Fas在DCDs模型鼠神经元凋亡中作用论文

Fas在DCDs模型鼠神经元凋亡中的作用初探

【摘要】目的探讨皮质发育障碍（disorderofcortical developments，dcds）模型鼠海马神经元凋亡可能的细胞转导机制。方法利用卡莫司汀（bcnu）诱导建立sd大鼠皮质发育障碍动物模型，在出生后0天（a0）、15天（a15）、30天（a30）、45天（a45）和60天（a60）时，采用tunel检测海马区神经元凋亡指数，免疫组化法对模型鼠和正常鼠检测海马区fas分子的表达，并结合图像分析系统进行结果分析。结果针对sd大鼠皮质发育障碍的动物模型已成功建立；将其与对照组进行比较，tunel结果：a0模型鼠组，海马区神经元凋亡无明显变化；而a15、a30、a45、a60模型组，其神经元凋亡有统计学差异（p<0.05），显逐步加重趋势。免疫组化检测结果显示：随存活时间延长，模型组海马神经元fas表达逐渐增强，其值较对照组增高，具有显著统计学意义（p<0.05）。结论皮质发育障碍模型鼠海马区存在显著的神经元凋亡，fas可能参与了其凋亡过程中的信号传导。

【关键词】皮质发育障碍；细胞凋亡；fas （apo-1或cd95）所谓皮质发育障碍（缩写dcds）是难治性癫痫发病的主要原因，但诱发机制仍不能确定。多数学者认为神经网络、环路重组是发病原因之一，而神经元凋亡则可能在神经网络、环路重组中起决定性作用[1]。

本实验拟采用卡莫司汀模型，诱导建立sd大鼠皮质发育障碍模型，并通过tunel检测海马区神经元细胞的凋亡情况，免疫组化检

测神经元细胞fas分子的表达，分析皮质发育障碍鼠海马神经元凋亡的可能信号传导机制，为探讨难治性癫痫的发病机制提供思路。

1 材料与方法

1.1 模型制作孕17天的l0只体重约在300g左右的sd大鼠（由川北医学院中心提供）。皮质发育障碍模型组为随机抽取的5只sd 大鼠，在孕17天向sd孕鼠腹腔注射卡莫司汀（15mg/kg，将其用生理盐水稀释至4mg/m1）；给对照组（另外5只sd大鼠）腹腔注射生理盐水，处理后将所有sd大鼠正常喂养。模型组孕鼠共产仔52只、存活46只；对照组孕鼠产仔58只，存活55只。从模型组和正常组各随机抽取40只仔鼠，每个时间点8只，标记为a0、a15、a30、a45、a60[2]。

1.2 子代大鼠的观察在各时间点测量各组仔鼠体重，观察仔鼠的一般行为是否正常、是否有癫痫病发作等。

1.3 制作标本分别在a0、a15、a30、a45和a60各时间点，从对照组和模型组各随机抽取4只子鼠，从腹腔为其注射1%戊巴比妥钠（40mg/kg）将其麻醉。再由主动脉灌注4%多聚甲醛-pb液500ml （0.1mol/l，ph7.4）行内固定，选海马最大切面处制作标本，经过整夜的水洗后，再进行脱水、透明、石蜡包埋处理，制成4mm厚的石蜡切片。

1.4 对海马神经元凋亡的tunel检测制备好标本后，每个标本取邻近的2张切片行tunel染色。参照roche公司试剂盒说明书上注明的方法进行操作。在显微镜下观察细胞核，核内出现可见的棕

黄色凋亡小体就是阳性细胞，选取海马神经细胞分布均匀的视野，在40倍物镜下计数l0个视野，统计凋亡细胞数，将其作为海马神经细胞凋亡指标。

1.5 免疫组化abc法检测fas表达标本制作同上，按常规操作，工作浓度：fas为1：150。试剂一抗（兔抗鼠单克隆fas抗体及检测试剂，按（武汉博士德公司试剂）说明书操作。将免疫组化染色的切片放在nikon-80i显微图像分析系统中，进行分析，阳性细胞其胞质染色呈棕黄色。

1.6 统计学分析采用spss10.0软件进行统计处理。对tunel阳性细胞、fas阳性细胞通过计算机显微图像分析系统进行观察，用χ±s表示各组测定数据（即阳性细胞个数），利用方差进行分析（p<0.05），结果为显著性差异。

2 观察结果

2.1 对子鼠一般行为的观察经观察，5只模型组子鼠体形偏小，并伴有轻度嗜睡，活动量及灵活性均有所降低等。试验过程中自发性癫痫未发作。

2.2 海马神经元凋亡通过光镜观察，tunel染色阳性凋亡神经元的细胞核呈棕黄色，核固缩深染，核内染色质浓聚，染色质在核周围较为浓集，呈长条形、新月形、块状小体、环形甚至形成核碎片，而其神经元体积缩小，呈扇形或三角形。而阴性神经元形态正常，细胞核不显示黄色，容易区分。染色结果表明，在对照组子鼠a0

和a15海马未见tunel阳性细胞，a30、a45和a60有少量tunel标

记细胞。模型组子鼠虽然在a0时海马未见tunel阳性细胞，但在随后的各时点可见tunel阳性细胞，且随鼠龄的增长呈增长趋势。两组相比，除a0外其余各时点，模型组子鼠海马tunel阳性细胞明显增多，因为p<0.05，从统计学分析（见表1）。

2.3 fas分子在皮质发育障碍鼠海马的表达模型组子鼠出生后0天的海马中fas未见表达，这与对照组结果相同；在a15、a30、a45和a60各时间点，模型鼠海马中fas的表达均较对照组增多，较对照组有显著统计学差异（p<0.05），且随存活时间延长fas表达逐渐升高，（见图1）。

3 结果讨论

皮质发育障碍（也称为皮质发育不良、皮质发育畸形、灰质异位征、神经元移位征等），是癫痫病的主要原因，在临床中主要表现为发育迟缓、智力障碍以及多种类型的癫痫发作等。相关资料表明，海马神经元凋亡可能与海马神经元的重组有关，而海马苔藓纤维芽生、海马正常神经环路以及突触重塑等的改变，也是导致药物难治性癫痫发作的重要原因。

细胞凋亡亦称程序性细胞死亡，是一种基因控制的细胞自主性死亡过程。引起凋亡的信号传导系统较为复杂，其中fas是一种极为重要的凋亡信号转导分子。

fas为i型跨膜蛋白、是tnf受体家族的一员。其蛋白结构中至少包含3个与诱导细胞凋亡功能密切相关的结构域，分别为死亡信号激活（exe）、死亡结构域（dd）和调控区（rr）。

fas可通过与胞内dd相互作用的衔接蛋白转导凋亡信号。目前已有多项研究证实fas在缺血再灌注等引起的神经元凋亡中起重要的作用。而其在癫痫所致神经元损伤中的作用国内外研究均较少。

本试验采用晏勇等人建立的bcun大鼠dcds模型，观察模型鼠海马神经元凋亡情况，为了进一步了解海马神经元凋亡的机制，本实验通过免疫组化法检测了神经元细胞中fas的表达情况，发现其存在高表达，在a15天后，数值逐渐升高，可能参与dcds模型鼠中海马神经元凋亡的信号传导。但是关于皮质发育障碍海马神经元凋亡的诱导因素至今仍不清楚，其确切机制还有待进一步深入研究。本试验结果表明在dcds模型鼠海马区存在大量神经元凋亡，其中fas分子可能参与了信号传导。针对该试验结果，可以从理论上提出皮质发育障碍是导致癫痫或难治性癫痫发病的机制，同时为临床治疗皮质发育障碍所致的ie提供了理论基础，开拓了新的治疗观点。

参考文献

[1] cross dj，cavazos je.synaptic reorganization in subiculum and ca3 after early-life status epilepticus in the kainic acid rat model[j].epilepsy res，2007，73（2）：156-165.

[2] benardete e a，kriegstein a r.increased excitability and decreased sensitivity to gaba in all animal model of dysplastic cortex[j].epilepsia，2002，43（9）：970-982.