真菌分离以及培养

一、（越南进境人参果炭疽病病原菌的分离鉴定2009年第3期植物检疫胡佳王卫芳¨）

1.病原菌分离

采用组织分离法，取病果病健交界果皮组织分离培养(马铃薯葡萄糖琼脂培养基[ PDA]，25℃，

1 2 h荧光与1 2 h黑暗循环交替)，病菌纯化后保存备用。

2、病原菌培养特征和形态观测

取病果病部组织进行徒手切片，显微观察分生孢子盘和分生孢子的形态特征；观察病菌的培养特性( P D A，2 5 o C，1 2 h荧l 2 h黑暗循环交替)；观测分离物分生孢子的形态和大小；从培养7 d的菌落中挑取分生孢子团，配制成孢子悬浮液，采用载片悬滴法，观测附着孢的形态及大小。

3、病原菌1 8 S r D N A序列扩增与测定将纯化菌株置于P D A、2 5 o C、1 2 h荧~／1 2 h 黑暗循环交替条件下培养5 d ，挑取菌落边缘新鲜菌丝，采用常规C T A B法提取病原菌基因组D N A作扩增模板，进行P C R扩增。所用引物为真菌1 8 S r D N A通用引物G e o A 2和G e o l 1 【9 J 。反应体系为2 5 总体积，d d H 2 O 1 6 ．3 7 5，1 0倍P C R缓冲液( 含Mg C 1 2 ) 2 ．5 I x L，d N T P( 2 ．5 mm o l ／L) 2 L ，G e M1 ( 1 0 I ~ mo l ／L ) 1 L ，G e o A 2 ( 1 0 l x m o L ／L ) 1 LT a q ( 5 u ／l x L ) 0 ．1 2 5 L，模板 D N A 2 L 。反应程序为9 4 ℃预变性2 m i n ，9 4 o C 4 5 s ，5 5 o C 4 5 s ，7 2 o C2 mi n ，3 0个循环，7 2 ~ C延伸1 0 mi n ，4 ℃保存。P C R产物送上海英骏生物有限公司纯化测序。测序结果与G e n B a n k数据库中的已知序列进行B L A S T比较。

4、致病性测定

选取健康柑橘( C i t r u s r e t i c u l a t a) 、苹果( Ma l u s p u mi l a ) 果实，经7 0 ％酒精表面消毒后晾干备用。从在P D A、2 5 o C、 1 2 h荧光／1 2 h黑暗循环交替条件下培养7 d的菌落上挑取分生孢子团，用无菌水配成分生孢子悬浮液( 1 0 0倍镜下5 0—6 0个孢子) 。用灭菌针刺伤果皮，用无菌滤纸片沾取孢子悬浮液覆盖在针刺部位接种，以无菌水作对照。用保鲜膜分别包裹接种果和对照果，封口，放置经7 0 ％酒精消毒过的塑料箱中，于2 5 o C、1 2 h荧光／1 2 h黑暗条件下保湿培养，定期观察症状发展过程。发病的果实按照2的方法重新分离病原菌，做K o h n法则确认是否同种致病菌。

二、（苹果炭疽菌低毒性菌株的筛选及控病效果的研究）

炭疽菌培养参照方中达等的方法在含有PDA培养基的试管斜面上接种炭疽菌，7d后用10mL 无菌水冲洗抱子再倒入25OmL内有玻璃珠、灭菌的三角烧瓶中(约1又1了个抱子/mL)，置摇床上20min，使抱子团充分分散，涂平板12个待用。涂平板仍参照方中达的方法

苹果炭疽病菌在pH3~10范围的PDA培养基上均能生长和产抱，最适菌丝生长的PH值为4，分生抱子产生的最适pH值为4~5，

三、（东北农业大学农学硕士学位论文南瓜疫病菌(尸彻toPhthor。。aP:iciLeon.)毒素致病机理及抗源筛选研究）

生物测定法包括幼苗浸渍法、离体叶片浸渍法、叶片针刺、涂抹和喷雾测定、植物愈伤组织测定法、离体根冠细胞测定法、线粒体测定法、叶绿体测定法、细胞膜测定法等。

酶水平的生物测定有ATP酶法、PAL酶法、核糖核酸和脱氧核糖核酸酶法、SOD酶法、POD 酶法、MOD酶法。代谢水平的生物测定有种苗偶联能量的测定、苯丙烷类代谢途径的测定、离子吸收测定和C02暗固定测定法等。

与抗性有关的重要的酶类有细胞壁水解酶、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、过氧化物酶(POD)、多酚氧化酶(PPO)等，植保素为一些酚类和黄酮类化合物。

2.2.1液体培养基制备

Plich’S培养液:I000ml培养液中含KH2PO4 5g，MgSO4;·7H2O 2.0g，天门冬酰胺1.0g，VB1 0.1g，酵母浸膏5g，蔗糖25g;灭菌前PH调至6.5。

胡萝卜汁培养液:用200g胡萝卜切碎后，煮沸30分钟，经2层纱布过滤后用蒸馏水定容至100Oml)。灭菌前州调至6.5。

2:2粗毒素的提取

2.2.2.1产毒培养

菌株移接于CA平板上，于24℃条件下培养7d后，沿菌落边缘打出直径为smm菌块，接入分别装100mlphch’s培养液及胡萝卜汁培养液的250m!的三角瓶中，每瓶接5块，置于25℃条件下振荡培养巧d，培养液经定性滤纸过滤，滤液经细菌滤膜真空抽滤得无菌培养液。2.2.2.2粗毒素的提取

在无菌培养液中加入(NH4)SO4;置饱和度达85%(0oC)沉淀过夜，再经11000 r/min离心15min，沉淀溶于去离子水中，4℃下对去离子水透析24小时即可得到粗毒素一20℃下保存备用。

2.2.3培养基对P.C月pSl’cj产毒能力的影响

2.2.

3.1根长生长抑制法

用在两种培养基培养得到的无菌滤液分别接种，接种方法是将感病品种(DX一l)的种子用清水漂洗汰除病、劣和杂粒，加水浸泡8小时后，倒掉水并用水冲洗几遍再放到25一26℃恒温条件下培养。待主根长为Znun时，胚向下摆在事先已铺有用无菌滤液浸湿的纱布的白瓷盘内，每白瓷盘放50粒种子，再在种子上面覆盖一层用滤液浸湿的滤纸，于温度为26℃的温箱中培养48

小时后测量主根长并计算根生长抑制率。每个处理3次重复，并设置无菌水、空白培养液作对照。生长抑制率(%)二对照处理根长X100

2.2.

3.2幼苗浸渍法

用两种培养基提取的无菌滤液分别处理幼苗，鉴别无菌滤液的活性。接种时期为第一片真叶完全展开，第二片真叶1/2展开的幼苗，经无菌水处理后，移入分别盛有两种无菌滤液的三角瓶中，设p。caPsl’ci无菌水、空白培养液做对照，24一26℃刻牛下，光照处理下，每个处理5次重复，两天后观察其发病症状。

四、（辣椒疫霉菌产毒培养方式和提取方法的研究李海燕。赵伟全第16卷第1期黑龙江八一农垦大学学报16（1）：10～13 2004年3月）

采用Plich’s培养液在振荡培养的方式下，辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）产毒量最高。大量快速提出Phytophthora capsici毒素的最佳方法为硫酸铵沉淀法

1.2试培养基

Plich’s培养液：KH2PO 4 0.5 g，MgSO4·7 H2O 2.0 g，天门冬酰胺1.0 g，酵母浸膏5.0g，VB1 0.01 g，蔗糖25 g，蒸馏水1 000 mL。

胡萝卜汁培养液：称取胡萝卜200 g，去皮切成小块放入组织捣碎机内捣碎裂分钟，三层纱布过滤，滤液加蒸馏水定容至1 000 mL。辣椒叶煎汁培养液：取新鲜辣椒叶200g，加水煮沸30min，过滤，滤液加蒸馏水定容至1000mL。

1.3产毒培养条件

采用胡萝卜（CA）固体培养基上，培养5d的辣椒疫霉菌，沿菌落边缘打出直径为8mm的菌块，接入装有150 mL培养液的250 mL三角瓶中，每瓶8块，每种培养液接种10瓶，5瓶于25℃下静止培养，另外5瓶置于25℃恒温振荡培养箱（HZQ－X100型）中振荡培养（120 r/min）15 d。取出培养液经三层定性滤纸抽滤，再经微孔滤膜（0.45μm）真空抽滤，得无菌培养滤液，调pH值至6.5，置4℃冰箱中待用。