枸杞多糖体清除自由基活性研究

第27卷 第5期

2005年10月

三峡大学学报(自然科学版)

J of China T hree Gor ges Univ.(Natural Sciences)

Vol.27N o.5Oct.2005

收稿日期:2005 07 03

作者简介:高春燕(1981-),女,硕士研究生.

枸杞多糖体清除自由基活性研究

高春燕1

田呈瑞1

周 默

2

(1.陕西师范大学食品工程系,西安 710062;2.三峡大学产业集团,湖北宜昌 443002)摘要:采用超氧阴离子自由基体系、羟基自由基体系、烷基自由基引发的亚油酸氧化体系、二苯代苦味肼基自由基DPPH 体系,对枸杞多糖的抗氧化活性进行了研究,并同Vc 进行了比较.结果表明:枸杞多糖对这几种自由基均有不同程度的清除作用,其对超氧阴离子清除作用不明显;清除羟基自由基能力与Vc 相当;在较小浓度时,清除烷基自由基和DPPH 自由基能力弱于V c,但在较高浓度与Vc 接近.

关键词:枸杞多糖; 抗氧化; 自由基

中图分类号:Q539 文献标识码:A 文章编号:1672 948X(2005)05 0456 03

S tudy on Antioxidation Activities of Ch.Wolfberry Polysaccharides

Gao Chunyan 1 T ian Chengrui 1 Zhou M o 2

(1.Department o f Fo od Eng ineer ing,Shanx i Nor mal U niv ,Xi'a n 710062,China; 2.Corporatio n Group of China Three Gorg es U niv ,Yichang 443002,China)

Abstract Using the supero xide radical system ,hydrox yl radical sy stem,oxidation system of linoleic acid in duced by alkyl radical and system o f DPPH ,the antioxidation activities of Ch.Wolfberry po lysaccharides is studied and com pared w ith V c.T he ex perimental results show that the Ch.w olfberry polysaccharide has dif ferent scavenging effect in these r adical systems.T he scavenging capability of Ch.Wolfberry poly saccharides to super ox ide radical is no t obvious,but to hydr oxy l radical is significant and par allel to Vc.Within the low concentration ,the scaveng ing capacity of Ch.w o lfberry poly saccharides to alkyl radical and DPPH is low er than Vc,but w ithin the hig her concentration,is equal to Vc.

Keywords Ch.wo lfberry po lysaccharides; antiox idatio n; free radical 自由基是生物体新陈代谢过程中产生的一类可以单独存在的具有高度氧化活性的带有一个或几个不配对电子的原子团或原子,其化学性质相当活跃.自由基的产生与机体的许多功能障碍和疾病的发生如吞噬、解毒、炎症、肿瘤、衰老、辐射损伤等有密切的关系[1].枸杞子是我国传统的名贵中药材,为茄科植物枸杞(L y cium bar bar um L )的成熟果实,具有滋补肝肾,益精明目之功效.现代临床上广泛用于降血脂、降血糖、保肝、抗肿瘤、抗衰老等.枸杞多糖具有良好的抗氧化活性,已有报道[2],在体外可以直接清除羟自由基,并能抑制自发或由羟自由基引发的脂质过氧

化反应;在体内能提高D 半乳糖致衰老小鼠体内

GSH Px 和超氧化物歧化酶(SOD)活性,从而可以清除过量的自由基,降低M DA 和脂褐素含量,起到抗氧化的作用.以枸杞为原料,通过提取分离纯化得到枸杞多糖,对其清除超氧阴离子自由基、羟基自由基、烷基自由基、DPPH 自由基活性进行了研究,以期为枸杞多糖药物及功能性食品的开发提供依据.

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

枸杞,市售(2004年9月购于西安家世界超市);

二乙基氨基乙基纤维素(DEAE cellulose52),What m an公司;二苯代苦味肼基自由基(2,2 Diphenyl 1 picr ylhydrazyl radical,DPPH ),Sig ma公司;亚油酸(81%),许昌元化生物科技有限公司;硫代巴比妥酸、三羟基甲基氨基甲烷(T ris)、邻苯三酚、水杨酸、钨酸钠等均为国产分析纯.

紫外可见分光光度计,北京普析通用仪器厂;旋转蒸发器RE 52A,上海亚荣生化仪器厂;电热恒温水浴锅,上海医疗器械五厂.

1.2 实验方法

(1)枸杞多糖的制备

枸杞经破碎、加水浸提、抽滤、浓缩、醇沉、洗涤、干燥得枸杞多糖粗品.枸杞多糖粗品溶于水,经过DEAE cellulo se柱层析,硫酸 苯酚法跟踪检测,收集含多糖部分,浓缩,得枸杞多糖纯品.

(2)枸杞多糖含量测定

以葡萄糖为标样,采用改进的硫酸 苯酚法测定总糖浓度[3].

(3)超氧阴离子自由基体系[4]

取0.05m ol/LT ris H Cl缓冲液(pH=8.2)4.5 mL,置于25水浴中预热20min,分别加入1mL试样和0.4mL25m mol/L邻苯三酚溶液,混匀后于25水浴中反应5min,加入8mmo l/L H Cl1mL终止反应,299nm处测定吸光度(A i),空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样品.每个试样作3个平行样,取其平均值.清除率计算公式为

P=A0-A i

A0

!100%(1)式中,A0为空白的吸光度;A i为试样的吸光度.

(4)羟基自由基体系[5]

利用Fenton反应,检测枸杞多糖对羟基自由基( OH)的清除作用.在10m L试管中依次加入饱和水杨酸溶液5mL,0.2m mol/L磷酸缓冲液(pH= 7.4)3mL,3.8mmo l/L Fe2+ EDTA(1∀1)溶液0.5 mL,待测液1mL,最后加入1mL4mmo l/L H2O2启动反应,于25水浴中反应90m in之后,加入1mL6 mol/L H Cl终止反应,再加入0.5g NaCl,4mL冷的乙醚充分混匀,静置后移取上层乙醚于10m L离心管内,于40恒温水浴中蒸干乙醚,然后依次加入10%三氯乙酸(W/V)0.15mL,10%钨酸钠(W/V)0.25 mL,0.5%NaN O2(W/V)0.25mL,放置5m in后,加入1mol/L NaOH0.25mL,滴加去离子水至4mL,混匀.空白对照组以相同体积的蒸馏水代替样液,于510nm处测定吸光度A i.每个试样作3个平行样,取其平均值.清除羟基自由基活性的计算公式同式(1).

(5)烷基自由基引发的亚油酸体系[4]

将5mL乙醇、5m L0.1mol/L磷酸缓冲液(pH =8.0)、1mL试样与0.1mL亚油酸混合,用10W紫外灯的紫外光照射60m in,然后加入4m L三氯乙酸(20%,W/V),1m L硫代巴比妥酸(3%,W/V),95

水浴反应90min,冰浴冷却,离心,于532nm处比色,以相同体积的蒸馏水代替试样作为空白对照.每个试样作3个平行样,取其平均值.清除烷基自由基活性的计算公式同式(1).

(6)DPPH自由基体系[6]

将枸杞多糖和Vc配成等质量浓度的溶液备用,另配制0.16mmo l/L的95%乙醇溶液避光保存.取2 mL待测试样的溶液加入2mL0.16mmol/L DPPH 溶液于25反应15min后,在517nm处测定吸光度A i.以相同体积的蒸馏水代替试样作为空白对照.每个试样作3个平行样,取其平均值.清除DPPH 自由基活性的计算公式

P=1-(A i-A j

A c

)!100%(2)

式中,A i为试样的吸光度;A j为多糖、Vc在测定波长下的吸光度;A c空白的吸光度.

2 结果与分析

2.1 枸杞多糖对超氧阴离子的清除作用

该体系中邻苯三酚在碱性条件下自氧化形成中间产物超氧阴离子自由基,此自由基能促进邻苯三酚的自氧化,因此通过测定某物质对邻苯三酚自氧化的抑制作用,即可表征其对超氧阴离子自由基的清除作用.试验结果表明,在所选质量浓度范围内,随着质量浓度的升高,Vc的清除率略有上升,而枸杞多糖的清除率变化不明显,均低于50%,这说明枸杞多糖对超氧阴离子清除作用不明显.

2.2 枸杞多糖对羟基自由基的清除作用

利用Fenton反应,检测枸杞多糖、Vc对羟基自由基的清除作用,其结果如图1所示.由图可看出,在所选质量浓度范围内,随着质量浓度的增大,Vc、枸杞多糖清除羟基自由基的作用显著,清除率达到50%所需质量浓度(IC50),枸杞多糖、Vc大约都是0.35m g/m L,说明枸杞多糖清除羟基自由基的能力与Vc相当.

2.3 枸杞多糖对烷基自由基的清除作用

枸杞多糖、Vc对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系的抑制作用如图2所示.由图可看出,枸杞多糖、Vc对烷基自由基引发的亚油酸氧化体系均有不同程

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