显微镜观察方法
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(三)相差观察方式
2 特点 鉴定活体细胞最实用、最经济的方法 3 缺点 需要光强高 切片不能太厚(5~10um) 盖片、载片需符合标准 最好配用单色滤光镜 操作较麻烦 荧光效果不如明场物镜 高倍有光晕
(三)相差观察方式
4 应用: 无色透明活体标本的细微结构,检查,鉴定 活体细胞(培养细胞,分离细胞)
霍夫曼
UNIQUE!
Power [mW]
Prometheus EL 6000
UV 334
100,0%
UV Viol4 Blue 365 05 436
Green 546
Yellow 578
90,0% 80,0%
FITC
70,0%
60,0%
50,0%
40,0%
30,0%
20,0%
10,0%
0,0% 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 La mbda [nm]
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Fluorescence Filters
22 July 2008
Matthew Issoukis, Leica Microsystems CMS GmbH
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荧光显微镜的构造
荧光显微镜构造
Leica ---新一代荧光技术
(1) 视场光栏技术
Leica ---新一代荧光技术
(3) 独家可重复荧光光强调节技术
潜伏的影像分开 分离 d 是少於光学系统的 解析度 分离相应为相位移 .
(五)微分干涉观察方法
3 缺点
需要光强高,双折射物质不能达到DIC镜检效果,不能应用于 塑料容器培养物的观察,镜检灵敏度有方向性,调节较复杂
舌
卵细胞
神经细胞
(六)浮雕相衬显微镜
(六)浮雕相衬显微镜
4. 缺点 观察效果与标本方向密切相关 操作较复杂 必须有多元件,结构复杂的高数值孔径RC物
1.明场观察——常规染色片(HE染色等)
2.暗场观察——微粒外观(细菌记数等)
3.相差观察——活细胞标本(细胞培养、 膜片钳等)
4.偏光观察——双折射物质(晶体检测)
5. DIC观察——活细胞等(细胞培养,显 微操作等)
6. IMC观察 ——显微操作
7.荧光观察 ——物质鉴定(抗体、抗原、荧光 原位杂交<FISH>等)
荧光显微镜
Jablonski Diagram
Energy
488nm Stokes-Shift
525nm
• 物质中的电子吸收光的能量由低能状 态转变为高能状态,再回到低能状态 时释放出的光,是非温度辐射光—— 冷光。即:物质吸收短波光, = hν = hc/λ
②10X物镜
聚光镜中心调节
① 标本
④ 聚光镜升降旋钮 ③ 视场光阑
③ 孔径光阑 ⑤ 光轴中心调节螺钉
孔径光栏调节
N.A聚=(0.6-0.8)N.A物
5 steps to decrease the light: •100% • 55% • 30% • 17% • 10%
Unique
9 5 steps to decrease fading
9 5 steps to decrease damaging/stress
•Attenuation is directly assigned to filtercubes
显微镜观察方法
1.明场观察 2.暗场观察(暗视野) 3.相差观察(暗视野) 4.偏光观察 5. DIC观察(微分干涉) 6. IMC观察(浮雕相衬) 7.荧光观察
(一)明场观察方式
常规观察方式 应用领域:
常规镜检、病理、染色标本 优点:
视野亮度高、均匀, 应用范围广, 操作简单,价格低, 物镜适用于荧光观察 缺点: 透明标本对比度低, 标本没有立体感
22 July 2008
Matthew Issoukis, Leica Microsystems CMS GmbH
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Fluorescence Filter Block
Prof. Ploem’s invention
22 July 2008
Matthew Issoukis, Leica Microsystems CMS GmbH
5 调节:
(三)相差观察方式
科勒照明调节 将相差物镜及附件转入光路,对样品聚焦 取下目镜,装上CT望远镜, 调节焦距看到清晰的相差环
调节聚光镜上定位螺丝,使环状光阑象与相 板共轭面重合
振幅物件 光波 相位物件
相差
Phase contrast
amplitude object in brightfield
Absorption
Emission
Ground Energy levels
Prof. Alexander Jablonski, 1935
22 July 2008
Matthew Issoukis, Leica Microsystems CMS GmbH
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Fluorescence
Dichroic spectral position
调节后效果
阶梯光密度镀膜
The NEW Phase Contrast Concept
相差功能可用标准物镜 不需要 PH物镜!! 相衬环在滑块上, 不在物镜里
Integrated Interpupilary Interface for phase contrast. Access to conjugate image plane物镜后出瞳
Spectrum: HBO vs. HXP120
• HXP120 shows more intensity in blue-green range e.g.at 495 nm (FITC excitation)
HBO HXP 120
• Intensity peaks at the same wave lengths
MYcroscopy
(二)暗视野观察方式
1 原理 微粒对斜射光反射或衍射,增大了人眼可见 性。 2 特点 观察到极其微小物体,分辨率可达0.02 ~ 0.004 um (明场0.4um)—”超显微“。 3 缺点 只能观察到物体存在、运动和外部形态 不方便调节 标本要求高(灰尘、盖片、载片)
所有物镜都有简易暗场功能
phase object
in brightfield
phase object
in phasecontrast
聚光镜
• 标准聚光镜 • 聚光镜连枢纽前镜 • 万用聚光镜 • 暗场聚光镜
相差显微镜附件
(五)微分干涉(DIC)观察方法
Wollaston 棱镜
Wollaston 棱镜 原理
干涉对比
– HBO shows slightly more intensity
– Still enough intensity with HXP120
XE versus HXP120
Xe: continuous low intensity spectrum (400800nm)
HXP: high peak intensity spectrum (360-580nm)
镜 观察荧光效果不如明场物镜
5. 应用 所有类型的细胞,组织(无论活体,染色
,未染色),晶体表面细节,透明聚合 物,玻璃和其它类似材料,尤其适用于 显微操作
(六)LeicaIMC浮雕相衬显微镜
独家技术阶梯光密度技术置于物镜以外 保证浮雕相衬技术能与荧光共用物镜 浮雕效果可调节
后焦面阶梯光密度膜
聚光镜附件