利用通用引物检测天然宠物饲料中的动物源性成分

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鸡肉粉中猪源性成分的检测分析

养殖与饲料2020年第06期鸡肉粉中猪源性成分的检测分析张文刚姜芹孙冰清张妤顾欣上海市动物疫病预防控制中心，上海201103摘要本研究建立了一种基于实时荧光聚合酶链式反应的鸡肉粉中猪源性成分含量测定方法，以期了解市场上饲料原料鸡肉粉中猪源性成分的含量及其污染情况。

利用该方法对从上海、山东、广东、四川等地收集的61份鸡肉粉样品进行猪源性成分检测。

检测结果显示，61批样品中检出含有猪源性成分的样品15批，检出率为24.6%。

由检测结果可知，市场上鸡肉粉中含有猪源性成分的比例较高，需要加强对饲料原料鸡肉粉中猪源性成分的监管。

关键词鸡肉粉；猪源性成分；PCR收稿日期：2020-03-24张文刚，男，1979年生，硕士，高级畜牧师。

近2年来，由于非洲猪瘟的影响导致鸡肉粉原料中掺假、掺杂猪肉粉现象频发，不仅严重侵害了饲料生产厂家的利益，而且也给非洲猪瘟的防控带来了很大安全隐患。

为切实掌握饲料生产企业鸡肉粉原料中猪源性成分的污染情况，本文对来自宠物食品生产企业、饲料检测机构、企业内部质量检测机构及第三方饲料检测机构提供的61个产品进行了猪源性成分检测分析。

目前，现有的动物源性成分鉴别方法一般只是开展定性检测，结果以阴性或阳性的形式报告，这类检测结果无法区分是污染还是故意掺假所致，无法有效甄别是否存在掺假行为及其严重程度。

因此，开展定量检测技术研究来量化鉴别某一动物源性成分含量十分必要[1-3]。

本研究通过在鸡肉粉中添加不同比例的猪肉粉制作猪源性成分的含量标准曲线，通过标准曲线来确定样品中猪源性成分含量，基本实现了猪源成分的量化鉴别。

1材料与方法1.1材料与试剂检测样品来源于宠物食品生产企业、鸡肉粉生产、销售企业及检测机构；无水乙醇，国药集团试剂有限公司；DNA 提取试剂盒，天根生化科技（北京）有限公司；猪源性检测试剂盒，广州维伯鑫生物科技股份有限公司。

1.2仪器与设备Light Cycler 96型实时荧光PCR 仪，瑞士Roche 公司；涡旋仪，德国Heidolph 公司；AB135-S/FACT 电子分析天平，梅特勒托利多仪器上海有限公司；离心机，美国Thermo Scientific 公司；Nan-odrop 分光光度计，美国Thermo Scientific 公司。

宠物饲料原料品质检测考核试卷

A.植物油
B.动物油
C.鱼油
D.牛脂
8.宠物饲料原料中，以下哪些成分有助于宠物眼睛健康？（）
A.维生素A
B.胡萝卜素
C.硒
D.鱼油
9.以下哪些方法可以用于检测宠物饲料原料中的水分含量？（）
A.烘干法
B.卡尔费休法
C.手感判断法
D.酸碱中和法
10.宠物饲料中，以下哪些成分有助于改善宠物肠道健康？（）
A.益生菌
A.显微镜观察法
B.平板计数法
C.免疫学检测法
D.嗅觉判断法
2.以下哪些原料可以作为宠物饲料的蛋白质来源？（）
A.鸡肉粉
B.玉米
C.大豆
D.鱼肉
3.宠物饲料中的抗氧化剂主要包括以下哪些成分？（）
A.维生素C
B.维生素E
C. BHT
D. BHA
4.以下哪些因素可能影响宠物饲料原料的品质？（）
A.储存条件
2.蛋白质来源包括肉类和豆类，它们是宠物生长和维持组织的基础。脂肪来源包括植物油和动物油，提供能量和必需脂肪酸。
3.霉菌毒素可能导致宠物肝脏损伤、免疫系统抑制和消化系统问题。常用检测方法有高效液相色谱法和酶联免疫吸附法。
4.添加抗氧化剂是为了防止饲料氧化，延长保质期。常用抗氧化剂包括维生素E和BHT，它们通过抑制自由基反应来保护饲料。
5.宠物饲料中的粗纤维含量对宠物的消化系统健康至关重要。（）
6.宠物饲料中的所有矿物质元素都可以从饲料原料中自然获取，无需额外添加。（）
7.任何类型的油脂都可以作为宠物饲料的脂肪来源。（）
8.宠物饲料原料中的微生物污染可以通过嗅觉来判断。（）
9.在宠物饲料原料品质检测中，不需要检测饲料中的维生素含量。（）

变性高效液相色谱高通量检测动物源性饲料中沙门氏菌和志贺氏菌

量成倍增加．同时由于两者增菌时间（门氏菌１沙８
２、贺氏菌６８ｈ不相同．检验工作带来一定４ｈ志～）给麻烦。曾有研究报道．选择合适的可同时用作沙门氏菌、志贺氏菌增菌的通用增菌液．提高实验室的工对
沙门氏菌ＰＲＤＰＣ检测的引物序列：ＧＧＣ —ＨＬ５一Ｔ
ＡＡＡｒｒＴＣＧＡＣＣＡＣＧＴＴＣＧＧＧＣＡＡ一３５－ＴＣＡ．＂
ＴＧＣＣＣＴＣＡＡＧＡ方法，在此基础上采用ＰＲ结合高效液相色谱Ｃ
基因扩增仪．国ＡＩ司生产：性高效液相美Ｂ公变简ＨＬ，ｒｎｇｎｍｃ曹际娟，辽宁省出入境检验检疫局，究员，研博士，１０５色谱（称ＤＰＣ）美国Ｔａｓｅｏｉ公司生产。１６１，
本研究所用标准菌株均购自美国典型菌种保藏中心（ＴＣ和中国医学微生物菌种保藏管理中心ＡＣ（ＭＣＣＣ．其它菌株为本实验室和其它检验检疫局实
１１培养基和试剂．２．
详检验所用的增菌液不同．即使是对同一份标本也只能验室分离鉴定获得的分离株，见表１分别增菌、分别划线分离、别鉴定，分使实验室的工作
ＧｎｍｉＤＡＥｔｃ０ｉ及Ｅａ『ｅｏｃＮｘｒｔｎｔａｉｋ）ｘＣＴ等试剂购自大连
某公司三乙胺乙酰盐（ＥＡ，ＴＡ色谱纯）白Ｔａｓｅ购ｒｎｇ —

核酸提取试剂盒对饲料中牛羊源性成分检测的影响

核酸提取试剂盒对饲料中牛羊源性成分检测的影响
李泰;朱英才;骆璐;彭强;凌洪权;廖星杰;王钦;张承双
【期刊名称】《粮食与饲料工业》
【年(卷),期】2024()1
【摘要】实时荧光聚合酶链反应法(荧光PCR法)是目前饲料中牛羊源性成分的定性检测中常用方法之一。

为了熟练操作和掌握这个方法,使得实验室工作人员在做饲料中牛羊源性成分定性这类检测时能有一个清晰的认识,通过核酸提取试剂盒的选取及平行实验比对,对此进行了阐释。

【总页数】2页(P70-71)
【作者】李泰;朱英才;骆璐;彭强;凌洪权;廖星杰;王钦;张承双
【作者单位】重庆市动物疫病预防控制中心
【正文语种】中文
【中图分类】S816.17
【相关文献】
1.牛羊源性成分核酸检测（PCR-荧光探针法）
2.新疆反刍动物饲料和动物源性饲料中牛羊源成分检测
3.陕西省反刍动物饲料产品和动物源性饲料中牛羊源成分检测
4.用分子生物学方法鉴别检测动物源性饲料中的牛羊源性成分
5.肉及肉制品牛源性成分核酸检测试剂盒评价技术的研究
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一种鉴别8种动物源性成分的PCR引物及试剂盒[发明专利]

专利名称：一种鉴别8种动物源性成分的PCR引物及试剂盒专利类型：发明专利
发明人：薛超波,管峰,顾佳瑛,黄朱梁,林昕,徐爱春
申请号：CN201510443899.9
申请日：20150725
公开号：CN104946788A
公开日：
20150930
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种鉴别8种动物源性成分的PCR引物及试剂盒，可以在一次PCR中同时鉴定山羊、绵羊、水牛、家牛、猪、鹿、骆驼和牦牛共8种动物源性成分。

本发明的引物的核苷酸序列为SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2。

本发明引物的特异性强，设备要求不高，能在一次PCR中同时检测8种动物源性成分，能用于肉类及其产制品的掺假检测和动物源性成分的溯源鉴定，方法简单，提高了检测效率。

申请人：舟山市食品药品检验检测研究院,中国计量学院
地址：316021 浙江省舟山市新城区千岛路257号
国籍：CN
代理机构：北京科亿知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：汤东凤
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动物源鉴别技术

动物源鉴别技术一、引言动物源鉴别技术是指通过科学手段对动物及其产品的来源进行鉴别的一种技术。

随着人们对食品安全和环境保护的关注度日益提高，动物源鉴别技术的重要性逐渐凸显。

本文将介绍动物源鉴别技术的原理、方法和应用。

二、动物源鉴别技术的原理动物源鉴别技术的原理主要基于动物个体之间的遗传差异和生物化学差异。

通过对DNA序列、蛋白质组学、微生物组学等方面的研究，可以确定动物个体的种属和亲缘关系，从而实现对动物源的鉴别。

1. DNA序列鉴别技术DNA序列鉴别技术是目前应用最广泛的动物源鉴别技术之一。

通过对动物个体的DNA序列进行比对和分析，可以确定其种属和亲缘关系。

常用的DNA序列鉴别技术包括PCR-RFLP、DNA条形码和SNP分析等。

2. 蛋白质组学鉴别技术蛋白质组学鉴别技术是通过对动物个体的蛋白质组进行分析，确定其种属和亲缘关系。

这种技术主要利用质谱仪等仪器对蛋白质进行检测和鉴定，从而实现对动物源的鉴别。

3. 微生物组学鉴别技术微生物组学鉴别技术是通过对动物个体的微生物群落进行分析，确定其种属和亲缘关系。

这种技术主要利用高通量测序技术对微生物DNA进行测序，从而实现对动物源的鉴别。

三、动物源鉴别技术的方法动物源鉴别技术的方法主要包括样品采集、DNA提取、PCR扩增、测序和数据分析等步骤。

1. 样品采集样品采集是动物源鉴别技术的第一步，需要选择适当的样品来进行分析。

常用的样品包括动物组织、血液、毛发、鳞片等。

采集样品时要注意避免污染和交叉污染。

2. DNA提取DNA提取是动物源鉴别技术的关键步骤，需要将样品中的DNA分离和纯化。

常用的DNA提取方法包括酚氯仿法、磁珠法和商用DNA提取试剂盒法等。

3. PCR扩增PCR扩增是动物源鉴别技术的核心步骤，通过特定的引物选择性地扩增目标DNA片段。

常用的PCR扩增方法包括常规PCR、实时荧光PCR和多重PCR等。

4. 测序和数据分析测序是动物源鉴别技术的关键步骤，需要将扩增的DNA片段进行测序。

动物源性成分

饲料中动物源性成分检测技术研究进展摘要:饲料安全与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。

动物废弃物进入饲料行业曾经弥补了蛋白质饲料不足的缺口,但却带来了新的问题。

饲料中动物源性成分的定性或定量检测技术已成为国内外的研究热点，适用于各种样品、基于各种原理的方法和技术被开发出来。

本文以组织学特征为基础的显微镜分析方法、以蛋白质和DNA为基础的免疫学和PCR分析方法、高效液相色谱法和近红外光谱法在动物源性饲料组分中的研究应用进展等方面做了综述,并对其发展趋势进行讨论。

饲料安全已与动物生产、环境污染和人类健康密切相关。

动物源性副产品因富含蛋白质、钙、磷等营养成分而被应用于畜禽饲料中, 但现有的证据表明, 在动物饲料中添加未经加热处理牛源性饲料或感染过痒病因子的牛( 羊) 肉/ 肉骨粉( MBM) 后能够引发和传播疯牛病( BSE)。

我国于1999、2001和2004年先后下发了关于对动物源性饲料生产和管理的相关条例, 主要对反刍动物源性饲料组分、MBM、肉粉、骨粉、血粉、动物内脏干粉和动物废弃物等使用做了严格的规定。

目前关于饲料中动物源性成分检测主要以样品的组织学特性和品种特异性的生物标记物( 如蛋白质、DNA和其他生物大分子等) 为对象, 其中PCR技术发展迅速, 已逐步被世界各国采用。

但由于动物源性饲料组成上的复杂性, 单一的PCR技术仍不能克服耗时、效率低和假阳性等问题。

因此,研究并建立一种( 套) 快速、灵敏、可靠的动物源性饲料检测技术, 对于提高饲料质量、防止饲料掺假、控制进口饲料安全和制订相关饲料法规等均具有重要意义。

本文中动物源性成分是指动物组织以及蛋和奶，包括肉类及其制品(含动物脏器)、水生动物产品等，检测技术是指上述成分中蛋白质和DNA等具有种间特异性物质的物种鉴定和含量分析技术。

该技术已成为保护消费者权益和安全的重要技术手段。

动物源性成分检测技术通常建立在对样品蛋白质、DNA、脂肪酸等分子结构、序列或组成特异性分析的基础上。

PCR－核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分

PCR－核酸试纸条法快速检测鸽子源性成分田卓;曹际娟;崔妍;赵良娟;李宗梦【摘要】Objective] In order to improve the efficiency of detecting ingredients of animal origin, the PCR-nucleic acid strip rapid detection technology system was established.[ Method] In view of the species specific DNA sequences, primers were designed and marked;the PCR re-action system was established and optimized; the results were interpretated by the nucleic acid strip.[ Result] The results showed that: the PCR-nucleic acid strip is high specificity;absolute sensitivity is 0.001 3ng/μL;the actual sensitivity in mixed samples is 0.01%;the actual sensitivity in processing sample is 0.1%;the detection rate of minimum detection limit is 100%, the stability is good.[Conclusion] To sum up, the high sensitivity as PCR and high specfticity as immunology made the PCR-chromatography strip valuable for the rapid detection method.%[目的]提高动物源性成分检测效率，建立PCR－核酸试纸条快速检测技术体系。

肉及肉制品中动物源性成分常见检测方法研究进展

3 分子生物学检测方法
与基于蛋白质的方法相比，基于 D N A 的检测方法通常被认为更灵敏、可靠，因为 D N A 在高温下相对稳定，并且存在于大多数细胞中，而大多数蛋白质在加工过程中失去了它们的生物活性 I20"2% 近年来，以分子生物学为基础的检验方法高速发展起来，各种动物源性成分的检验检测技术相继涌现，如聚合酶链式反应技术、实时荧光定量 P C R 技术、多重 P C R 技术、核酸印迹法、环介导等温扩增技术、限制性片段长度多态性聚合酶链式反应、基于分子杂交的基因芯片技术、微滴数字 P C R 方法和 D N A 条形码技术 3.1 实时荧光定量 P C R 技术
肉及肉制品中动物源性成分的鉴定方法很多，如近红外光谱法、酶联免疫法、聚合酶链式反应等。自P C R 技术被广泛应用于肉及肉制品中动物源性成分的测定以来，基于 D N A 的 P C R 分析技术也在不断发展，如环介导等温扩增技术、A F L P (扩增片段长度多态性 ) 标记法、P C R - R F L P (限制性片段长度多态性）技术、实时荧光 P C R 技术、基因芯片技术和 D N A 条形码技术等。本文综合论述了目前肉及肉制品中动物源性成分的检测技术，并对有应用前景的新技术做了简要阐述。

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用

饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR检测方法及其应用罗家琴;王加启;卜登攀;李旦;王丽;魏宏阳;周凌云【期刊名称】《中国农业科学》【年(卷),期】2008(041)007【摘要】[目的]建立鉴定饲料中牛、羊、猪、鸡源性成分的PCR方法,进一步完善现有的动物源性饲料检测方法.[方法]根据牛、羊、猪、鸡、鱼以及马的mtDNA的16S rRNA基因序列选用了一对通用引物,初步检测出含有动物源性成分的样品;然后针对牛、羊、猪,鸡4种动物线粒体mtDNA中的保守序列,分别选用了4对特异性引物对检测出的样品进行PCR扩增,扩增的目的片段大小分别为271、274、149和266 bp.[结果]通过利用通用引物、优化PCR反应体系及其条件,建立了从未知样品中简便而快速的检测出是否含有动物源性成分的PCR方法;利用所选的针对不同动物的特异性引物,建立了鉴定牛、羊、猪、鸡这4种动物源性成分的方法,此方法最低检测限可达0.1%.[结论]建立的检测饲料中动物源性成分的方法操作简便,价格低廉,结果准确,可靠,可作为饲料中动物源性成分的鉴定方法之一.【总页数】8页(P2112-2119)【作者】罗家琴;王加启;卜登攀;李旦;王丽;魏宏阳;周凌云【作者单位】中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094;中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094;中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094;中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094;中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094;中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094;中国农业科学研究院北京畜牧兽医研究所恸物营养学国家重点实验室/侬业部奶及奶制品质量监督检测测试中心,北京100094【正文语种】中文【中图分类】S8【相关文献】1.进口饲料中牛、羊源成分的PCR同时检测方法 [J], 闻伟刚;赵秀玲;贺水山;杜华宏;黄绍棠2.种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分 [J], 张媛媛;孟镇;仇凯;东思源;武竹英;郭新光;钟其顶3.应用两种PCR方法检测饲料中牛、羊源性成分 [J], 金凌艳;顾欣;蔡金华;刘雅妮4.动物源性饲料中牛源和羊源性成分的检测方法 [J], 冯秀燕;董红霞;魏秀莲;杨宝良;王有月5.动物产品及饲料中牛源和羊源性成分PCR检测方法的优化 [J], 邵碧英;张体银;杨婕;陈文炳;郑腾因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

基因芯片法鉴别饲料中猪、牛、鸡和鸭等动物源性成分分析

3 讨论
近年来，基因芯片检测技术发展迅速，应用潜力巨大，并开始应用到了生物成分检测中。其应用的优势体现在高通量、高灵敏度、高精度、高效率等方面，显示出良好的应用前景[11]。本研究主要分析了基因芯片法对饲料中动物源性成分检测的应用，并通过 PCR 结合基因芯片技术完成了检测的过程，达到了较好的检测效果。由此可知，在饲料中的动物源性成分检测中可以采用基因芯片检测方法，且基因芯片检测法在检测的效率以及精度上均可以满足实际检测的要求。
饲养饲料 Husbandry and Forage
2021 年第 3 期
检测是否可以达到较高的灵敏度要求。试验中选择的反应模板主要是 5 μL 猪、鸭 DNA 溶液，二者含有的DNA 依次为 5 000 pg、 500 pg、 50 pg、 5 pg、 0.5 pg、 0.05 pg，对应着图中所示的序号为 1～6。在 PCR 扩增完成后进行杂交反应，特异性结合位点信号随 DNA 浓度的降低而不断变弱（图 4），即二者体现出一定的正相关性。根据最终得到的试验结果可知，杂交信号的强弱与 2 种材料的强弱直接相关，在二者含量为 10-6 时，没有形成杂交信号；而达到 10-5 的含量时，形成了杂交信号，但是并不显著。所以可以认为检测的灵敏度达到了 10-5。
采用的试剂主要如下：Ex Taq DNA 聚合酶、DNA Marker DL 2 000 等来自于生工生物工程（上海）股份有限公司；核酸杂交液来自于南京森贝伽生物科技有限公司；DNA 提取试剂来自天根生化科技（北京）有限公司；醛基化 DNA 芯片基片等来自北京博奥晶典生物技术有限公司。
2021 年第 3 期
Husbandry and Forage 饲养饲料

实时荧光PCR法检测动物源性成分的定性方法验证

QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING
质量安全与检验检测Vol.31 No.2 2021年第2期
米、大豆、花生均为超市购买。
2.2主要试剂
动物源性植物饲料基因组DNA提取试剂盒
（DP323-02）（天根生化）。
鸡种特异性基因测定试剂盒（荧光PCR法）（上海之江）。
2021 年第 2 期 Vol.31 No.2
质量安全与检验检测 QUALITY SAFETY INSPECTION AND TESTING
实时荧光PCR法检测动物源性成分的定性方法验证
徐美鑫张澜相茂花
(日照市场监管检验检测中心山东日照276800)
摘要本文以鸡源性成分为例，研究了 GB/T 38164-2019《常见畜禽动物源性成分检测方法实时荧光PCR法》的定性方法验证，以证明该方法的可行性及适用性，以期为基因扩增检测领域的方法验证工作提供参考。验证参数为DNA提取效果评价、重复性、检出限和基质效应。结果显示,DNA提取效果良好，不存在抑制剂；该方法重复性较好；基质效应无影响；检出限为0.1%。各参数均满足标准的要求，该方法具有较好的可行性及适用性。
与验证指南》要求，并参考RB/T 004-2019《转基因
检测方法验证指南＞[2],以鸡源性成分为例研究GB
38164-2019《常见畜禽动物源性成分》方法验证，验
证了该方法的DNA提取效果评价、重复性、检出限
和基质效应。
3.2 DNA提取质量
使用DNA提取试剂盒对现杀整鸡进行DNA提
取,PCR体系配制及反应参数按照鸡种特异性基因测定试剂盒进行操作。
注:பைடு நூலகம்D—未检出
4.3检出限通过量化样品中核酸的最小检测量来评估检出

一株猪源豕链球菌的分离鉴定

一株猪源豕链球菌的分离鉴定陈煜;吴达;孙敏;王楷宬;邓明俊;吴振兴;岳志芹;郑小龙;孙涛【摘要】从一头痛死猪分离到一株疑似猪链球菌的菌株,通过生化鉴定、链球菌血清学分群、猪链球菌的血清学分型、PCR鉴定排除了是猪链球菌的可能.应用16 S rDNA的通用引物27F和1492R对可疑菌的核酸扩增、测序及序列比对表明,所分离到的菌株与豕链球菌具有98％的同源性,因此判断为豕链球菌.小鼠感染试验显示,感染的小鼠没有明显的发病症状,且2周后仍正常存活,因此认为所分离的豕链球菌不具有致病性或具有较弱的致病性.【期刊名称】《动物医学进展》【年(卷),期】2012(033)012【总页数】5页(P219-223)【关键词】豕链球菌;分离鉴定;致病性分析【作者】陈煜;吴达;孙敏;王楷宬;邓明俊;吴振兴;岳志芹;郑小龙;孙涛【作者单位】山东出入境检验检疫局,山东青岛266002【正文语种】中文【中图分类】S852.611链球菌科包括2个属，链球菌属和乳球菌属，链球菌属包括89种链球菌，豕链球菌和猪链球菌同属于链球菌属。

Collins于1984年将豕链球菌归入兰氏血清群E、P、V、U以及其他3个抗原群，即C1、5916T和7155A，豕链球菌的模式株包括NTCC10999、SS-1029和 ATCC43138［1］。

而猪链球菌的血清群包括C、D、E和L群，在血清学上两者可能存在交叉反应。

两者在生长表现及形态学上非常相似，即在血琼脂平板上菌落都为光滑、圆润的呈现明显的β型溶血，在普通光学显微镜下，经革兰染色后都表现为革兰阳性、长短不一的球菌。

据报道，豕链球菌通常与猪的化脓性感染有关，如子宫颈淋巴管炎、脓肿、肺炎、败血症和心内膜炎［2］。

有报道称该菌可引起猪流产［3-4］。

据报道从健康猪也能分离到该菌［5］。

从女性的生殖系统可分离到该菌［6］，作为致病菌，主要感染女性的生殖系统［7］，可引起死胎［8］。

也有该菌引起皮肤外伤感染的报道［9］。

种属特异性PCR法鉴别罐头食品中猪、牛、羊、鸡、鸭源性成分

164㊀2021Vol.47No.3(Total 423)DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.024477引用格式:张媛媛,孟镇,仇凯,等.种属特异性PCR 法鉴别罐头食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭源性成分[J].食品与发酵工业,2021,47(3):164-169.ZHANG Yuanyuan,MENG Zhen,QIU Kai,et al.Species-specific PCR method to identify animal-derived in-gredients of pork,beef,mutton,chicken and duck in canned food [J].Food and Fermentation Industries,2021,47(3):164-169.种属特异性PCR 法鉴别罐头食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭源性成分张媛媛1,2,孟镇1,2∗,仇凯1,2∗,东思源1,2,武竹英1,2,郭新光1,2,钟其顶1,21(中国食品发酵工业研究院有限公司,北京,100015)2(全国食品发酵标准化中心,北京,100015)摘㊀要㊀建立适用于肉类罐头等长时间高温加工食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源成分种属特异性PCR 鉴别方法㊂通过使用猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭的种属特异性引物,对5种动物的总DNA 模板进行PCR 扩增,得到分别为212㊁147㊁202㊁131㊁201bp 的扩增产物,将测序结果在美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotech-nology Information ,NCBI )进行BLAST 比对确认实验的准确性,并对市售罐头样品进行检测㊂该方法5种动物引物种属特异性良好,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%㊂在对市售肉类罐头样品的检测中,6.6%样品与标签标注结果不符㊂该方法操作简便,成本低,结果准确可靠,可广泛用于肉类罐头食品和长时间高温加工食品中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源成分的鉴别,具有十分广泛的实际应用价值㊂关键词㊀肉类罐头;肉类掺假;线粒体;动物源性成分;食品真实性;种属特异性PCR第一作者:硕士研究生(孟镇高级工程师和仇凯高级工程师为共同通讯作者,E-mail:syaufood@;ufoqk@)㊀㊀基金项目:国家重点研发计划(2019YFC1605202,2018YFC1603203)收稿日期:2020-05-18,改回日期:2020-08-06㊀㊀随着食品供应链的全球化和复杂化,市场竞争日益激烈,食品欺诈问题日渐突出,其中肉制品掺假现象层出不穷㊂一些不法商贩在利益驱使下,为了获得不法利润,利用掺假等恶劣手段,将低价格肉类掺杂到高价肉中,以假乱真㊁以次充好扰乱市场秩序,侵犯消费者权益,甚至涉及到宗教信仰问题㊂这些现象在国内外常有发生[1-6]㊂肉类罐头食品因其品种繁多㊁口味较好㊁便携㊁储存时间长等特点而深受广大消费者的喜爱,但由于经过了斩拌㊁调味㊁高温加工等处理[7-9],普通消费者难以通过感官分辨掺假肉,执法部门在取证过程中同样缺乏简便有效的鉴别手段㊂目前我国对于生鲜肉类食品及一般热加工肉类食品的检测方法及标准趋于完善,但对于罐头食品这种深度热加工食品的动物源成分鉴别研究很少,因此建立一种快速㊁准确鉴定肉类罐头食品中动物源性成分的方法非常有必要[10-11]㊂目前,常见的肉制品掺假鉴别方法主要有蛋白质鉴别酶联免疫吸附法(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)㊁等电聚焦(isoelectric focusing,IEF)㊁高效液相色谱(HPLC)和核酸检测法[12-17]㊂不同物种间核酸极强的特异性,使得核酸检测方法具有特异性强㊁灵敏度高㊁结果准确的特点㊂种属特异性PCR 技术则是应用核酸在不同物种间具有极强的特异性这一特点,根据扩增的目的基因设计高特异性引物,扩增出物种特有的目的片段,此技术被广泛地应用于生鲜肉及加工肉制品[18-21]的动物源性成分掺假的鉴别㊂本研究在国内首次以肉类罐头食品为研究对象,建立了适用于长时间高温加工食品中主要的5种动物源成分鉴别方法㊂针对肉类罐头食品经过长时间高温加工导致DNA 片段化严重的实际情况,从线粒体DNA 入手,根据不同物种之间线粒体DNA 的差异,从数据库中筛选出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种常用肉类的特异性扩增引物,建立一种快速㊁准确的鉴别肉类罐头及其他经过长时间高温处理的食品中动物源成分的方法,并对我国市售肉类罐头产品进行了检测,初步调查了我国肉类罐头产品的动物源真实性情况,为其在动物源性食品真实性鉴别的标准化中的应用奠定了坚实的基础㊂1㊀材料与方法1.1㊀实验材料新鲜猪肉㊁牛肉㊁羊肉㊁鸡肉㊁鸭肉,北京市超市和农贸市场;20个不同种类㊁不同加工工艺和不同源性成分的罐头样品,市售样品㊂1.2㊀试剂dNTP㊁10ˑPCR缓冲液㊁Taq DNA聚合酶㊁100 bp ladder DNA marker等,北京全式金生物技术有限公司;异硫氰酸胍法裂解液[5mol/L GuSCN㊁0.05 mol/L Tris-HCl(pH8.0)㊁体积分数1.3%Triton-X 100,0.02mol/L EDTA(pH8.0)]㊁V(氯仿)ʒV(异戊醇)=24ʒ1㊁TE缓冲液(0.01mol/L Tris㊁0.001mol/L EDTA,pH8.0)㊁异丙醇㊁无水乙醇,上海生物工程有限公司㊂1.3㊀主要仪器冷冻离心机,美国Sigma公司;Tgradient PCR扩增仪,德国Biometra公司;DYY-8C型高压电泳仪,北京六一仪器厂;CV-1000型凝胶成像系统,法国VIBER LOURMAT公司;pHSJ-4A型实验pH计,上海科学仪器有限公司;TMS1500恒温混匀仪,北京莱普特科学仪器有限公司㊂1.4㊀实验方法1.4.1㊀引物根据文献筛选猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭线粒体DNA种属特异性引物,交由上海生工生物工程技术服务有限公司合成,各引物终浓度均为10mol/L,引物序列见表1㊂表1㊀种属特异性引物Table1㊀Species-specific primers物种引物序列(5ᶄ-3ᶄ)片段大小/bp退火温度/ħ参考文献猪F:GCCTAAATCTCCCCTCAATGCTA21256[22]R:ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG牛F:CACAATCCAGAACTGACAC14756[23]R:GATGGCTTGGGAATAGTACGA羊F:CCTCCAACAGTGAATACTT20256[23]R:TCCTCCTCATAAAGGAATGGCC鸡F:CTATAATCGATAATCCACGATTCA13163[24]R:CTTGACCTGTCTTATTAGCGAGG鸭F:CATCTATCCTGCTAGCCGCC20158[25]R:TTGAGTGGAAGAATGCC1.4.2㊀高温加工肉类模拟样品的制备为确保检测方法对深加工食品检测的可行性,将鲜猪肉㊁鲜牛肉㊁鲜羊肉㊁鲜鸡肉㊁鲜鸭肉分别在灭菌锅中121ħ高温处理30min,模拟肉类高温加工过程㊂1.4.3㊀DNA模板的提取根据前期实验室对于肉类罐头食品中总DNA提取方法的研究,DNA模板选用异硫氰酸胍法进行提取[26]㊂1.4.4㊀PCR扩增PCR反应采用25μL体系:10ˑPCR buffer2.5μL,dNTP(2.5mmol/L)2μL,20pmol/μL引物各1μL,模板DNA1μL,Taq DNA聚合酶0.3μL (1.5U),MgSO4(50mmol/L)1μL,双蒸水补足体积㊂扩增条件为:94ħ3min,94ħ30s,57ħ30s, 72ħ30s,35个循环,72ħ5min㊂扩增产物采用2%琼脂糖凝胶电泳检测㊂1.4.5㊀引物特异性试验分别以高温加工的猪肉㊁牛肉㊁羊肉㊁鸡肉㊁鸭肉5种高温加工肉类样品总DNA为扩增模板,使用种属特异性引物对上述各种DNA进行PCR扩增反应,同时设立以H2O为模板的空白对照,评价方法的特异性㊂1.4.6㊀灵敏性试验为了验证该方法的灵敏性,分别将高温加工的各种动物样品用高温加工的鸡肉进行混合稀释,分别制备出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭肉成分占5%㊁2.5%㊁1%(质量分数)的样品㊂将上述样品充分混匀,提取DNA,进行动物源性成分灵敏性检测㊂1.4.7㊀市售罐头样品检测将20个市售肉类罐头样品进行PCR扩增,扩增产物用2%的琼脂糖凝胶电泳检测,并将检测合格的PCR纯化产物送往上海生工生物科技有限公司进行测序,然后通过Chromas软件对其峰值图进行查看㊂1.4.8㊀数据处理运用美国国家生物技术信息中心(US National Center for Biotechnology Information,NCBI)的BLAST 程序,把样品的PCR产物测序结果与GenBank数据库中所收录的基因片段进行比对,从而保证PCR扩增的正确性㊂2㊀结果与分析2.1㊀特异性试验结果分别使用5种动物源性成分特异性引物对,以制备的猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种高温加工肉类样品总DNA 为模板,进行PCR扩增反应,琼脂糖凝胶电泳结果如图1所示㊂5种动物源性成分猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭出现相符的目标条带,而其他动物基因组DNA及空白对照均无条带出现,也无非特异性条带,说明此方法具有较好的特异性㊂2.2㊀引物灵敏性试验结果分别以猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭肉占比为5%㊁2.5%㊁1%的样品提取的总DNA为扩增模板,使用种属特异性引物进行PCR扩增,琼脂糖凝胶电泳结果如图2所示㊂不同成分含量为1%的样品对应泳道仍有明显条带,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达2021年第47卷第3期(总第423期)165㊀166㊀2021Vol.47No.3(Total 423)1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%㊂说明5种动物源性成分检测灵敏度可达到1%㊂在实际市场中,1%廉价肉的掺杂对于商贩来说毫无利润,因此检测限足够低,完全满足检测要求㊂a-猪引物的特异性;b-牛引物的特异性;c-羊引物的特异性;d-鸡引物的特异性;e-鸭引物的特异性M-marker;1-猪肉(121ħ30min);2-牛肉(121ħ30min);3-羊肉(121ħ30min);4-鸡肉(121ħ30min);5-鸭肉(121ħ30min);6-空白对照图1㊀特异性试验琼脂糖凝胶电泳图Fig.1㊀Specific electrophoresis agarose gel electrophoresisa-猪源性成分;b-牛源性成分;c-羊源性成分;d-鸡源性成分;e-鸭源性成分M-marker;1-5%肉模拟罐头;2-2.5%肉模拟罐头;3-1%肉模拟罐头;4-空白对照(双蒸水)图2㊀灵敏性试验琼脂糖凝胶电泳图Fig.2㊀Agar gel electrophoresis of sensitivity test2021年第47卷第3期(总第423期)167㊀2.3㊀市售罐头样品检测结果以市售的罐头试样为检测对象,使用种属特异性引物对其DNA 模板进行PCR 扩增,PCR 扩增结果如图3所示㊂所有样品均扩增出特异性条带,且条带清晰整齐,亮度较大,空白对照为阴性㊂将上述PCR 产物进行测序,测序结果在NCBI 上进行BLAST 比对,比对结果见表2㊂通过对20个市售肉类罐头样品进行检测,发现除15#和16#猪肝午餐肉罐头和午餐肉罐头外,所有样品检测结果均与标签标注相一致,6.6%的样品标签标注成分与检测结果不符㊂15#和16#除检测出标签标注成分外,还检测出鸡源性成分,使用其他方法对其进行检测,均检测出鸡源性成分,考虑可能是由于生产过程中的污染或食品中添加鸡精等导致㊂本方法适用于肉类罐头中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种动物源性成分的检测,且结果准确可靠,具有实际应用价值㊂a-猪源性成分的检测;b-牛源性成分的检测;c-羊源性成分的检测;d-鸡源性成分的检测e-鸭源性成分的检测M-marker;1-阳性对照;2-空白对照;3-红烧猪肉罐头;4-清蒸猪肉罐头;5-午餐肉罐头(清淡味);6-干崩羊肉罐头;7-咸牛肉罐头;8-五香肉丁罐头;9-火腿猪肉罐头;10-午餐肉;11-午餐肉罐头;12-回锅肉罐头;13-红烧猪肉罐头;14-火锅午餐肉罐头;15-普云午;16-高金午餐肉;17-猪肝午餐肉罐头;18-午餐肉罐头;19-精品红烧猪肉罐头;20-粉蒸肉罐头;21-火腿午餐肉罐头;22-云腿大片罐头图3㊀市售肉类罐头样品琼脂糖凝胶电泳图Fig.3㊀Agarose gel electrophoresis of canned meat samples表2㊀肉类罐头样品中动物源性成分检测结果Table 2㊀Test results of animal derived components in canned meat samples编号商品名称相似序列相似度/%鉴别结果标称原料检测结果1红烧猪肉罐头KJ746663.183Sus scrofa 猪猪2清蒸猪肉罐头KY964306.185Sus scrofa 猪猪3午餐肉罐头(清淡味)KJ746663.179Sus scrofa猪猪4干崩羊肉罐头LS992617.189Capra aegagrus 山羊肉山羊5咸牛肉罐头MK058749.1MK028749.18996Bos taurus Gallus牛肉㊁鸡骨泥牛㊁鸡168㊀2021Vol.47No.3(Total 423)续表2编号商品名称相似序列相似度/%鉴别结果标称原料检测结果6五香肉丁罐头KY964306.193Sus scrofa 猪猪7火腿猪肉罐头MF183224.181Sus scrofa 猪猪8午餐肉MF183224.180Sus scrofa 猪猪9午餐肉罐头KY964306.181Sus scrofa 猪猪10回锅肉罐头MF183224.191Sus scrofa 猪猪11红烧猪肉KY964306.187Susscrofa猪猪12火锅午餐肉罐头KJ746663.1MH879470.18698Sus scrofa Gallus 猪㊁鸡猪㊁鸡13午餐肉罐头MF183224.180Sus scrofa 猪猪14高金午餐肉KF971862.1MH879470.18999Sus scrofa Gallus 猪㊁鸡猪㊁鸡15猪肝午餐肉罐头KF971862.1MH879470.18999Sus scrofa Gallus 猪猪㊁鸡16午餐肉罐头KJ746663.1MH879470.19098Sus scrofa Gallus 猪猪㊁鸡17精品红烧猪肉罐头KJ746663.192Sus scrofa 猪猪18粉蒸肉罐头KJ746663.195Sus scrofa 猪猪19火腿午餐肉罐头KJ746663.187Sus scrofa 猪猪20云腿大片罐头KJ746663.192Susscrofa猪猪3㊀结论本研究根据不同物种之间线粒体DNA 的差异,从数据库中筛选出猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭5种常用肉类的特异性扩增引物,建立了种属特异性PCR 鉴别肉类罐头中猪㊁牛㊁羊㊁鸡㊁鸭成分的方法㊂结果表明,该方法使用的5种引物种属特异性良好,对猪㊁牛㊁羊㊁鸭源性成分的检测灵敏度可达1%,对鸡源性成分的检测灵敏度为2.5%,完全满足实际市场掺入量1%的要求,并成功应用于市售肉类罐头样品的掺假检测㊂该方法操作简便,检测成本低,结果准确可靠,具有实际应用价值,适用于高温高压加工的肉类罐头样品的掺假鉴别,可以作为肉类罐头市场监督和检验鉴别的可行性办法,为实现深加工肉类产品消费市场健康发展,维护消费者权益提供了科学的依据㊂参考文献[1]㊀BALLIN N Z,VOGENSEN F K,KARLSSON A H.Species determi-nation-can we detect and quantify meat adulteration?[J].Meat Sci-ence,2009,83(2):165-174.[2]㊀WANG R F,MYERS M J,CAMPBELL W,et 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Moreover,the sequencing results were verified by using the BLAST comparison on NCBI to confirm the accuracy of the experiment,and the commercially available canned samples were also been tested.In this method,the five animal introduced species have good specifici-ty,the detection sensitivity for derived components of pork,beef,mutton and duck could reach1%,and the detection sensitivity for chicken-derived components was2.5%.After testing the commercially available samples,it was clear that in6.6%of the samples,the actual composition did not match the label.This method was easy to operate,low in cost,accurate,reliable,which could be widely used in the identification of five animal-derived components of pigs,cattle,sheep,chickens and ducks in canned meat and long-term high-tem-perature processed foods.Above all,it had extensive value in applications.Key words㊀canned meat;adulterated meat;mitochondria;animal-derived ingredient;food authenticity;species-specific PCR2021年第47卷第3期(总第423期)169㊀。

一种检测猪源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用[发明专利]

专利名称：一种检测猪源性成分的引物对和探针及其试剂盒和应用
专利类型：发明专利
发明人：林丽云,林敏,刘谋泉,王忠合,庄沛锐,陈楚锐,郑玉忠,杨培奎,黄慧莹
申请号：CN202110178668.5
申请日：20210208
公开号：CN112760388A
公开日：
20210507
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种检测猪源性成分的引物对和探针，并公开了根据该引物对和探针设计的试剂盒，该试剂盒包括RAA反应体系和LFD试纸条；所述RAA反应体系包括RAA反应通用干粉、Tris‑HCl缓冲液、上游引物ZHU‑F、下游引物ZHU‑R、探针ZHU‑PRO、样品DNA提取液、MgAcO、ddHO；所述LFD试纸条的质控线上带有亲和素‑胶体金特异性抗体，检测线上带有生物素抗体和荧光基团抗体。

本发明基于重组酶介导等温核酸扩增技术侧流免疫技术，提出了一种新的猪源性成分掺假现场检测方法，可实现肉眼结果的可视化检测，相较于其他检测方法，此方法检测灵敏度高，操作简便快速，无需专门设备，结果准确可以满足现场样本的检测，特别适合农贸市场、超市、批发市场等现场检测。

申请人：韩山师范学院
地址：521000 广东省潮州市湘桥区桥东
国籍：CN
代理机构：广州三环专利商标代理有限公司
代理人：周增元
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