【精品培训】三、增强免疫力功能评价的基本原理与方法

• NK细胞(Natural Killer cell)，能自发溶解多种肿瘤细胞与被病毒感染 的细胞，因此称为为NK细胞。是一群不依赖于抗原刺激和致敏，也 不需要抗体参与就能杀伤靶细胞的淋巴细胞，主要存在于外周血及 脾脏中。测定原理：将胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)标记的靶细胞(肿瘤细 胞，本实验采用小鼠淋巴瘤细胞株YAC-1)与淋巴细胞共同培养，靶细 胞可被NK细胞杀伤，同位素便从被杀伤的靶细胞中释放出来，其释 放量与NK细胞的活性成正比。通过测定靶细胞3H-TdR的释放率即可 反映NK细胞的活性。
青霉素、链霉素、刀豆蛋白A（ConA）、盐酸、异丙醇、MTT、 Hank's液、PBS缓冲液（pH7.2-7.4）
200目筛网、24孔培养板，96孔培养板（平底），手术器 械、二氧化碳培养箱、酶标仪、721分光光度计、超净工作 台
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 －MTT法
• 试剂配制 完全培养液 RPMI1640培养液过滤除菌，用前加入10％小牛 血清，1％谷氨酰胺（200mmol/L），青霉素（100U/mL）， 链霉素（100ug/L）及5×10－5mol/L的2-巯基乙醇，用无菌 的1mol/L的HCl或1mol/L的NaOH调pH至7.0-7.2，即完全培养 液。 ConA液 用双蒸水配制成100ug/mL的溶液，过滤除菌，在低 温冰箱（-20℃）保存。 无菌Hank's液 用前以3.5％的无菌NaHCO3调pH7.2-7.4。 MTT液 将5mgMTT溶于1mL pH7.2的PBS中，现配现用。 酸性异丙醇溶液 96mL 异丙醇中加入4mL 1mol/L的HCl，临 用前配制。
• 干扰素(interferon，IFN)是由病毒或干扰素诱生剂刺激人或动物有 核细胞产生的一种糖蛋白。据其细胞来源、理化性质和抗原性不
同可分为α、β和γ三种。具有抗病毒、抗肿瘤和免疫调节等活性。 IFNs的生物学作用主要有两个方面：抑制病毒在细胞内的增殖及 肿瘤生长，增强巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)，增强NK细胞的活性。 本实验主要测定了α-干扰素，测定方法，取血清用酶联免疫法测 定。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 －MTT法
• 脾细胞悬液制备 无菌取脾，置于盛有适量无菌Hank's液平皿中，用镊子轻轻将脾 磨碎，制成单个细胞悬液。经200目筛网过滤，或用4层纱布将脾 磨碎，用Hank's液洗2次，每次离心10min（1000r/min）。然后 将细胞悬浮于1mL的完全培养液中，用台酚兰染色计数活细胞数 （应在95%以上），调整细胞浓度为3×106个/mL。
试验项目
• 脏器/体重 比值：胸腺/体重 比值，脾脏/体重 比值 • 细胞免疫功能测定：小鼠脾淋巴细胞转化实验， 迟发型变态反
应 • 体液免疫功能测定：抗体生成细胞检测，血清溶血素测定 • 单核－巨噬细胞功能测定：小鼠碳廓清试验 ，小鼠腹腔巨噬细
胞吞噬鸡红细胞试验 • NK细胞活性测定
试验原则
• 所列指标均为必做项目 • 采用正常或免疫功能低下的模型动物进行实验
• 动物或人体的免疫应答主要包括：机体非特异性免疫功能，即吞 噬细胞的吞噬功能(巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)，与抗原诱导的特 异性免疫应答，即主要由淋巴细胞介导的细胞免疫与体液免疫。
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• T淋转(T淋巴细胞转化实验)：T淋巴细胞在体外受到非特异性 有丝分裂原刀豆蛋白(Con A)的刺激后，能使T淋巴细胞活化与 增殖，加入含有同位素氚的胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)后，T淋巴 细胞的DNA与RNA合成就利用此胸腺嘧啶核苷作为“原料”， 因此合成的DNA与RNA均带有放射性同位素氚，经液闪仪检测 淋巴细胞的放射性，即可了解淋巴细胞增殖的情况，也即淋 巴细胞的转化率。一般转化率越高，免疫调节活性越强。(有 丝分裂原可以刺激淋巴细胞活化与增殖，与抗原类似，区别 在于有丝分裂原可以触发很多克隆的细胞活化，而抗原只能 特异性的触发很少数克隆的细胞活化，简而言之，有丝分裂 原是“广谱的”，而抗原是“特异性”的。
• 巨噬细胞的吞噬功能(MΦ)，当异体物质鸡红细胞(CRBC)侵入 机体后，巨噬细胞可通过聚集、识别和吞入消灭三个步骤完 成吞噬过程。该方法是利用巨噬细胞对光滑表面(如玻璃)具 有粘附能力的特性。将鸡红细胞(CRBC)经腹腔注射入小鼠体 内一定时间后，用生理盐水洗脱腹腔，将含有巨噬细胞的腹 腔液滴于载玻片上，孵育一定时间后，冲洗掉无粘附能力或 粘附能力差的细胞，固定染色，在显微镜下计数吞噬鸡红细 胞的巨噬细胞的百分数和吞噬指数，据此判断巨噬细胞的吞 噬能力。
试验检测方法
• 实验动物 推荐用近交系小鼠，如C57BL/6J、BALB/C等，6－8周龄，
18－22g，雌雄均可，数量为单一性别，每组10－15只。
• 剂量分组及受试样品给予时间 实验设三个剂量组和一个空白对照组，以人体推荐量的10 倍为其中的一个剂量组，另设二个剂量组，必要时设阳性 对照组。
• 受试样品给予时间30天，必要时可延长至45天，免疫模型 动物实验可适当延长。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 －MTT法
• 原理 当T淋巴细胞受ConA刺激后发生母细胞转化，活细胞特别
是增殖细胞通过线粒体水解酶将 MTT（一种淡黄色的唑氮盐） 分解为兰紫色结晶而显色，其光密度值能反映细胞的增殖情 况。
• 仪器和材料 RPMI1640 细胞培养液、小牛血清、2-巯基乙醇（2-ME）、
增强免疫力功能评价及其检测方法
• ①PV多糖的抑制肿瘤效率：将S180实体瘤接种至小鼠右腋 皮下，给药及给蒸馏水(CK组)，连续10天，脱颈椎处死， 剥离皮下瘤块，称瘤重，按[(对照组平均瘤重－实验组平 均瘤重)÷对照组平均瘤重]计算抑瘤率。
• ②PV多糖调节免疫功能：测定免疫调节作用的指标很多， 本实验采用四个指标：包括T淋转、NK细胞、巨噬细胞的 吞噬功能(MΦ)和α-干扰素浓度。
ConA 诱导的小鼠脾淋巴细胞转化实验 －MTT法
• 淋巴细胞增殖反应 将细胞悬液分两孔加入24孔培养板中，每孔1mL，一孔加 75μL ConA 液（相当于7.5ug/mL），另一孔作为对照，置5％ CO2，37℃CO2孵箱中培养72h。培养结束前4h，每孔轻轻吸 去上清液0.7mL，加入0.7mL不含小牛血清的RPMI1640培养 液，同时加入MTT（5mg/mL）50μL /孔，继续培养4h。培养 结束后，每孔加入1mL酸性异丙醇，吹打混匀，使紫色结晶 完全溶解。然后分装到96孔培养板中，每个孔分装3～6孔作 为平行样，用酶联免疫检测仪，以570nm波长测定光密度值。 也可将溶解液直接移入2mL比色杯中，721分光光度计上在波 长570nm测定OD值。