多的时间，但质粒容易丢 失或转移，遗传稳定性差。李尔炀等［7］采用染色体 DNA 转化原生质球的方法，构建了一株处理含 PTA 废水的工程菌 LEY3 。该菌能同时降解 PTA、萘、苯 甲酸、十六兢、乙二醇和甲醇 6 种化合物。用该菌对 含 PTA 生 产 废 水 作 降 解 试 验，COD 的 去 除 率 达 66% － 91% 。但供体基因进入细胞后随机整合到受 体染色体上，导致各供体基因所获启动子活性不同， 由此造成各基因之间表达强度不同，宏观上表现为 对 6 种化合物降解率不同。宋绍富等［8］采用原生质 体融 合 技 术，将 一 种 耐 高 温 （ 72℃ ） 、耐 盐 （ 30% NaCl） 、耐酸碱（ pH5 － 9. 4） ，并可利用原油为碳源代 谢生物表面活性剂的芽孢杆菌属菌Ⅰ和另一种为可 在 30℃ 利用糖蜜代谢水不溶性多糖聚合物的肠内 杆菌属菌 JD 融合，后将得到的融合子进行多次传代 培养优选，最终获得了 9 株遗传性状稳定和代谢多 糖性能优异的融合菌。但受融合子的耐酸性能改进 不大的影响，与 JD 亲本菌比较接近，只能在 pH 为 6 － 10 的环境中产生多糖。李焕杰等［9］通过构建血 红蛋白基因表达质粒并电击导入德氏假单胞菌中， 得到基因工程菌。该菌与原始菌相比，生长速率较 高且最大脱硫活性提高了 214 倍。但 在 实 际 的 柴 油脱硫试验中，工程菌的脱硫率为 69. 19 % ，而原 始菌为 57. 12 % ，两者相差 不 明 显。 宋 永 亭［10］将 烷烃 单 加 氧 酶 基 因 slad A 克 隆 到 质 粒 pSTE33 上，并将重组质粒通 过 电 击 转 化 导 入 嗜 热 脱 氮 土 壤芽孢杆 菌 中，得 到 了 基 因 工 程 菌 SL-21 。该 工 程 菌 具 有 嗜 热 功 能，并 且 对 原 油 降 解 效 果 明 显。 但烷烃单 加 氧 酶 基 因 slad A 在 不 同 的 基 因 工 程 菌株中表达的效率 不 同，且 质 粒 的 遗 传 稳 定 性 有 待进一步研究。
建及应用 表面活性剂作为能改变（ 通常降低） 水和其他 液体表面张力或两相间界面张力的物质，具有润湿、 分散、乳化、增溶、起泡、洗涤、防腐和杀菌等作用，广 泛地用于纺织、造纸、皮革、毛皮、医药、染料、环保、 化妆品、消防和农业等方面［19］。表面活性剂按极性 基团的解离性质分为阴离子表面活性剂、阳离子表 面活性剂、两 性 离 子 表 面 活 性 剂、非 离 子 表 面 活 性 剂。然而，表面活性剂在造福人类的同时，也带来了 系列的环境污染问题。如使水中溶氧量明显降低、 水质恶化； 通过食物链进入人体，造成疾病； 对有害 物形成增溶、乳化、分散作用； 富集有机污染物，抑制 微生物对有机物的降解，增强其对环境的危害等问 题［20］。随着人们对环境保护的重视，表面活性剂污 染的修复也越来越引起研究者们的兴趣。与物理化 学修复相比，微生物修复对人和环境造成的影响小， 是一种高效、经济和环境友好的清洁技术。所以筛 选对表面活性剂具有高效降解能力的菌株用于修复 表面活性剂对环境的污染具有重要的理论意义与应 用价值［21］。 国内外研究者们已经大量报道了从不同的污染 环境中筛选到降解不同种类表面活性剂的降解菌， 并对它们的生理生化、影响因素及降解特性方面进
·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 9 期
典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
关向杰 杨海君 盛博文 黄水娥
（ 湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙 410128）
摘 要： 随着人类活动的增加，对有机物和重金属的应用越来越广泛，同时造成的环境污染程度越来越严重。综述了 石油、农药、表面活性剂及重金属类污染物治理中基因工程菌的构建及应用的研究进展，指出利用基因工程菌解决环境中的 石油、农药、表面活性剂及重金属的污染问题已成为环境污染修复领域的研究热点，并提出基因工程菌的构建及应用过程中 的难点及发展趋势。
1. 2 农药 类 污 染 物 的 降 解 基 因 工 程 菌 的 构 建 及
应用 农药是一类有毒化学物质，在生产、贮存、运输 和使用过程中都可能发生环境污染问题，不仅造成 生态环境的破坏，而且危害人类的健康。因此农药 污染已成为全世界关注的环境问题之一［11］。 目前世界上可用作农 药 的 化 学 物 质 有 千 余 种，制剂数 万 个。我 国 生 产 的 农 药 主 要 有 无 机 类 农 药 、有 机 氯 农 药 、有 机 磷 、氨 基 甲 酸 酯 、有 机 氮 类 杀虫剂以及 磺 酸 脲 类 除 草 剂，并 在 实 践 中 大 量 使 用 了 这 些 农 药［12］。 上 述 农 药 有 些 随 着 时 间 的 推 移 被 自 然 降 解 ，而 有 些 长 期 存 在 环 境 中 ，并 且 对 生 物 界产生不 利 影 响。因 此，处 理 这 些 残 留 的 有 机 农 药成为了人们关注的热点。有机农药的结构复杂 和降解这些 农 药 的 代 谢 途 径 差 异 性 大，导 致 了 单 一微生物种群降解效率不高。所以构建高效降解 多种农药的多功能工程菌则成为目前研究的前沿 和热点［13］。 Song 等［14］分离到一株以 1，2，4-三氯苯为唯一 碳源的施氏假单胞菌 THSL-1，并将施氏假单胞菌 THSL-1 的质粒，用 Ca2 + 诱导大肠杆菌转化法，转化 到 E． coli JM109 中，得到转化子能以 1，2，4-三氯苯 为唯一碳源生长，且对 1，2，4-三氯苯有降解作用，但 有待进一步检验 质 粒 遗 传 的 稳 定 性。 张 丽 青 等［15］ 将抗性库蚊解毒酶酯酶 B1 基因片段引入融合表达 载体 pThioHisA 中，转化入大肠杆菌 DH5α，并获得 了酯酶 B1 在大肠杆菌的融合高效表达，占菌体总 蛋白的 48. 7% ，并具有较高的酯酶 B1 活性，能高效 降解酯酶的特异性底物 β-乙酸萘酯（ β-NA） ，并能 快速降解有机磷类农药，但也未对该工程菌遗传稳 定性进行研 究。 彭 冉 等［16］ 采 用 质 粒 消 除 技 术 对 铅 抗性菌和高效酚降解菌的抗铅降酚基因进行定位， 提取高效酚降解菌降解质粒，并将其转化到铅抗性 菌中进行遗传重组，得到了抗铅降酚工程菌。该工 程菌对铅具有较强抗性并具有强降解苯酚功能，使 得对酚的降解率达 95% 以上。与原降酚菌株相比， 工程菌存在较长的延滞期，且工程菌的质粒稳定性 较差，随着转接次数增加，降解苯酚能力明显下降。 陆鹏等［17］通过转座子介导同源重组法，将甲基对硫 磷水解酶基因 mpd 导入到六六六降解菌 BHC-A 的
Key words： Genetic engineering bacteria Oil Pesticide Surfactants Heavy metal Micro-biological remediation
随着农业、工业的不断发展，化工、印染、采矿等 带来的三废超标排放，以及农用化学品的过度使用 造成了严重的环境污染，特别是重金属污染越来越 严重。传统生物处理污染物的方法大多以自然生长 的微生物群体驯化，繁殖利用为主。但由于微生物 混合培养在处理污染物的过程中，因其代谢过程复 杂，能量利用不经济，使得污染物的修复效率不佳， 而且大多混合培养的微生物之间的相互关系和作用 机制的研究还不完全清楚等问题，制约着混合微生 物的广泛应用。由此，为克服上述不足和提高污染 物的处理效果，许多研究者开始了基因工程菌的构 建及其应用方面的研究［1］。
（ College of Bio-safty Science ＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）
Abstract： As the human activities increasing，organic matter and heavy metal used widely caused the environmental pollution more and more serious． This article summarized the construction of genetic engineering bacteria and its applications in oil pollution， pesticide pollution，heavy metal pollution and surfactant pollution bioremediation，which has proved to be a hot pot in environmental pollutants bioremediation researching． It also put forward the difficulties in the construction and application of genetic bacteria and developing trend．
1 基因工程菌的构建及应用
1. 1 石油类污染物降解基因工程菌的构建及应用 石油是一种成分十分复杂的混合物，由上千种
有机化合物组成，其中一些有毒的化学物质具有致 癌、致畸和致突变的潜在性。其在开采、炼制、运输 和使用过程中，不可避免地会抛洒或泄漏于海洋、河 流和土壤，由此也造成了石油对土壤、河流和海洋的 严重危害［2］。为此，许多学者利用多种方法开展了 石油类污染物的治理研究［3 － 5］，比如化学方法、物理 方法、生物方法以及物理与化学结合法等。生物方 法中的微生物法因其费用低、作用迅速、效果好、无 二次污染等特点，成为石油类污染治理研究的热点。
收稿日期： 2011-04-01 基金项目： 湖南省自然科学基金项目（ 09JJ4016） ，湖南省环境保护厅重点项目（ 湘财建指［2009］364） 作者简介： 关向杰，男，硕士研究生，研究方向： 环境微生物学； E-mail： chongda2010@ 126． com 通讯作者： 杨海君，男，博士，副教授，硕士生导师，E-mail： yanghaijun352@ yahoo． com． cn
关键词： 基因工程菌 石油 农药 表面活性剂 重金属 微生物修复
Construction and Application of Genetic Engineering Bacteria in Typical Environmental Pollutants Bioremediation
Guan Xiangjie Yang Haijun Sheng Bowen Huang Shuie
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生物技术通报 Biotechnology Bulletin
2011 年第 9 期
染色体上，构建了能同时降解六六六和甲基对硫磷 的工程菌 BHC-A-mpd。BHC-A-mpd 表达出有活性 的底物广谱性有机磷水解酶，能降解多种有机磷农 药； 在遗传稳定性方面也优于以质粒为载体构建的 基因工程菌，且生长特性与原始菌株没有差别。但 工程菌 BHC-A-mpd 是否存在安全性问题，需要进一 步研 究。 Wu 等［18］ 用 PCR 从 一 株 六 六 六 降 解 菌 BHC-A 扩增出完整的氯化氢酶基因 lin A，克隆到含 有 mini-Tn5 的 自 杀 性 质 粒 Put4K 上，通 过 三 亲 接 合，将脱氯化氢酶基因 lin A 整合到一株高效降解多 菌灵菌株 Rhodococcus sp． DJL-6 的染色体 DNA 上， 得到了同时降解多菌灵和六六六的工程菌株 DJL6A。该工程菌的 lin A 基因可以持续稳定遗传。可 见转座子介导同源重组法在解决遗传稳定性方面具 有良好的表现，但工程菌的安全性和是否能保持遗 传稳定性，还需要进一步研究。 1. 3 表面活性剂类污染物降解的基因工程菌的构
2011 年第 9 期
关向杰等： 典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
11
由于单一石油类高效降解菌应用的局限性等原因， 研究者利用生物技术构建石油类污染物工程菌及其 应用，并取得了一系列成果。
早在 20 世纪 70 年代，Chakrabayty［6］在同一菌 株中植入降解乙烷、辛烷和癸烷，降解二甲苯，降解 萘和分解樟脑的 4 种假单胞菌的不同质粒，由此得 到的工程菌具有超常规的能力，能够同时降解脂肪 烃、芳烃、萜和多环芳烃，且降解石油的速度快、效率 高，在几个小时内能降解完海上溢油中 2 /3 的烃类， 而自然菌种则需要用一年多的时间，但质粒容易丢 失或转移，遗传稳定性差。李尔炀等［7］采用染色体 DNA 转化原生质球的方法，构建了一株处理含 PTA 废水的工程菌 LEY3 。该菌能同时降解 PTA、萘、苯 甲酸、十六兢、乙二醇和甲醇 6 种化合物。用该菌对 含 PTA 生 产 废 水 作 降 解 试 验，COD 的 去 除 率 达 66% － 91% 。但供体基因进入细胞后随机整合到受 体染色体上，导致各供体基因所获启动子活性不同， 由此造成各基因之间表达强度不同，宏观上表现为 对 6 种化合物降解率不同。宋绍富等［8］采用原生质 体融 合 技 术，将 一 种 耐 高 温 （ 72℃ ） 、耐 盐 （ 30% NaCl） 、耐酸碱（ pH5 － 9. 4） ，并可利用原油为碳源代 谢生物表面活性剂的芽孢杆菌属菌Ⅰ和另一种为可 在 30℃ 利用糖蜜代谢水不溶性多糖聚合物的肠内 杆菌属菌 JD 融合，后将得到的融合子进行多次传代 培养优选，最终获得了 9 株遗传性状稳定和代谢多 糖性能优异的融合菌。但受融合子的耐酸性能改进 不大的影响，与 JD 亲本菌比较接近，只能在 pH 为 6 － 10 的环境中产生多糖。李焕杰等［9］通过构建血 红蛋白基因表达质粒并电击导入德氏假单胞菌中， 得到基因工程菌。该菌与原始菌相比，生长速率较 高且最大脱硫活性提高了 214 倍。但 在 实 际 的 柴 油脱硫试验中，工程菌的脱硫率为 69. 19 % ，而原 始菌为 57. 12 % ，两者相差 不 明 显。 宋 永 亭［10］将 烷烃 单 加 氧 酶 基 因 slad A 克 隆 到 质 粒 pSTE33 上，并将重组质粒通 过 电 击 转 化 导 入 嗜 热 脱 氮 土 壤芽孢杆 菌 中，得 到 了 基 因 工 程 菌 SL-21 。该 工 程 菌 具 有 嗜 热 功 能，并 且 对 原 油 降 解 效 果 明 显。 但烷烃单 加 氧 酶 基 因 slad A 在 不 同 的 基 因 工 程 菌株中表达的效率 不 同，且 质 粒 的 遗 传 稳 定 性 有 待进一步研究。
建及应用 表面活性剂作为能改变（ 通常降低） 水和其他 液体表面张力或两相间界面张力的物质，具有润湿、 分散、乳化、增溶、起泡、洗涤、防腐和杀菌等作用，广 泛地用于纺织、造纸、皮革、毛皮、医药、染料、环保、 化妆品、消防和农业等方面［19］。表面活性剂按极性 基团的解离性质分为阴离子表面活性剂、阳离子表 面活性剂、两 性 离 子 表 面 活 性 剂、非 离 子 表 面 活 性 剂。然而，表面活性剂在造福人类的同时，也带来了 系列的环境污染问题。如使水中溶氧量明显降低、 水质恶化； 通过食物链进入人体，造成疾病； 对有害 物形成增溶、乳化、分散作用； 富集有机污染物，抑制 微生物对有机物的降解，增强其对环境的危害等问 题［20］。随着人们对环境保护的重视，表面活性剂污 染的修复也越来越引起研究者们的兴趣。与物理化 学修复相比，微生物修复对人和环境造成的影响小， 是一种高效、经济和环境友好的清洁技术。所以筛 选对表面活性剂具有高效降解能力的菌株用于修复 表面活性剂对环境的污染具有重要的理论意义与应 用价值［21］。 国内外研究者们已经大量报道了从不同的污染 环境中筛选到降解不同种类表面活性剂的降解菌， 并对它们的生理生化、影响因素及降解特性方面进
·综述与专论·
生物技术通报
BIOTECHNOLOGY BULLETIN
2011 年第 9 期
典型环境污染物修复基因工程菌的构建及应用
关向杰 杨海君 盛博文 黄水娥
（ 湖南农业大学生物安全科学技术学院，长沙 410128）
摘 要： 随着人类活动的增加，对有机物和重金属的应用越来越广泛，同时造成的环境污染程度越来越严重。综述了 石油、农药、表面活性剂及重金属类污染物治理中基因工程菌的构建及应用的研究进展，指出利用基因工程菌解决环境中的 石油、农药、表面活性剂及重金属的污染问题已成为环境污染修复领域的研究热点，并提出基因工程菌的构建及应用过程中 的难点及发展趋势。
1. 2 农药 类 污 染 物 的 降 解 基 因 工 程 菌 的 构 建 及
应用 农药是一类有毒化学物质，在生产、贮存、运输 和使用过程中都可能发生环境污染问题，不仅造成 生态环境的破坏，而且危害人类的健康。因此农药 污染已成为全世界关注的环境问题之一［11］。 目前世界上可用作农 药 的 化 学 物 质 有 千 余 种，制剂数 万 个。我 国 生 产 的 农 药 主 要 有 无 机 类 农 药 、有 机 氯 农 药 、有 机 磷 、氨 基 甲 酸 酯 、有 机 氮 类 杀虫剂以及 磺 酸 脲 类 除 草 剂，并 在 实 践 中 大 量 使 用 了 这 些 农 药［12］。 上 述 农 药 有 些 随 着 时 间 的 推 移 被 自 然 降 解 ，而 有 些 长 期 存 在 环 境 中 ，并 且 对 生 物 界产生不 利 影 响。因 此，处 理 这 些 残 留 的 有 机 农 药成为了人们关注的热点。有机农药的结构复杂 和降解这些 农 药 的 代 谢 途 径 差 异 性 大，导 致 了 单 一微生物种群降解效率不高。所以构建高效降解 多种农药的多功能工程菌则成为目前研究的前沿 和热点［13］。 Song 等［14］分离到一株以 1，2，4-三氯苯为唯一 碳源的施氏假单胞菌 THSL-1，并将施氏假单胞菌 THSL-1 的质粒，用 Ca2 + 诱导大肠杆菌转化法，转化 到 E． coli JM109 中，得到转化子能以 1，2，4-三氯苯 为唯一碳源生长，且对 1，2，4-三氯苯有降解作用，但 有待进一步检验 质 粒 遗 传 的 稳 定 性。 张 丽 青 等［15］ 将抗性库蚊解毒酶酯酶 B1 基因片段引入融合表达 载体 pThioHisA 中，转化入大肠杆菌 DH5α，并获得 了酯酶 B1 在大肠杆菌的融合高效表达，占菌体总 蛋白的 48. 7% ，并具有较高的酯酶 B1 活性，能高效 降解酯酶的特异性底物 β-乙酸萘酯（ β-NA） ，并能 快速降解有机磷类农药，但也未对该工程菌遗传稳 定性进行研 究。 彭 冉 等［16］ 采 用 质 粒 消 除 技 术 对 铅 抗性菌和高效酚降解菌的抗铅降酚基因进行定位， 提取高效酚降解菌降解质粒，并将其转化到铅抗性 菌中进行遗传重组，得到了抗铅降酚工程菌。该工 程菌对铅具有较强抗性并具有强降解苯酚功能，使 得对酚的降解率达 95% 以上。与原降酚菌株相比， 工程菌存在较长的延滞期，且工程菌的质粒稳定性 较差，随着转接次数增加，降解苯酚能力明显下降。 陆鹏等［17］通过转座子介导同源重组法，将甲基对硫 磷水解酶基因 mpd 导入到六六六降解菌 BHC-A 的
Key words： Genetic engineering bacteria Oil Pesticide Surfactants Heavy metal Micro-biological remediation
随着农业、工业的不断发展，化工、印染、采矿等 带来的三废超标排放，以及农用化学品的过度使用 造成了严重的环境污染，特别是重金属污染越来越 严重。传统生物处理污染物的方法大多以自然生长 的微生物群体驯化，繁殖利用为主。但由于微生物 混合培养在处理污染物的过程中，因其代谢过程复 杂，能量利用不经济，使得污染物的修复效率不佳， 而且大多混合培养的微生物之间的相互关系和作用 机制的研究还不完全清楚等问题，制约着混合微生 物的广泛应用。由此，为克服上述不足和提高污染 物的处理效果，许多研究者开始了基因工程菌的构 建及其应用方面的研究［1］。
（ College of Bio-safty Science ＆ Technology，Hunan Agricultural University，Changsha 410128）
Abstract： As the human activities increasing，organic matter and heavy metal used widely caused the environmental pollution more and more serious． This article summarized the construction of genetic engineering bacteria and its applications in oil pollution， pesticide pollution，heavy metal pollution and surfactant pollution bioremediation，which has proved to be a hot pot in environmental pollutants bioremediation researching． It also put forward the difficulties in the construction and application of genetic bacteria and developing trend．
1 基因工程菌的构建及应用
1. 1 石油类污染物降解基因工程菌的构建及应用 石油是一种成分十分复杂的混合物，由上千种
有机化合物组成，其中一些有毒的化学物质具有致 癌、致畸和致突变的潜在性。其在开采、炼制、运输 和使用过程中，不可避免地会抛洒或泄漏于海洋、河 流和土壤，由此也造成了石油对土壤、河流和海洋的 严重危害［2］。为此，许多学者利用多种方法开展了 石油类污染物的治理研究［3 － 5］，比如化学方法、物理 方法、生物方法以及物理与化学结合法等。生物方 法中的微生物法因其费用低、作用迅速、效果好、无 二次污染等特点，成为石油类污染治理研究的热点。
收稿日期： 2011-04-01 基金项目： 湖南省自然科学基金项目（ 09JJ4016） ，湖南省环境保护厅重点项目（ 湘财建指［2009］364） 作者简介： 关向杰，男，硕士研究生，研究方向： 环境微生物学； E-mail： chongda2010@ 126． com 通讯作者： 杨海君，男，博士，副教授，硕士生导师，E-mail： yanghaijun352@ yahoo． com． cn
关键词： 基因工程菌 石油 农药 表面活性剂 重金属 微生物修复
Construction and Application of Genetic Engineering Bacteria in Typical Environmental Pollutants Bioremediation
Guan Xiangjie Yang Haijun Sheng Bowen Huang Shuie