毕赤酵母表达系统

毕赤酵母表达系统

前言：

所用表达质粒有pPIC3.5K,pAO815用于胞内表达，而pPIC9K用于分泌表达，所有载体均利用AOX1启动子来诱导高水平表达。

抗性选择：最有效的筛选遗传霉素抗性及高抗性克隆的程序需要先对HIS＋转化子进行选择，再进行不同水平遗传霉素抗性筛选。

毕赤菌株表型：毕赤酵母菌GS115 及KM71 在组氨酸脱氢酶位点（His4）有突变,因而不能合成组氨酸，所有表达质粒都有HIS4 基因可与宿主进行互补，通过不含组氨酸的培养基来选择转化子。GS115 及KM71都可在复合培养基如YPD（YEPD）及含组氨酸的最小培养基中生长。转化之前，GS115 及KM71 都不能在最小培养基中生长，因为它们是His-。

培养温度：毕赤酵母生长温度为28-30度（液体、平板、斜面）。在32 度以上诱导生长时，对蛋白表达有害，甚至会导致细胞死亡。

贮存：贮存细胞几周或几月，用YPD培养基或YPD 琼脂斜面

1 挑取所需菌株单克隆在YPD 平板上划线生长；

2 挑取单克隆转移至YPD进行穿刺培养，30 度

2 天；

3 细胞在

4 度可放几周

几月或几年，存于－80度

1 挑取所需菌株单克隆在YPD 中过夜培养；

2 收集细胞，在含15%甘油的YPD 中悬浮至终

OD600 为50-100（大约2.5-5.0×109细胞/ml）；3 细胞先用液氮或干冰/酒精浴中冰冻再贮存于-80 度。

注意：在4 度或－80 度长期保存后，用之前建议在MM、MD 或MGY 平板上划线培养

以检测His+转化子的表型是否正确及其活力。

以质粒pPIC9K，酵母Pichia pastoris GS115为例说明做法。

载体pPIC9K酶切为点

线性化质粒DNA：建议使用下列方法线性化载体以获得Mut+及Muts重组子，可能其

中一个会比另一个更利于表达多拷贝重组子。如果只想得到Muts重组子，使用KM71 菌株。

单个十字交换事件可比双重十字交换更容易、更有效地获得Muts重组菌（例如：插入AOX1

或his4 而不是取代AOX1）。如果插入片段含有下列任何限制性位点，见p29-30 以替换位点。

1 如果克隆进Ppic3.5k，线性化时，插入AOX1 用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)；插入HIS4 用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)

2 如果克隆进pAO815，线性化时，插入HIS4 用SalI或StuI（GS115, Mut+ 或KM71, Muts）

注意如果用pAO815载体，插入2 个或更多拷贝子会产生SacI酶切位点

3 如果克隆进Ppic9k，线性化时，插入AOX1 用SacI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)，插入HIS

4 用SalI(GS115, Mut+ 或KM71, Muts)。

一．毕赤酵母表达常用溶液及缓冲液的配制

1．1 各种母液的配制

10*YNB(含有硫酸铵、无氨基酸的13.4%酵母基础氮源培养基)4℃保存。34g酵母基础氮源培养基（无硫酸铵）+100g硫酸铵，溶于1000ml水中，过滤除菌。

500*B(0.02%生物素Biotin)4℃保存。20mg的生物素溶于100ml水中，过滤除菌。

100*H(0.4%Histidine组氨酸)4℃保存。400mg的L-组氨酸溶于100ml水中，（加热至50℃以促进溶解），过滤除菌。

10*D(20%Dextrose葡萄糖) 200g葡萄糖溶于1000ml水中，灭菌15min或过滤除菌。

10*M(5%Methanol甲醇)保存期为2个月。将5ml的甲醇与95ml水混匀，过滤除菌。

10*GY(10%Glycerol甘油)。将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。

100*AA(0.5% of each Amino Acid，各种氨基酸)4℃保存。分别将500mg的L-谷氨酸、L-蛋氨酸、L-赖氨酸、L-亮氨酸和L-异亮氨酸溶于100ml水中，过滤除菌。

1M 磷酸钾溶液（potassium phosphate buffer，pH6.0），将1mol/L的K2HPO4溶液132ml与

1mol/L的KH2PO4溶液868ml混匀，其pH为6.0，如需调节pH，则使用磷酸和氢氧化钾调节pH。

1.2 常用溶液及缓冲夜

1.2.1 碱裂解法抽提质粒DNA所用溶液：

溶液Ⅰ：50mmol / L glucose，100mmol / L EDTA，25mmol / L Tris－HCI (pH 8.0)

溶液Ⅱ：0.2mol／L NaOH，1％SDS（临用时配制）

溶液Ⅲ：29.44g KAc，11.5ml Acetic acid，加ddH2O至100 ml。4℃保存。

1.2.2 10% 甘油（Glycerol）：

将100ml甘油和900ml水混匀后，高压灭菌或过滤除菌。保存期为1年以上。

1.2.3 Rnase-H2O：1ul Rnase 加入1ml 灭菌dd H2O。4℃保存。

1.2.4 TE缓冲液：10mmol / Tris-CI（pH 8．0），lmmol / L EDTA（pH 8.0）

1.2.5 STE缓冲液：0.1mol / L, 10mmol / L Tris-HCl (pH 8.0), 1mmol / L EDTA (pH 8.0)

1.2.6 SCE缓冲液：1mol / L Sorbitol (山梨醇), 10mmol / L 柠檬酸钠，10mmol / L EDTA 1.2.7 1M potassium phosphate buffer （pH 6.0）：132 ml 1M K2HPO4,868 ml 1M KH2PO4.

1.2.8 50X TAE 琼脂糖凝胶电泳缓冲液，pH 8.0（1L）：242 g Tris,57.1 ml Acetic Acid, 37.2 g EDTA

二．毕赤酵母表达的培养基配制［5］

2.1 LB（Luria－Bertani）培养基：Trypton l％,Yeast Extract 0.5％, NaCl l％, PH 7.0

制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存。用于培养pPICZαA 原核宿主菌TOP10F’时可加入Zeocin 25ug /ml。

2.2 LLB（Low Salt LB）培养基：Trypton l％, Yeast Extract 0.5％, NaCl 0.5％, PH 7.0

制作平板时加入2％琼脂粉。121℃高压灭菌20min。可于室温保存数月。用于培养pPICZ αA原核宿主菌TOP10F’时，加入Zeocin 25ug / ml，可以4℃条件下保存1～2周。

2.3 YPD （又称YEPD）Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，(Yeast Extract Peptone Dextrose Medium，酵母浸出粉/胰蛋白胨/右旋葡萄糖培养基):

Trypton 2%, dextrose (glucose) 2% +agar 2%, +Zeocin 100 μg/ml

液体YPD培养基可常温保存；琼脂YPD平板在4℃可保存几个月。加入Zeocin 100ug / ml，成为YPDZ培养基，可以4℃条件下保存1～2周。

2.4 YPDS + Zeocin培养基（Yeast Extract Peptone Dextrose Medium）：

yeast extract 1%, peptone 2%, dextrose (glucose) 2%, sorbitol 1 M+agar 2%+ Zeocin 100 μg/ml

不管是液体YPDS培养基还是YPDS + Zeocin培养基，都必须存放4℃条件下，有效期1～2周。

2.5 MGY: Minimal Glycerol Medium（最小甘油培养基）

（34%YNB；1%甘油；4*10-5%生物素）。将800ml灭菌水、100ml的10*YNB母液、2ml的500*B 母液和100ml的10*GY母液混匀即可，4℃保存，保存期为2个月。

2.6 MGYH: Minimal Glycerol Medium + Histidine （最小甘油培养基+ 0.004%组氨酸）

在1000ml的MGY培养基中加入10ml的100*H母液混匀，4℃保存，保存期为2个月。

2.7 RD: Regeneration Dextrose Medium （葡萄糖再生培养基）

（含有：1mol/L的山梨醇；2%葡萄糖；1.34%YNB；4*10-5%生物素；0.005%氨基酸）

1. 将186g的山梨醇定容至700ml，高压灭菌；

2. 冷却后于45℃水浴；