免疫组化实验步骤及配方

免疫组化步骤

1.多聚甲醛灌流取材，多聚甲醛后固定，30%多聚糖溶液沉糖;

2.冰冻切片（1d-14d 脊髓>=20µm;14d-28d>=10µm;DRG d=10µm）

3.0.01M PBS洗10min×3次;

4.1N HCL 暴露抗原30min；

5.去离子水洗，0.01M PBST洗10min×3次；

6.3%双氧水(0.01M PBS配制)洗10min，灭活内源性HRP；

7.0.01M PBST洗10min×3次；

8.5%-10%血清封闭30min（0.01M PBST 配制）；

9.一抗过夜，一抗用PBST稀释；

10.0.01M PBS洗10min×3次，二抗3孵育小时；

11.0.01M PBS洗10min×3次，HRP-亲和素3小时；

12.0.01M PBS洗10min×3次，DAB显色12-18min。

免疫组化常用试剂配制

1. 0.1M PB: 14.5g Na2HPO4·12H2O

500mL H2O

1.5g NaH2PO4·2H2O

2. 0.1M PBS :500mL 0.1M PB

45g NaCl

3. 0.01M PBST:100mL 0.01M PBS

10滴Triton X-100

4. IN HCL: 盐酸：水=1：10

5. 4%多聚甲醛：13.6g KH2PO4

3.6g NaOH

40g 多聚甲醛

1000mL H2O

注：1). 需要60°C加热溶解，过滤使用；

2).多聚甲醛每次比需要多称10g，以弥补后面过滤的损失；

3).现将多聚甲醛溶于1000mL水中，然后一边加热搅拌一

边缓慢加入多聚甲醛的助溶剂NaOH，待NaOH和多聚

甲醛都完全溶解后再加入KH2PO4，溶后过滤备用。

6.DAB液：以0..1M PB配制，DAB浓度0.05%，H2O2浓度0.03%。

注：1). H2O2临用时再加；

2).用DAB染后用0.01M PB洗。

7. 30%蔗糖：150g 蔗糖

500mL 4%多聚甲醛

注：可同时沉糖后固定。

8.封闭液：10%山羊血清（做免疫荧光时另加0.1%BSA）。