生物化学技术

简答题：

1、生物物质制备方案的设计基本原则是什么？

生物物质的制备一般包括初始阶段、中间阶段和精制阶段。在制备方法的选择上，初始阶段宜选择粗放、分辨率低、快速、有利于缩小样品体积和减少后工序的方法，主要考虑样品量和处理速度两个指标；中间阶段选择的方法应在考虑样品处理量的基础上适当提高分辨率。精制阶段宜选择精确、分辨率高、需样品少的方法。

在安排各种分离纯化方法的使用程序时应注意：（1）不适宜连续使用同一种分离纯化方法，应该交叉使用，因为每一步分离后，性质相似的物质聚在一块；（2）使用顺序还要考虑到有利于减少工序、提高效率。

2、综合评价生物物质制备步骤方法的好坏应从哪些方面进行？

每一个制备步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身的回收率和纯化倍数，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。因此综合评价试验方案的优劣应从分辨本领、重现性、回收率和纯化倍数等方面进行。

一个好的制备方法应该使纯化倍数和收得率都同时有较大提高。但在实际过程中，随纯化倍数的提高，收得率是逐渐降低的。因此应该根据材料的来源难易（难——收得率优先考虑，易——纯化倍数优先考虑）和制备物的目的等方面来综合评定方法的优劣。

3、提取组织中的胰岛素时，为什么采用68％乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.5～3.0）为溶剂进行提取。

胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，采用68％乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.5～3.0）进行提取，可以从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：

①68％的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；

②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++；

③选用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。

4、放射自显影技术的基本原理是什么？

其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。

5、兰-爱农法测定糖类的基本原理是什么？

兰-爱农法是指以次甲基蓝作为指示剂，直接将还原糖滴定到斐林试剂中进行测定的方法。斐林试剂中的酒石酸钾钠铜氧化还原糖分子中的游离羰基，本身被还原氧化亚铜红色沉淀。由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1滴还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失而达滴定终点。

6、SDS-PAGE测定蛋白分子量的原理是什么？

由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而主要利用蛋白分子量的差异而将各种蛋白质分开，因此根据未知蛋白和标准系列蛋白的移动距离可测定出未知蛋白的分子量。

7、琼脂糖凝胶电泳缓冲液中一般需要加入适量的EDTA，其目的是什么？

目的是螯合Mg2+ 等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

8、琼脂糖凝胶电泳的电泳缓冲液常用的有哪些？各有何特点？

TAE是使用最广泛的缓冲系统。其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也宜用TAE缓冲系统进行电泳。TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用TBE，并且当用于电泳小于1kb的片段时分离效果更好。TBE用于琼脂糖凝胶时易造成高电渗作用，并且因与琼脂糖相互作用生成非共价结合的四羟基硼酸盐复合物而使DNA片段的回收率降低，所以不宜在回收电泳中使用。

TPE的缓冲能力也较强，但由于磷酸盐易在乙醇沉淀过程中析出，所以也不宜在回收DNA片段的电泳中使用。

9、温度梯度凝胶电泳测定DNA点突变的原理是什么？

一个特定的DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定了其解链区域和解链行为。一个几百个碱基对的DNA 片段一般有几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高达到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链，从而双链DNA 完全解链。不同的双链DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域的解链温度也是不一样的。当它们进行DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使双链DNA 片段最低的解链区域解链，此时DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯酰胺凝胶中一样。然而一旦DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链DNA 片段最低的解链区域解链时，双链DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧降低。因此，同样长度但序列不同的DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度，因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。如果不同DNA 片段的序列差异发生在最高的解链区域时，可在DNA 片段的一端加入一段富含GC 的DNA 片段以防止DNA 片段在胶中完全解链。当加了GC 夹子后，DNA 片段中基本上每个碱基

处的序列差异都能被区分开。

10、试通过与高效液相色谱、普通电泳方法的比较，说明毛细管电泳的特点。

CE和高效液相色谱法(HPLC)相比, 其相同处在于都是高效分离技术, 仪器操作均可自动化, 且二者均有多种不同分离模式。二者之间的差异在于：CE用迁移时间取代HPLC中的保留时间, CE的分析时间通常不超过30min, 比HPLC速度快；对CE而言, 从理论上推得其理论塔板高度和溶质的扩散系数成正比, 对扩散系数小的生物大分子而言, 其柱效就要比HPLC高得多；CE所需样品为nl级, 最低可达270fl, 流动相用量也只需几毫升, 而HPLC所需样品为μl级, 流动相则需几百毫升乃至更多；但CE仅能实现微量制备, 而HPLC可作常量制备。

CE和普通电泳相比, 由于其采用高电场, 因此分离速度要快得多；检测器则除了未能和原子吸收及红外光谱连接以外, 其它类型检测器均已和CE实现了连接检测；一般电泳定量精度差,而CE和HPLC相近；CE操作自动化程度比普通电泳要高得多。

11、Sanger双脱氧链终止法测定DNA序列的原理是什么？

DNA的合成总是从5′端向3′端进行的。DNA的合成需要模板以及相应的引物链。DNA的合成过程中，在合成的DNA链的3′末端，依据碱基配对的原则，通过生成新的3′，5′－磷酸二酯键，使DNA链合成终止，产生短的DNA链。具体测序工作中，平行进行四组反应，每组反应均使用相同的模板，相同的引物以及四种脱氧核苷酸；并在四组反应中各加入适量的四种之一的双脱氧核苷酸，使其随机地接入DNA链中，因为缺少一个形成磷酸二酯键所必需的3'-OH而使DNA链合成终止，产生相应的四组具有特定长度的、不同长短的DNA链。这四组DNA链再经过聚丙烯酸胺凝胶电泳按链的长短分离开，经过放射自显影显示区带，就可以直接读出被测DNA的核苷酸序列。

12、化学降解法测定DNA序列的原理是什么？

化学裂解法的原理是用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。常用的化学试剂及其断裂的碱基位置主要有：（1）硫酸二甲酯使鸟嘌呤G甲基化，再加哌啶在加热的条件下使G 脱落；（2）硫酸二甲酯使鸟嘌呤G甲基化，加甲酸使AG完全分开，再加哌啶使A脱落；（3）用肼和哌啶使T和C断裂；（4）用2mol/L氯化钠加肼，只断裂C。

13、说明蛋白质金标记方法的原理、种类和用途。

原理：借助金粒的电子密度特征，用其与抗体偶联后，可成功地置显微镜下观察胶体金颗粒。

分类：根据金粒子大小，一般分为5 nm、l0 nm和20 nm三种。

用途：5nm粒子容易渗透到细胞膜，使细胞间染色，适用于电子显微镜准确定位抗原。l0nm粒子较大，可使细胞表面染色，适用于光学显微镜观察。20nm粒子可用于免疫印迹和某些细胞和组织化学免疫染色。

14、气固色谱和气液色谱的分离原理是什么？

气固色谱的固定相是多孔性的固体吸附剂颗粒。固体吸附剂对试样中各组分的吸附能力的不同。因此其分离原理即被分离组分在固体吸附剂中的吸附与脱附的不断重复过程。

气液色谱的固定相由担体（用来支持固定液的化学惰性的固体）和固定液（高沸点有机化合物）所组成。固定液对试样中各组分的溶解能力的不同。因此气液色谱分离的原理就是被分离组分在气液两相间的反复多次分配过程。