人外显子测序
外显子组测序技术在疾病诊断及个性化治疗中的应用
外显子组测序技术在疾病诊断及个性化治疗中的应用随着基因测序技术的不断发展和应用，外显子组测序技术越来越受到人们的关注。
外显子是基因组中包含编码蛋白质的区域，测序外显子组可以帮助人们识别和解读基因变异，从而实现对疾病的更准确的诊断和个性化治疗。
本文将从测序技术的原理、疾病诊断和个性化治疗三个方面探讨外显子组测序技术在医学领域中的应用。
一、外显子组测序技术的原理外显子组测序技术的原理是使用高通量测序技术对含有编码蛋白质的外显子区域进行测序。
根据测序数据的比对和分析，可以找出外显子区域中的基因变异，如单核苷酸多态性（SNP）、插入或缺失等。
同时，还可以根据基因序列信息预测和解释有关基因功能及其对疾病的影响等。
二、外显子组测序技术在疾病诊断中的应用外显子组测序技术在疾病诊断中的应用主要包括以下两个方面：1. 寻找疾病相关基因通过测序患者血液或组织中的基因组，寻找患者基因组与正常人基因组的差异，从而找出与疾病相关的基因。
例如，在癌症早期诊断中，可以通过测序癌症组织中的外显子组，寻找潜在的癌症相关基因，以便进行早期诊断和治疗。
2. 确定基因变异对疾病的影响通过测序外显子组，可以确定基因变异对疾病的发生和发展有何影响。
例如，在肿瘤治疗中，可以通过测序肿瘤组织中的外显子组，确定肿瘤细胞中的突变点，进而制定更加有效的治疗方案。
三、外显子组测序技术在个性化治疗中的应用外显子组测序技术在个性化治疗中的应用主要包括以下两个方面：1. 个性化药物治疗通过测序患者的外显子组，确定患者的基因型信息，从而选择最适合患者的药物治疗方案。
例如，对患有特定基因突变的非小细胞肺癌患者进行测序，可以选择与该基因突变相关的靶向药物进行治疗，以提高治疗的有效性和安全性。
2. 个性化营养和生活方式干预通过测序患者的外显子组，确定患者的基因型信息，从而制定个性化的营养和生活方式干预方案。
例如，对患有高脂血症的患者进行测序，可以针对患者的基因型信息，制定个性化的饮食和运动方案，以降低患者的胆固醇含量和心血管疾病风险。
全外显子测序检验的临床意义与样本要求
全外显子测序检验的临床意义与样本要求在当今医学领域，全外显子测序检验正逐渐成为临床诊断和治疗中不可或缺的重要工具。
全外显子测序是一种高通量的基因组测序技术，能够对所有外显子区域进行全面的检测和分析，从而帮助医生发现患者潜在的遗传变异和突变，为疾病的诊断和治疗提供更精准的信息。
针对全外显子测序检验的临床意义和样本要求，本文将从多个角度进行探讨，并共享个人观点和理解。
一、全外显子测序检验的临床意义1. 诊断和治疗指导：全外显子测序能够为医生提供全面的遗传变异信息，帮助精准诊断疾病类型和确定治疗方案。
尤其对于罕见遗传病、癌症等复杂疾病的诊断和治疗指导具有重要意义。
2. 遗传沟通和家族风险评估：通过全外显子测序检验，可以帮助患者进行遗传沟通，评估患病风险，并为家族成员提供相关遗传信息，帮助他们进行风险评估和健康管理。
3. 个性化医学：全外显子测序检验为个性化医学提供了重要的基础数据，可以根据个体的基因组信息，制定个性化的预防、诊断和治疗方案，实现精准医疗。
二、全外显子测序检验的样本要求1. 样本类型：全外显子测序通常需要采集患者的血液样本，获取其中的DNA进行测序分析。
对于一些特定疾病或研究项目，还可能需要获取肿瘤组织样本等特定样本。
2. 样本质量：样本的质量直接影响着全外显子测序的准确性和可靠性。
在采集和保存样本时，需要注意避免血液凝块和样本污染等情况，保证样本的纯度和完整性。
3. 样本数量：通常情况下，全外显子测序需要一定数量的DNA样本才能进行测序分析。
对于不同的实验项目和测序评台，样本数量的要求可能会有所不同，需要根据具体情况进行调整。
三、个人观点和理解全外显子测序作为一种新型的基因组测序技术，对于临床诊断和治疗具有重要意义。
通过对个体基因组的全面检测，我们能够更好地了解疾病的遗传基础，为精准医学提供数据支持。
然而，在进行全外显子测序检验时，我们也需要考虑样本的要求和质量，以确保测序结果的准确性和可靠性。
医学外显子组测序检测遗传病拷贝数变异的初步探索
医学外显子组测序检测遗传病拷贝数变异的初步探索张彦;孙樱桐;许艺明;丁红珂;张巍;尹爱华【摘要】[目的]评价医学外显子组高通量测序技术用于拷贝数变异(CNV)检测的可行性.[方法]两个不相关的遗传病家系案例,患者除了有智力障碍的类似症状外,无其他明显共同点.通过脆性X染色体综合征基因筛查、染色体G显带技术、染色体微阵列技术以及医学外显子组测序技术等对患者及其家属进行遗传学检测.[结果]在两个家系的患者中均发现染色体拷贝数变异,片段大小从11.4 kb到13.03 Mb不等.拷贝数变异得到了其他技术的验证.[结论]医学外显子组高通量测序技术用于拷贝数变异相关的遗传病临床辅助诊断是可行的,但其有效性和准确度有待进一步大量数据的评估和验证.【期刊名称】《中山大学学报（医学科学版）》【年(卷),期】2019(040)001【总页数】6页(P144-149)【关键词】高通量测序;医学外显子组;拷贝数变异;孟德尔遗传病【作者】张彦;孙樱桐;许艺明;丁红珂;张巍;尹爱华【作者单位】广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州511442;广州嘉检医学检测有限公司,广东广州510300;广州嘉检医学检测有限公司,广东广州510300;广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州511442;广州嘉检医学检测有限公司,广东广州510300;广东省妇幼保健院医学遗传中心,广东广州511442【正文语种】中文【中图分类】R446.9遗传病种类繁多，临床表现大多不特异，常规手段诊断困难，常常需要对整个基因组或基因组特定区域进行检测才能起到辅助诊断的作用。
染色体微阵列技术和高通量测序技术作为基因组检测技术的代表，对于遗传病的临床诊断具有重要价值［1-2］，但由于费用和检测周期等问题，临床病例急需一种相对单一的解决方案。
对于孟德尔遗传病，除了种类繁杂的单核苷酸变异（single nucleotide variation，SNV）相关的遗传病外，拷贝数变异（copy number variation，CNV）也与多种遗传病相关［3］。
外显子组测序技术
外显子组测序技术一、前言外显子组测序技术是一种高通量测序技术，它可以通过对人类基因组的外显子进行测序，来寻找与疾病相关的基因变异。
本文将详细介绍外显子组测序技术的原理、方法和应用。
二、原理外显子组测序技术是一种全基因组测序的变体，它只对基因组中编码蛋白质的区域（即外显子）进行测序。
这种技术可以检测到与疾病相关的单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（indel）和结构变异等多种类型的突变。
三、方法1. 样品准备首先需要从患者或正常人身上提取DNA样品，并将其分离成片段。
然后使用特定的酶来切割这些片段，使其只包含编码蛋白质的区域。
2. 库制备接下来需要将这些片段连接到适当大小的DNA片段上，并添加适当的标签以便于后续处理。
这个过程称为库制备。
3. 测序完成库制备之后，需要进行高通量测序。
当前可用于外显子组测序的技术包括Illumina、Ion Torrent和Pacific Biosciences等。
4. 数据分析测序完成后，需要对数据进行处理和分析。
这个过程可以使用各种软件来完成，例如BWA、GATK和SAMtools等。
四、应用外显子组测序技术已经被广泛应用于疾病研究和临床诊断。
例如，在肿瘤学中，它可以检测到肿瘤细胞中的突变，并帮助医生选择最佳的治疗方案。
此外，它还可以用于遗传性疾病的诊断和预测。
五、优缺点1. 优点外显子组测序技术具有高通量、高灵敏度和高特异性等优点。
它可以检测到多种类型的基因变异，并且可以同时对多个样品进行分析。
2. 缺点外显子组测序技术的主要缺点是成本较高，并且需要较长的数据处理时间。
此外，由于只对编码蛋白质区域进行测序，因此无法检测到与非编码RNA相关的突变。
六、总结外显子组测序技术是一种重要的高通量测序技术，它可以用于疾病研究和临床诊断。
虽然它有一些缺点，但随着技术的不断发展，相信它将在未来得到更广泛的应用。
外显子测序 生物学重复-概述说明以及解释
外显子测序生物学重复-概述说明以及解释1.引言1.1 概述外显子测序（exome sequencing）是一种基于高通量测序技术的生物学研究方法，其目的是对生物体中的外显子区域进行快速、准确地测序和分析。
外显子是基因组中编码蛋白质的片段，它们占据了整个基因组的仅0.5至1.5的区域，但却承载着80以上的已知致病突变。
因此，外显子测序被广泛应用于寻找蛋白质编码基因的突变，以及与遗传性疾病、肿瘤和其他复杂疾病相关的致病突变的鉴定和研究。
外显子测序的基本原理是使用高通量测序技术对DNA样本进行测序，然后利用生物信息学方法将测序结果与参考基因组进行比对和分析，从而确定样本中外显子的序列和存在突变的位置。
与全基因组测序相比，外显子测序具有较低的成本和更高的效率，因为外显子相对较小且具有较高的功能重要性，可以更准确地筛选和鉴定潜在致病突变。
外显子测序在生物学研究中的应用广泛而重要。
它不仅可以用于研究人类遗传性疾病和肿瘤突变，还可应用于农业、畜牧业和其他生物领域的基因组学研究。
通过对不同个体的外显子进行测序，我们可以了解个体间的遗传差异、突变积累和遗传进化规律，为人类进化和适应性研究提供重要依据。
然而，外显子测序也面临一些挑战。
首先，由于外显子区域相对较小，它只能提供关于外显子的信息，对非编码区域的突变鉴定有限。
其次，外显子测序在处理复杂疾病和疾病相关基因组变异时可能会遇到困难，因为这些变异可能位于基因的调控区域或与功能相关的非编码RNA中。
此外，外显子测序对测序深度和准确性要求较高，因此需要高质量的测序平台和数据分析方法的支持。
总之，外显子测序作为一种高效、准确的测序技术，在生物学研究和临床诊断中发挥着重要作用。
随着技术的不断发展和应用的不断扩大，外显子测序将为我们揭示生物体的基因组变异与功能之间的关系，为疾病的早期诊断和个性化治疗提供更多可能性。
同时，对于生物学重复的研究也为我们提供了全新的视角和理解，有助于揭示生命的奥秘和进化的规律。
外显子组测序数据分析流程
外显子组测序介绍外显子（exon）是真核生物基因的一部分，包含着合成蛋白质所需要的信息。
全部外显子被称为“外显子组”（Exome）。
外显子组测序（Exome sequencing）是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
由于外显子组测序捕获目标区域只占人类基因组长度的约1%，因此远比进行全基因组序列测序来得更简便、经济，目标区域覆盖度也更高，便于变异检测。
该项技术可用于以下研究1）检测疾病样本中外显子区域内高风险碱基变异位点；2）配合大样本分析，确定孟德尔遗传疾病相关外显子SNP位点和基因；3）在癌症研究过程中，检测癌症样本外显子区域内的体细胞突变位点和潜在的融合基因；4）用于种群遗传学研究的大规模样本基因组分析，检测SNP位点、LD并绘制种群图谱。
我们能提供详尽的全基因组重测序数据的处理和分析服务。
如您没有标准化的数据、只需流程中的局部分析内容或要求特立独行的数据分析思路，我们亦能满足您的要求。
数据处理和分析流程图预期结果示例图示例图1 各类型SNV在样本中的个数统计。
示例图2 不同类型外显子区域上的SNV类型统计。
示例图4 融合基因预测[1]示例图4 大量样本的GWAS分析结果[2]示例图5 肿瘤样本高频率突变基因统计[3]示例图来源文献[1]. Kangaspeska, S., et al., Reanalysis of RNA-sequencing data reveals several additional fusion genes with multiple isoforms. PLoS One, 2012. 7(10): p. e48745.[2]. Craig, J.E., et al., Rapid inexpensive genome-wide association using pooled whole blood. Genome Res, 2009. 19(11): p. 2075-80.[3]. Bea, S., et al., Landscape of somatic mutations and clonal evolution in mantle cell lymphoma. Proc Natl Acad Sci U S A, 2013. 110(45): p. 18250-5.。
遗传学分析技术在疾病诊断中的应用
遗传学分析技术在疾病诊断中的应用随着现代医学技术的日益发展，遗传疾病诊断得到了越来越多的重视。
在遗传疾病的诊断中，遗传学分析技术起着至关重要的作用。
本文将介绍遗传学分析技术在疾病诊断中的应用，包括全外显子组测序、SNP芯片、FISH技术、基因芯片、PCR技术等。
一、全外显子组测序全外显子组测序是一种用于检测单个人类基因组中所有外显子的高通量测序技术。
它可以检测与遗传疾病相关的所有基因，并找出这些基因是否突变，从而提供以每个病人为基础的遗传诊断结果。
目前，全外显子组测序已被广泛运用于遗传疾病的诊断和基因修复等方面。
二、SNP芯片SNP（单核苷酸多态性）芯片是一种基于基因多态性的检测技术。
它可以同时检测数万个SNP位点，并对病人的基因组进行分析。
利用这种技术，医生们可以准确地检测出病人遗传疾病的相关基因位点是否存在突变，为遗传疾病的诊断和治疗提供重要依据。
三、FISH技术FISH技术是一种在细胞水平上分析染色体结构和基因突变的技术。
通过FISH技术，可以观察到基因位点数量的变化和染色体的重排，从而检测遗传疾病的相关基因突变。
常见的FISH技术包括Fluorescence in situ Hybridization（原位荧光杂交）和Array CGH（基因组和染色体芯片分析）等。
四、基因芯片基因芯片是由多种基因片段组成的微型芯片，它可以将大量的DNA序列固定到芯片表面上，并进行高通量的检测。
通过基因芯片技术，可以一次性检测大量的基因位点，从而快速、准确地诊断出病人的遗传疾病。
基因芯片技术广泛应用于遗传性肿瘤、遗传性视网膜病变等疾病的检测和分析。
五、PCR技术PCR（聚合酶链式反应）技术是一种检测DNA序列的传统技术。
它可以通过扩增基因片段，检测DNA序列的变化，从而为遗传疾病的诊断和治疗提供基础数据。
PCR技术已被广泛运用于基因突变的检测、DNA序列的分析和修复等方面。
总之，遗传学分析技术在疾病诊断中的应用已经得到了广泛的认可和应用。
最新外显子组测序数据分析报告
目录1, 分析流程和目录信息 (2)1.1分析流程图 (2)1.2目录信息 (2)2, 数据的质控（QC目录） (3)2.1数据质量qc图 (3)2.2数据量统计 (6)3, 序列比对（target目录） (7)3.1比对方法 (7)3.2数据比对统计 (7)4, SNV的识别和计算（raw目录） (11)4.1方法简介 (11)4.2 VCF格式说 (14)4.3 SNV和Indel统计信息 (15)5，变异体的注释和统计(result目录) (17)5.1 注释结果统计 (17)5.2 注释结果详细说明 (21)6，候选位点分析结果 (Candidate目录) (25)6.1 位点筛选标准 (25)6.2 候选位点结果说明 (26)7，参考文献和数据库 (27)7.1 分析软件参考文献 (27)7.2 参考数据库 (27)1, 分析流程和目录信息1.1分析流程图1.21. 外显子测序质控结果2. 捕获区域比对数据与覆盖度等指标统计3. SNV和Indel原始VCF文件4. SNV和Indel注释结果及分布统计5. 候选SNV和Indel结果注意：所有txt，stat，VCF等文本文件都可以用excel打开2, 数据的质控（QC目录）2.1数据质量qc图1，每循环的碱基质量分布图2，不同质量的read数量分布图3，read的长度分布图4，碱基N数目分布统计5，每循环ATCG分布统计6，read的GC含量统计7，每循环的GC比例统计2.2数据量统计Summary文件sample pf read clean read Trim remain% pf base(G) clean base(G) Trim remain% 样本名原始read数有效read数有效read比例原始碱基数（G）有效碱基数（G）有效碱基比例lf002 48661241 47997016 98.63500193 9.829570682 9.58777551 97.54012479 lf003 47690482 47045833 98.64826487 9.633477364 9.396330775 97.53830751 lf004 48179592 47522300 98.63574602 9.732277584 9.493069911 97.54212032 lf005 37943779 36984007 97.47054188 7.664643358 7.337483061 95.7315653 lf006 46440756 45615915 98.2238855 9.381032712 9.040112844 96.36585994 lf007 53829583 52838815 98.15943586 10.87357577 10.47063335 96.29429703 lf008 44526129 43527254 97.7566543 8.994278058 8.629876672 95.94851993, 序列比对（target目录）3.1比对方法参考序列在整个处理过程中使用UCSC hg19版本的人类基因组序列作为参考，注释信息和命名法则均已UCSC为标准，相关数据可以从UCSC网站下载。
wes检测原理和过程
wes检测原理和过程WES检测原理和过程一、WES检测概述全外显子测序（Whole Exome Sequencing，WES）是一种高通量的基因组学技术，它可以对人体的所有编码蛋白质基因进行测序。
WES技术是通过对人体DNA样本进行捕获和测序，以发现与疾病相关的遗传变异。
WES技术的应用范围广泛，包括罕见遗传疾病、肿瘤、药物反应等方面。
二、WES检测原理1. WES技术流程WES技术流程主要包括DNA提取、文库制备、捕获和测序四个步骤。
（1）DNA提取：从患者血液或组织中提取DNA样本。
（2）文库制备：将DNA样本随机断裂成小片段，并加入适当的连接器。
连接器上含有引物序列，这些引物可以用于寻找特定区域的DNA片段。
（3）捕获：使用探针或引物来捕获感兴趣的外显子区域。
这些探针或引物可以选择性地捕获编码蛋白质所需的所有外显子区域。
（4）测序：将捕获的DNA片段进行高通量测序，并将结果与参考基因组进行比对，以确定每个外显子的序列。
2. WES技术原理WES技术的原理是利用高通量测序技术对所有编码蛋白质基因进行测序。
人类基因组中约有1%的区域编码蛋白质，这些区域被称为外显子。
WES技术可以通过选择性捕获所有外显子区域来实现对编码蛋白质基因的全面测序。
在WES技术中，DNA样本首先随机断裂成小片段，并加入适当的连接器。
连接器上含有引物序列，这些引物可以用于寻找特定区域的DNA片段。
然后，使用探针或引物来捕获感兴趣的外显子区域。
这些探针或引物可以选择性地捕获编码蛋白质所需的所有外显子区域。
最后，将捕获的DNA片段进行高通量测序，并将结果与参考基因组进行比对，以确定每个外显子的序列。
三、WES检测过程1. DNA提取WES检测需要从患者血液或组织中提取DNA样本。
DNA提取是WES检测的第一步，其目的是从样本中分离出DNA，并将其纯化，以便后续步骤的进行。
DNA提取方法包括化学法、机械法等多种方法。
2. 文库制备文库制备是WES检测的第二步，其目的是将DNA样本随机断裂成小片段，并加入适当的连接器。
外显子组测序
346: 256-259.
［案例三］ 癌症研究：外显子测序研究局限性肺腺癌瘤内异质性[14] 本研究采用多区域取样分析瘤内异质性的研究思路，对11位患者的局限性肺腺癌的48
个肿瘤样品进行了外显子测序。共鉴定出7269个体突变，其中21个是已知的与癌症相关的 基因突变，76% 的体突变及21个已知癌症基因突变中的20个都可以在同一肿瘤的所有区域 样品中检测到，表明对肿瘤的某一区域进行单次活检，以适当的深度对其测序，可以鉴别 出绝大多数突变。而前期关于肾透明细胞癌的研究结果表明，肿瘤不同区域样品的共有突 变仅占突变总数的31%~37%，说明肿瘤异质性在不同癌种间存在差异。
应用方向
孟德尔疾病研究
马布里综合症[1]：发现致病基因PIGV； 逆向性痤疮[2]：发现致病基因NCSTN； 眼皮肤白化病[3]：发现致病基因SLC24A5； 先天性肾脏和尿道畸形[4]：发现致病基因DSTYK;
复杂疾病研究
混合型低脂血症[5]：发现致病 基因ANGPTL3； 孤独症[6]：发现11 个新生突变 ……
[9] Rudin C M, Durinck S, Stawiski E W, et al. Comprehensive genomic analysis identifies SOX2 as a frequently amplified gene in small-cell lung cancer[J]. Nature Genetics, 2012, 44(10): 1111-1116.
人类外显子测序技术参数
一、技术参数
一
基本功能要求
1.1
服务范围：外显子测序
1.2
测序平台：HiSeqX Ten/Nova Seq6000
1.3
技术优势：合作项目1200例以上，成功的临床转化经验，优质的室间质评结果，在高通量、准确性上优势明显，应用效果好
1.4
实.Clean Reads Rate>80%；2. Adapter polluted rate<10%；3.碱基含量分布，AT，GC不分离；4.Dup率<20%；5.捕获特异性＞75%；6.基因组比对率>99%；7.基因组比对率>99%,Q30＞85%。
4.数据分析内容：数据处理、比对及质控、SNP检测及注释、Indel检测及注、SNP&Indel差异分析、CNV检测及注释、SV检测及注释、融合基因分析、变异全局总览
9.变异全局总览：对检测到的SNP、InDel、SV等变异的分布信息以CIRCOS展示出来，便于对整体情况的掌握及对不同样本显子捕获系统：AgilentV6 60M
2.质量检测：1％的琼脂糖电泳检测DNA样品是否有降解以及杂质；NanoPhotometer®分光光度计检测样品纯度；Qubit® 3.0 Flurometer检测DNA样品浓度。
2.比对及质控：本项目以UCSC hg19参考基因组作为参考序列，利用比对软件BWA（，将过滤后的Clean Reads比对到参考基因组上，得到BAM格式比对结果文件。使用Samtools软件对BAM文件进行排序，只保留序列唯一比对结果，再利用Picard标记比对结果中的Duplication read，同时还利用GATK对InDel周围的序列进行局部重新比对，降低SNP检测假阳性，得到高准确性的用于变异检测的比对结果BAM文件。按照个体或样本的特征将其分类，使同一类别内的个体具有尽可能高的同质性，类别之间具体尽可能高的异质性。代谢物含量数据采用极差法进行归一化处理，对代谢物在不同样本间的积累模式进行聚类分析。
人全外显子测序结题报告
人全外显子测序结题报告成都生命基线科技有限公司目录一、分析方法 (3)1.1 全外显子组测序 (3)1.2 生物信息分析概述 (3)1.3 数据过滤 (4)1.4 比对 (4)1.5 InDels 附近区域的局部重比对 (4)1.6 碱基质量值校正(BQSR) (4)1.7 变异检测 (5)1.8 过滤变异结果 (5)1.9 变异结果注释与预测 (5)1.10 网络资源 (5)二、项目流程 (6)2.1 实验流程 (6)2.2 信息分析流程 (6)三、项目结果报告 (7)3.1 测序数据产出 (7)3.2 目标区域上的比对结果统计 (8)3.3 数据质控 (10)3.4 SNP结果 (10)3.5 InDel 结果 (11)四、参考文献 (13)五、帮助 (14)5.1 FASTQ格式说明 (14)5.2 比对结果格式说明 (14)5.3 如何实现基因组变异可视化 (15)5.4 如何选择用于验证的变异 (15)5.5 如何寻找候选变异 (15)5.6 交付目录及结果文件说明 (16)5.7 如何解压缩文件 (16)六、常见问题 (17)一、分析方法1.1 全外显子组测序质量合格的基因组 DNA 样品通过超声波高性能样品处理系统（Covaris）随机打断成主峰是 200bp-300bp 左右的片段。
随后进行 DNA 片段末端修复，3’端加上“A”碱基，两端加上文库接头。
接头连接后的文库进行线性扩增（LM- PCR ）制备成杂交文库。
取适量的杂交文库与外显子芯片进行捕获富集，洗脱掉未富集的片段后进行扩增。
扩增产物经Agilent 2100 bioanalyzer 仪器（Agilent DNA 1000 Reagents）和 QPCR 质控，质控合格后即可上机测序。
我们使用 Illumina HiSeq 系列平台，对每个合格的文库进行高通量测序，并保证每个样品的数据量达标。
测序得到的原始图像数据，经 Illumina 碱基识别软件（Base Calling）转化为原始序列数据（raw reads），即双末端 reads（paired-end reads），数据以 FASTQ 文件格式存储，称之为 raw data。
全外显子组测序的具体方法及步骤
全外显子组测序的具体方法及步骤全外显子组测序（Whole Exome Sequencing，简称WES）是一种高通量测序技术，用于测定一个个体的所有外显子区域的DNA序列。
外显子是编码蛋白质的基因组区域，占据了人类基因组的约1-2%。
WES可以用于寻找致病基因突变，特别是在遗传性疾病的分子诊断中有广泛的应用。
下面将详细介绍WES的具体方法及步骤。
1.样品准备：-提取DNA：从待测个体的外周血或组织样品中提取总DNA。
-细胞裂解：使用特定组织裂解缓冲液将细胞或组织样品裂解，释放DNA。
-纯化DNA：通过离心等步骤，去除杂质，纯化DNA。
2.外显子库建立：- 靶向捕获：使用外显子组富集探针（baits）将DNA中的外显子区域进行加权，并去除非外显子区域的DNA片段。
-杂交反应：将靶向探针与DNA样品进行杂交反应，使探针与待测DNA的外显子区域发生特异性结合。
-洗涤：将未结合的探针洗掉，保留结合的外显子区域DNA片段。
-PCR扩增：对靶向捕获得到的DNA片段进行PCR扩增，以增加样品中外显子区域的DNA原料。
3.高通量测序：-数据库构建：将PCR扩增得到的外显子DNA片段建立一个DNA文库，用于测序。
- 测序反应：使用高通量测序平台（如Illumina HiSeq X）进行DNA文库的测序，得到大量的短序列片段（reads）。
- 数据处理：通过对这些reads进行去除低质量序列、比对到参考基因组等处理，获得高质量的测序数据。
4.数据分析：- 变异检测：使用专门的变异检测软件对样品中的变异进行分析，包括单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，简称SNPs）和小片段插入缺失等。
-数据解读：将检测到的变异与公开的数据库进行对比，筛选出可能与疾病相关的变异。
-功能注释：对筛选出的变异进行功能注释，评估其潜在影响，进一步缩小候选基因的范围。
- 候选基因验证：对最终候选基因进行进一步的实验验证，如Sanger测序。
外显子测序简介
外显⼦测序简介外显⼦测序，也叫做外显⼦捕获测序。
⾸先利⽤序列捕获技术将外显⼦区域的DNA捕获并富集，然后进⾏⾼通量测序。
外显⼦测序主⽤⽤来分析基因组上的变异位点，包括SNP和INDEL。
外显⼦区域占整个⼈类基因组1%的⽐例，但是却包含了85%左右的已知疾病变异。
相⽐全基因组测序，外显⼦测序成本低，⽽且可以检测到全基因组测序鉴定不到的⼀些SNP位点。
⽬前市场上主流的外显⼦捕获试剂盒是以下3家公司的产品：1. Roche2. Agilent3. IlluminaRoche的Nimblegen SeqCap EZ Exome Kit；Agilent的SureSelect Exome kit; Illumina公司的TrueSeq Exome Kit。
Nimblegen SeqCap EZ Exome Kit⽬前为v3版本，链接如下https:///en/products-solutions/by-category/target-enrichment/hybridization/seqcap-ez-exome-v3-kit.html从下图可以看出，这款试剂盒覆盖的区域是最⼴泛的。
SureSelect Exome kit⽬前为v7版本，链接如下https:///en/SureSelect-DNA-Target-Enrichment-Baits-NEW/SureSelect-Human-All-Exon-V6/?cid=AG-PT-124&tabId=AG-PR-1308V7是今年才出来的最新版，⽬前⼤部分的数据还是基于v6版的。
illumina 是⽬前最⼤的⼆代测序仪⼚商，其外显⼦试剂盒价格⽐较低，应⽤的也很多。
链接如下https:///products/by-type/sequencing-kits/library-prep-kits/truseq-exome.html?langsel=/cn/外显⼦区域富集完成之后，就是⾼通量测序了，⽬前主流的测序平台还是illumina, 包括Miseq, Hiseq和Novaseq。
外显子捕获测序原理
外显子捕获测序原理外显子捕获测序是一种高效的基因组测序方法，它可以选择性地富集目标基因组的外显子区域，并对其进行测序。
这种方法的原理是利用特异性探针或引物，将外显子区域与其他非编码区域分离开来，从而提高测序效率和准确性。
外显子是基因组中编码蛋白质的区域，占据了整个基因组的很小一部分。
然而，它们却承载着大部分与遗传疾病相关的突变。
因此，通过对外显子进行测序，可以更好地理解基因变异与疾病之间的关系。
外显子捕获测序的步骤如下：1. 设计探针或引物：根据目标基因组的外显子序列，设计一组特异性的探针或引物。
这些探针或引物可以与外显子区域的序列互补配对，并将其与其他非编码区域分离开来。
2. 捕获外显子：将设计好的探针或引物与待测样本中的DNA或RNA杂交。
这样，只有与外显子序列互补的探针或引物才能与样本中的外显子结合，形成稳定的杂交复合物。
3. 分离非特异性序列：通过洗涤步骤，将与非编码区域结合的探针或引物去除，只保留与外显子区域结合的探针或引物。
这样，就实现了对外显子的选择性富集。
4. 扩增和测序：对富集后的外显子区域进行扩增和测序。
扩增可以使用PCR等方法，将外显子序列扩增为足够数量的DNA片段。
然后，通过高通量测序技术对这些DNA片段进行测序，得到外显子的序列信息。
外显子捕获测序的优势在于可以高效地测序目标基因组的外显子区域，避免了对整个基因组进行测序的复杂性和高成本。
此外，外显子捕获测序还可以提高测序的深度和准确性，使得检测到的突变更加可靠。
外显子捕获测序在医学研究和临床诊断中具有广泛的应用。
它可以用于寻找与遗传疾病相关的突变，帮助科学家和医生更好地理解疾病的发生机制。
此外，外显子捕获测序还可以用于个体化医学，根据个体的基因组信息，为患者提供更精准的治疗方案。
外显子捕获测序是一种高效、准确的基因组测序方法。
通过选择性富集外显子区域，可以更好地理解基因变异与疾病之间的关系，为医学研究和临床诊断提供有力支持。
全外显子测序实验步骤
全外显子测序实验步骤简介全外显子测序是一种高通量测序技术，可以对人类基因组中的所有外显子进行测序。
外显子是基因组中编码蛋白质的部分，全外显子测序可以帮助我们了解基因组中的变异和突变，从而揭示与疾病相关的基因变异。
全外显子测序实验涉及多个步骤，本文将详细介绍这些步骤，包括样本准备、DNA提取、文库构建、测序和数据分析等。
步骤1. 样本准备全外显子测序实验首先需要准备样本，通常是从患者或实验动物中获取的血液、组织或细胞样本。
样本的选择应根据研究目的和样本可获得性进行。
2. DNA提取从样本中提取DNA是进行全外显子测序的关键步骤。
DNA提取方法可以根据样本类型选择，常见的方法包括酚氯仿法、盐析法和商用DNA提取试剂盒等。
3. 文库构建文库构建是将提取的DNA样本转化为可以进行测序的文库的过程。
文库构建的主要步骤包括DNA片段化、末端修复、连接测序适配体和文库富集等。
•DNA片段化：将提取的DNA样本通过超声波或酶切等方法打断成较小的片段，通常大小为200-300碱基对。
•末端修复：对DNA片段的末端进行修复，包括去除3’和5’的过度突出部分，以及在末端添加磷酸基团。
•连接测序适配体：将修复的DNA片段与测序适配体连接，适配体含有测序引物和标识序列，用于后续的测序反应。
•文库富集：通过PCR扩增等方法富集连接好的文库，以增加测序效率和准确性。
4. 测序文库构建完成后，接下来进行测序。
全外显子测序通常采用高通量测序技术，如Illumina HiSeq或NovaSeq等。
•测序前处理：将文库中的DNA片段固定到测序芯片上，通常使用PCR扩增和桥式PCR等方法。
•测序反应：在测序芯片上进行碱基的顺序测定，根据测序适配体上的引物和标识序列识别碱基。
•数据生成：测序仪器会生成原始测序数据，通常以FASTQ格式存储。
5. 数据分析测序完成后，需要进行数据分析以获得有用的信息。
数据分析的主要步骤包括：•数据质控：对原始测序数据进行质量评估和过滤，去除低质量的序列。
panel全外显子组与全基因组测序的全方位对比
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捕获探针供应商
国外较大的提供杂交捕获探针库的供应商
Agilent SureSelect
Roche NimbleGen
IDT xGen™
Twist Bioscience Human Core Exome
国内
迪赢生物
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靶向捕获与冗余数据
液相杂交捕获技术流程图
冗余数据的产生
同源序列
目标序列
同源序列干扰
panel大小约1-2M，约占全外显子的1%-2%左右
2
检测范围与测序深度
全基因组测序 全外显子组测序 不孕不育panel
30-40X 100-150X 500X以上
3
检测方案的选择
WGS
WES panel
panel和WES，临床上如何选择？
panel具有更低廉的价格，更高的测序深度 WES具有更广泛的检测范围
表型遗传异质性较高，疾病 复杂，难以区分，需要对大 量基因进行筛查，更适合 WES或WGS。
PMID: 29398702
5
检测方案的选择
神经系统疾病/发育异常类疾病
精子异常导致的男性不育
智力障碍
小儿癫痫
线粒体病
行为异常 遗传代谢病
神经肌肉病
基因数量多达2000个以上，表型异质性高，症 状难以区分，容易误诊，更适合WES/WGS
WGS包含所有碱基，可以检测 CNV和非编码序列 panel可定制检测范围，可以加 入WES不包含的目标区域
WES测序深度还不足以区分真 假基因，深度更高的panel却有 可能做到。
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安捷伦各版本WES对比
靶标 大小
设计 大小
V8
35.1 Mb 41.6 Mb
全外显子组测序意义
《全外显子组测序意义》1.“全外显子组测序就像给基因世界的一把超级放大镜，能让我们看得更清楚呢。
得知。
比如小李家有遗传病史，一直不知道是哪个基因出了问题，做了全外显子组测序后，发现了那个捣乱的基因，就像在一堆沙子里找到了关键的小石子，多神奇呀。
要是没这技术，那得一直蒙在鼓里吧。
”2.“它像是侦探手里的关键线索，能帮我们解开很多健康谜团，得知。
像小张老是莫名其妙生病，各种检查都做了还是没头绪。
全外显子组测序一查，嘿，找到了隐藏的基因缺陷，这就好比在黑暗中找到了灯的开关。
要是没这个测序，小张还得继续遭罪呢，哼。
”3.“全外显子组测序是疾病诊断的有力武器呀。
得知。
比如小孙的孩子发育有些异常，医生怀疑是基因问题。
通过全外显子组测序，一下子就明确了病因，这就像打靶找到了靶心一样准确。
要是没有这个测序，诊断得多麻烦呀，愁死个人了。
”4.“这测序对药物治疗可有大帮助呢，就像给医生的用药指南加了个导航。
得知。
比如小周得了一种罕见病，用了好多药都不管用。
全外显子组测序结果出来后，医生根据基因信息调整了药物，病情就有了好转。
要是没这测序，就像在迷宫里乱走，啥时候能找到出口呀。
”5.“全外显子组测序能预测疾病风险，这就像天气预报能提前告知风雨一样。
得知。
比如小吴家族有癌症病史，他做了全外显子组测序后，知道了自己患某种癌症的风险比较高，就可以提前预防啦。
要是没这个测序，就只能等生病了才知道，那多被动呀。
”6.“它对研究人类进化也有重要意义呢，就像一本古老的史书。
得知。
比如小郑是研究人类进化的学者，通过分析不同人群的全外显子组测序数据，发现了人类在漫长岁月里基因的变化轨迹，这可比在土里挖化石研究进化有趣多啦。
要是没这测序，研究得多受限呀。
”7.“全外显子组测序在罕见病研究里是个大宝贝，就像沙漠里的绿洲。
得知。
比如小胡研究罕见病多年，一直进展缓慢，全外显子组测序让他找到了很多新的致病基因，这就像打开了一扇新的研究大门。
要是没这个测序，那些罕见病患者得多无助呀。
外显子捕获具体步骤以及各试剂的作用
Roche详细实验细节
2.磁珠捕获及洗脱
洗脱试剂配制--洗捕获磁珠--孵育捕获--洗脱非目标核酸
Roche详细实验细节
3.pcr扩增
9-11
Agilent
SureSelectXT Human All Exon V6
灵ibrary Prep Kit Pure Capture Bead Kit Adapter Kit (A and/or B) pcr ReadyMix Hybridization and Wash Kit DNA Covaris打断仪 DNA 真空浓缩仪 金属浴
THANK YOU
2019/4/27
背景介绍?发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异?可发现常见变异和频率5低频突变?只对基因组的约1测序更加经济高效人的全基因是3g如果要把全基因都测一下一般要平均30x的覆盖
外显子捕获
余晗
20171201
外显子测序简介
外显子 是真核生物基因的一部分，它在剪接后仍会被保存下来，并 可在蛋白质生物合成过程中被表达为蛋白质。
片段大小：150-200bp 测序平台： Illumina HiSeq、 MiSeq 实验周期：2天
illumina
Illumina, TruSeq Exome Enrichment Kit 是近年来刚推出的一种溶 液型的序列捕获方法，利用杂交选择分离出人类基因组中的目的外显 子区域。
通过与目标区域特异的生物素标记DNA探针杂交，富集目标区域， 富集的DNA片段随后从磁珠上洗脱，并杂交进行第二次富集反应，从 而提高目的片段捕获的特异性。
技术优势
发现外显子区的绝大部分的疾病相关变异 可发现常见变异和频率<5%低频突变 只对基因组的约1%测序，更加经济、高效人的全基因是3G，
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人外显子测序
药明康德基因中心，陆桂1. 什么是外显子测序（whole exon sequencing）？
外显子组测序是指利用序列捕获技术将全基因组外显子区域DNA捕捉并富集后进行高通量测序的基因组分析方法。
外显子测序相对于基因组重测序成本较低，对研究基因的SNP、Indel 等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等。
2. 外显子捕获试剂盒有哪些？
目前主要有Roche、Illumina和Agilent三家的外显子捕获试剂。
Nimblegen和Illumina的捕获试剂盒中的探针是DNA探针，化学性质稳；Agilent的捕获试剂盒是RNA探针，有可能RNA 不是很稳定。
3. 外显子捕获效率是什么？
外显子测序过程中要用到杂交过程。
在人的染色体上有许多与外显子有同源性的部分，这些有同源性的部分很可能在杂交过程中也被捕获下来。
所以，测到的序列中，有一部分不是外显子序列。
我们把测序得是外显子的部分占全部测序序列的比列称为捕获效率。
Nimblegen大约是70%
Agilent大约是60%
Illumina大约是50%
4. 外显子测序一般建议做多少倍的覆盖？
一般做100X或者150X。
较高的覆盖倍数，对于测异质性的遗传变质，可以发现小比例的突变。
另外，外显子测序的覆盖不是很均匀，这样较高的平均覆盖率有利于保证大部分的区域有足够的覆盖倍数。
5. 外显子测序能够测出多大的片段缺失？
大致能测出50bp的片段缺失。
目前的测序主要还是用Hiseq 2000,单侧的测长就是100bp。
由于外显子测序的覆盖很不平均，所以如果有大段的缺失，无法判断是因为杂交没有捕获到，还是因为缺失。
目前能够测到的，就是在一个read中发现的缺失。
一个read的长度也就是100bp，所以大到50bp以下的片段缺失可以从外显子测序中测出来。
6. 外显子捕获可以做CNV吗？
外显子测序因为有一个杂交捕获的过程，这样就会有一个杂交捕获效率的问题。
各个外显子的杂交效率是不同的，其同源竞争的情况也不同，所以不同的外显子的覆盖率的差异就很大。
所以一般情况下，外显子测序不能用于CNV的检测。
但在癌症研究中，利用癌组织和癌旁组织对照，可以检测CNV。
现在我们有另外两种常规方法来检测CNV，一种是全基因组重测序，另外一种是用Affymetrix SNP6.0的芯片来测。
其中Affymetrix SNP6.0的检测费用大约只有全基因测序费用的1/10，是一个相对经济的手段。
7. 外显子测序的优点是什么？
外显子测序是全基因重测序的一个较为经济的替代手段，对研究基因的SNP、Indel等具有较大的优势，但无法研究基因组结构变异如染色体断裂重组等，一般在疾病研究中，会结合转录组测序一起研究。
人的全基因是3G，如果要把全基因都测一下，一般要平均30x的覆盖。
也就是要90G的数据。
这样的测序量，成本大约是一个样本6万多元。
如果样本多的话，费用上可能负担不起。
而外显子只占人全部基因序列的1%，而且是最关键的1%。
把外显子全都测了，就相当于抓住了问题的主要矛盾。
同时测序量大大降低。
这就是用外显子测序来替代全基因重测序的第一个原因。
第二个原因是在做肿瘤测序的时候，肿瘤本身存在着较大异质性。
肿瘤的基因序列是不稳定的，一直在变的，也就是肿瘤的深部、浅部可能其基因序是不一样的。
为了测出各种突变，就需要有较深的测序重度，比如100x、甚至200x的测序深度。
这时候外显子测序就可以做到高的测序覆盖度，同时费用不会太高。
8. 外显子测序样品要求？
1） DNA样本：用TE缓冲液溶解，2 μg以上，260/280比值在1.8-2.0之间，浓度大于50 ng/μl。
2）细胞样本：收获培养的细胞后，去除培养液，立即置于液氮中快速冷冻。
液氮冷冻半小时后，可以转移到-20°C或者-80°C冰箱中保存，运输时使用干冰包装。
3）新鲜冷冻组织：获取新鲜的组织样本后，立即置于液氮中快速冷冻。
液氮冷冻半小时后，可以转移到-20°C或者-80°C冰箱保存，运输时使用干冰包装。
4）石蜡包埋组织：一片H&E染色的病理切片（标记出肿瘤组织区域，肿瘤细胞含量>50%）；5-10片4-5um厚的肿瘤组织石蜡切片（与染色的切片来自同一石蜡组织块，肿瘤组织与染色的切片相吻合）；病人的病理诊断报告（需至少标明肿瘤的类型）；可以在常温条件下运输（防止高温致蜡块融化）。
5）血液样本：1ml新鲜抽取的血液，加抗凝剂（非肝素类）， 4度保存（可维持一周），冰袋运输。