组织酪氨酸酶(tyrosinase)活性比色法定量检测试剂盒产品

组织酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂盒产品说明书（中文版）

主要用途

组织酪氨酸酶（tyrosinase）活性比色法定量检测试剂是一种旨在通过酪氨酸酶反应系统中底物酪氨酸氧化后，产生多巴色素，呈现吸光峰值的变化，即采用比色法来测定组织裂解悬液样品中酶活性的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。其适用于各种人体和动物组织，尤其是皮肤、眼睛和黑色素瘤组织裂解悬液样品中酪氨酸酶的活性检测，以及抑制剂筛选。产品严格无菌，即到即用，操作简捷，性能稳定。

技术背景

酪氨酸酶（tyrosinase；EC1.14.18.1）是一种单酚单加氧酶（monophenol monooxygenase），又称为单酚酶（monophenolase）或单酚二羟基苯丙氨酸：O2氧化还原酶（monophenol dihydroxyphenylalanin：O2 oxidoreductase），具有双功能的含铜糖蛋白，广泛存在于植物、酵母和动物组织中，其蛋白结构、大小、糖基化方式、激活特征等都不同。人体酪氨酸酶是一个跨膜蛋白，而催化结构域在黑色素细胞（melanocyte）或色素细胞的黑色素器（melanosome）里。酪氨酸酶通过催化L-酪氨酸（L-tyrosine）等的o-羟基化

（o-hydroxylation）反应变成L-多巴（L-dopamine），进而氧化产生黑色素底物多巴醌（dopaquinone），从而由多巴色素（dopachrome）转化为黑色素（melanin）中的真黑素（eumelanin），以及其它色素，包括毛发和眼睛色素。紫外线可以激活酪氨酸酶活性，严重时，会引起色素沉着（hyperpigmentation）。酪氨酸酶基因突变将导致I型眼皮肤白化病（oculocutaneous albinism）。酪氨酸酶抑制剂成为增白化妆品的重要元素。基于底物酪氨酸，在酪氨酸酶的催化下，产生多巴色素，通过其吸光值的变化（475nm波长），来定量测定酪氨酸酶的活性。其反应系统为：

产品内容

清理液（Reagent A）毫升

裂解液（Reagent B）毫升

缓冲液（Reagent C）毫升

底物液（Reagent D）毫升

阴性液（Reagent E）微升

产品说明书1份

保存方式

保存裂解液（Reagent B）和底物液（Reagent D）在－20℃冰箱里，其余的保存在4℃冰箱里；底物液（Reagent D）避免光照，有效保证6月

用户自备

1.5毫升离心管：用于样品制备和保存的容器

15毫升锥形离心管：用于样品制备的容器

微型台式离心机：用于样品制备

比色皿或96孔板：用于比色的容器

分光光度仪或酶标仪：用于比色分析

实验步骤

实验开始前，将－20℃冰箱里的试剂盒中的试剂置入冰槽里融化。底物液（Reagent D）避免光照。然后进行下列操作。

一、样品准备

1．手术取出动物组织，并秤重以确定500毫克组织重量

2．（选择步骤）放进预冷的15毫升锥形离心管

3．（选择步骤）加入xx毫升清理液（Reagent A）清洗1次

4．移入到一个液氮冻存管

5．即刻放进液氮罐过夜

6．次日从液氮罐里取出，即刻（最快速度）用研磨棒碾碎组织成粉末状（注意：切莫使组织冻融）7．放进一个15毫升锥形离心管

8．加入预冷的xx微升裂解液（Reagent B）

9．转移到预冷的1.5毫升离心管

10．强力涡旋震荡30秒，充分混匀

11．置于冰槽里孵育30分钟，期间每10分钟强力涡旋震荡30秒（注意：如需暂时停止，放进－70℃冰箱里储存备用）

12．放进4℃微型台式离心机离心5分钟，速度为16000g（或13000RPM，例如eppendorf 5415）

13．小心移取500微升上清液到新的预冷的1.5毫升离心管

14．移取10微升进行蛋白定量检测（注意：建议使用Bradford蛋白质浓度定量试剂盒－HL30030.1）15．即刻放进－70℃保存或置于冰槽里继续后续操作

二、测定准备

1.准备好上述待测样品，置于冰槽里

2.设定好分光光度仪（温度为25℃）：波长475nm

3.缓冲液（Reagent C）室温下均衡温度

三、背景对照测定

1．移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2．加入xx微升底物液（Reagent D）

3．针头法充入氧气2分钟

4．加入xx微升阴性液（Reagent E）

5．上下倾倒数次，混匀

6．室温下（25℃）孵育60分钟

7．即刻放进分光光度仪检测，此为背景读数

四、样品测定

1.移取xx微升缓冲液（Reagent C）到新的比色皿

2.加入xx微升底物液（Reagent D）

3.针头法充入氧气2分钟

4.加入50微升待测样品（注意：50微克蛋白总量）

5.上下倾倒数次，混匀

6.室温下（25℃）孵育60分钟

7.即刻放进分光光度仪检测，此为样品读数

五、计算样品活性

六、酶标仪测定

1．在96孔板上做好相应标记：背景对照和样品

2．分别移取xx微升缓冲液（Reagent C）到所有孔里

3．分别加入xx微升底物液（Reagent D）

4．针头法充入氧气2分钟

5．分别加入xx微升阴性液（Reagent E）或待测样品（50微克蛋白总量）

6．轻轻摇动96孔板

7．室温下（25℃）孵育60分钟

8．即刻放进酶标仪检测，获得背景和样品读数

9．活性计算

注意事项

1．本产品为20次（比色皿）和80次（96孔板）操作，包括背景对照

2．操作时，须戴手套

3．系统操作过程中，背景测定只需1次

4．测定值由低到高变化；测定持续60分钟

5．比色测定后，比色皿须清洗彻底

6．样本读数高于背景读数表明具有酶活性

7．建议待测样本蛋白浓度为50微克/50微升；如果样本酶活性过低或过高，则可以增加或降低样本量（本公司提供Bradford蛋白质浓度定量试剂盒HL30030.1）

8．如果待测样品浓度过高或过低，可以调整样品浓度

9．可以使用酪氨酸酶抑制剂曲酸（Kojic acid）作为抑制剂对照或阴性对照

10．酪氨酸酶单位活性定义为：在25℃，pH 6.8条件下，每分钟内能够氧化产生1 微摩尔多巴色素所需的