酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用

品做2孔平行，并记录标准孔和样本孔所在的位置。
5、加标准品/样本：加入标准品/样本20ml 到对应的微孔中，加
入酶标二抗50ml/孔，再加入抗体工作液80ml/孔，轻轻振荡
混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中反应40min。 6、洗板：小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，用洗涤工作液 250ml/孔，充分洗涤4－5次，每次间隔10s，用吸水纸拍干。 7、显色：加入底物液A液50ml/孔，再加底物液B液50ml/孔，
试验原理
• 采用间接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预
包被偶联抗原，样本中残留的卡那霉素将和微孔
条上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体，加
入酶标二抗后，用TMB底物显色，样本吸光值与
残留物卡那霉素的含量成负相关，与标准曲线比
较再乘以其对应的稀释倍数，即可得出样品中卡
那霉素的含量。
操作步骤
1、将所需试剂从冷藏环境中取出，置于室温(20-25℃)平衡 30min以上，注意每种液体试剂使用前均须摇匀。 2、取出需要数量的微孔板，将不用的微孔板放入自封袋，保存 于2-8℃。 3、洗涤工作液在使用前也需回温。 4、编号：将样本和标准品对应微孔按序编号，每个样本和标准
二、宿主蛋白（HCP）残留检测
Cygnus F550 CHO HCP ELISA Kit
宿主细胞蛋白污染物
• CHO宿主蛋白残留
•
•
E-coli宿主蛋白残留
酵母菌宿主蛋白残留
•
HEK293宿主蛋白残留
评估HCP定量用多克隆抗体的特异性
• 2D分离CHO、酵母、大肠杆菌等细胞系的全蛋白谱 • 将2D Gel上的全蛋白转移至膜上，用多克隆抗体孵育 后进行Western Blot化学发光检测，以确认多克隆抗 体能够与哪些宿主细胞蛋白结合
胰岛素依赖性糖原合成，降低餐后血糖浓度。
报告基因检测原理
Ca2
+
Calcineurin
PKA
NFAT
NFAT-P
试验原理
• 采用直接竞争ELISA方法，在酶标板微孔条上预包被cAMP 特异性抗体，样品中cAMP将和标准HRP-cAMP竞争结合 微孔条上cAMP特异性抗体，用TMB底物显色，吸光值与 样品中cAMP的含量成负相关。
，4°C孵育过夜； • TACTS（0.02M Tris- HCl, PH 7.5，0.15M NaCl，1mM
CaCl2,0.02% NaN3,0.05% Tween 20）冲洗一次，每孔200μl，3min
；用含1% BSA 的TACTS 在37°C封闭1h（200 μl/well）,TACTS 洗三次； • 整合素αIIbβ3（20 μg/ml、50 μL/well）加一定浓度的待测样品50 μl 作为样品组；加孵育液做阴性对照组；37°C下孵育2h； • TACTS 洗三次；加一抗（鼠抗人CD61抗体，含0.5%BSA ,TACTS 稀释，1:2000(体积比)，100μL /孔）37°C下孵育1h；
，在405nm测得OD值，OD值与GPIIb/IIIa受体量成正比
。如果样品与GPIIb/IIIa 受体结合，就会降低纤维蛋白原 与受体的结合，导致所测的OD值降低。
• 实验步骤：
• 首先将纤维蛋白原（10 μg/ml）用buffer A（0.1 M Na2CO3, PH 9.5
）包被于96孔板上（100 μl/well）（空白对照: 不包被纤维蛋白原）
率代入标准曲线中，从标准曲线上读出样本所对应的浓度，乘以
其对应的稀释倍数即为样本中卡那霉素实际残留量。
卡那霉素测定方法验证
• 检测方法和标准曲线
竞争ELISA法测定药盒卡那霉素标准品
卡那霉素在样品溶液中的回收率
卡那霉素在样品稀释液中的回收率(n=6)
试验浓度
(ppb) 20.0 97.55 95.79 88.52 95.11 82.90 89.67 98.71 88.29 89.41
• 数据处理
• 通过以下公式计算抑制率：[(X−Y)/(X-Z)]×100%。X代表
生理盐水组OD值；Y代表样品组OD值；Z代表空白对照组 OD值。实验结果都用均数±标准差（ ±s）表示，采用t
检验进行单因素方差分析。p<0.05界定为具有统计学意义
，所有数据处理均使用GraphPad Prism 6软件 (GraphPad Software，美国)。
7. buffer B（底物缓冲液）：定容100ml，PH 9.5, 二乙醇胺 ：105μl；MgCl2：10.175mg 8. PNPP对光敏感，现配现用，用buffer B溶解 9. 配制的纤维蛋白原浓度越高储存越稳定，37℃水浴锅加热
包被液溶解，储存Fg>1mg/ml时较稳定。
三、卡那霉素残留检测
卡那霉素检测试剂盒
• 2015年版药典凡例十六：（3）生产过程中，应尽可 能避免使用抗生素，必须使用时，应选择安全性风险 相对较低抗生素，使用抗生素种类不得超过1种，且 产品后继工艺应保证可有效去除制品中抗生素，去除 工艺应该验证。 • （4）生产过程中使用抗生素时，成品鉴定中应检测 抗生素残留量，并规定残留量限制。上述的生产过程 包括种子培养活化，发酵，纯化等所有的步骤，所以 种子活化阶段是算在生产过程中的。
。
• GLP-1结合GLP-1R后，激活细胞膜内环腺苷酸(cAMP)和丝裂原 激活蛋白激酶(MAPK)通路 • 胰岛成熟β细胞的GLP-1受体偶联Gs，活化腺苷酰环化酶，产 生cAMP，后者与葡萄糖协同刺激胰岛素合成和分泌，刺激胰 岛素基因转录和胰岛素原生物合成，可降低胰高血糖素浓度 并抑制胰高血糖素分泌，增强细胞对胰岛素的敏感性，刺激
量的浓度。四参数方程中的C值即相当于半效量的浓度(EC50)。
典型的测定结果及回归曲线
Graph#1
35000
25000
15000
5000 0.1 1 10 x axis y = ( (A - D)/(1 + (x/C)^B ) ) + D: Plot#1 (STd: Concentration vs MeanValue) Plot#2 (100%: Concentration vs MeanValue) Plot#3 (50%: Concentration vs MeanValue) Plot#4 (150%: Concentration vs MeanValue) A 39559.98 38463.37 38642.45 38171.1 B 1.078 1.31 1.54 1.343 C 16.002 15.564 31.632 12.655 D 6571.405 7742.07 7942.739 7056.677 R^2 0.999 0.999 0.999 0.996 100 1000 10000
GLP-1
GLP-1是已发现的促胰岛素分泌作用最强的肠肽类激素， 它通过与GLP-1受体(GLP-1R)结合发挥作用 1）GLP-1可通过刺激胰岛素分泌、抑制胰高血糖素分泌及胃 排空来降低血糖 2）GLP-1还有减缓β细胞凋亡，促进其再生的独特作用 3）GLP-1还能减慢胃排空速度，通过作用下丘脑，抑制食欲
• TACTS 洗三次；加二抗（碱性磷酸酶标记的山羊抗鼠IgG ，含0.5%BSA ,TACTS稀释，1:1000，100μL /孔）， 37°C下孵育1h； • TACTS洗三次，加底物（对硝基苯磷酸二钠溶液
(PNPP)1mg/ml，用buffer B溶解，200μL/well），37℃
下孵育30min；加入50μL 3M NaOH(称0.6g加5ml蒸馏水) 终止反应；5min内405nm波长下检测吸光度。
轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境中避光反应
15min。 8、测定：加入终止液50ml/孔，轻轻振荡混匀，设定酶标仪于 450nm处（建议用双波长450/630nm检测，在5min内读完数 据），测定每孔OD值。
定量分析
• （1）百分吸光率的计算 标准品或样本的百分吸光率等于标准品或样本的百分吸光
检测步骤：
（1）于每个反应孔中，加入100 μL抗CHO HCP多抗-HRP；
（2）从标准蛋白液、对照和样品中吸取50 μL 上清加入到已标记 好的反应孔中；180rpm下室温、振荡培养2h； （3）弃去孔内溶液，每孔加350 μL 洗涤液，重复洗涤4次； （4） 于每个反应孔中，加入100 μL TMB底物溶液，于室温孵育 30min； （5 ）于每个反应孔中，加入100 μL终止液；依序读取
第四节 酶免疫分析技术在生物药物分析中的应用
其应用主要包括以下几个方面：
• 药物含量（活性）测定
• 宿主蛋白残留检测
• 抗生素残留检测
• 杂质检测 • 污染物检测 • 药物原材料检测 • 药物掺假检测
一、GLP-1活性检测
Cyclic Adenosine Monophosphate (cAMP) ELISA Kit
• 通过Western Blot检测结果（多抗能检测到的HCP数量
）与2D膜上检测结果（总HCP数量）的比较，得出用于
评价检测的多克隆抗体特异性及适用性的Match Rate
试验原理
• 采用双位点酶联免疫检测法，在酶标板微孔条上 预包被抗CHO CHP多抗，免疫反应构成为夹层式 结构：固相抗体-HCP-酶标记抗体。反应结束后 清洗酶标板去除未结合反应物，添加TMB底物显 色，吸光值与样品中CHO宿主蛋白的含量成正相 关。
• 以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归
拟合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度，求得 供试品相对生物活性。
操作程序：
1、取微孔板条，加入cAMP特异性抗体，50ul/孔，室温1 h; 2、洗涤后，向不同孔中分别cAMP、对照或细胞裂解上清品（样
品），100ul/孔；
3、向孔中加入HRP-cAMP，50 ul/孔，室温作ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ2h；
• 溶液配制及注意事项（60 well大概用量） 1. buffer A：0.1M Na2CO3 50ml：取固体0.53g溶液50ml蒸馏水中，调 PH 9.5. 2. TACTS洗脱液（需300ml）：定容100ml，pH 7.5， Tris-HCl： 0.2423g；NaCl：0.8766g；NaN3：200μL；Tween 20:50μL； CaCl2:0.0222g。
OD450/650 nm吸收值(空白对照孔调零)。
（6）数据处理：根据测定每孔标准液吸光值绘制四参数逻辑曲线 ，然后根据样品吸光值计算出样品中HCP浓度。
ELISA法研究药物作用靶点（GPⅡb/Ⅲa受 体）
• 实验原理 • 根据ELISA实验原理，先在96孔板上包被纤维蛋白原，然 后同时加入GPIIb/IIIa受体和待测样品，再加酶标抗体与 GPIIb/IIIa受体结合，最后加入底物，酶作用于底物显色
4、洗涤后，向孔中加入TMB溶液， 200 ul/孔，室温作用30min
； 5、向孔中加入终止液，100 ul/孔，测定OD450nm/570nm
数据与结果
1. 标准曲线的绘制： （1）测定各浓度梯度下各孔对照品和供试品相应的吸光值，并分
别计算平均值；
（2）以吸光值为纵坐标，样品浓度为横坐标，按四参数法回归拟 合对照品和供试品的量效曲线，得出半效量浓度； 对照品EC50；测试样EC50 2. 数据处理： 供试品相对生物活性（%）=对照品EC50/供试品 EC50100% 其中：对照品和供试品的EC50分别表示对照品和测试样的半效
孵育液（50ml）：TACTS加0.5%BSA
封闭液（20ml）：TACTS加1%BSA 3. 受体αⅡbβ3（4ml）：配制1.63mg/ml母液,受体使用的终浓度为
20μg/ml。
4. 一抗（8ml）：1:2000；二抗（8ml）：1:1000 5. 样品配制：不溶的样品加DMSO全溶，终浓度不超0.5% 6. 受体，抗体，样品均用孵育液稀释。
度值的平均值（双孔）除以第一个标准（0标准）的吸光度值，
再乘以100%，即 百分吸光度值（%）＝B/B0×100% B—标准溶液或样本溶液的平均吸光度值 B0—0ppb标准溶液的平均吸光度值
• （2）标准曲线的绘制与计算
以标准品百分吸光率为纵坐标，以卡那霉素标准品浓度（ ppb）的半对数为横坐标，绘制标准曲线图。将样本的百分吸光