生物活性测定法
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法一、实验目的掌握抑菌圈法测定杀菌剂的生物活性的方法及步骤。
二、实验原理本实验主要采用抑菌圈法来测定杀菌剂的生物活性。
抑菌圈法是利用杀菌剂在琼脂平板上产生的抑菌效果来对其生物活性进行测定的一种方法。
通常，将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，使其均匀地分布在琼脂上。
然后，将含有细菌培养物的琼脂平板放入恒温箱中进行培养。
在培养一段时间后，观察平板上是否出现了抑菌圈，并测量抑菌圈的直径来评估杀菌剂的生物活性。
三、实验仪器和材料1.显微镜2.恒温箱3.滴定管或移液管4.琼脂平板5.细菌培养物6.杀菌剂溶液四、实验步骤1.准备琼脂平板。
将琼脂平板置于恒温箱中，加热至溶化状态后取出，待其稍微冷却后均匀地倒入培养皿中。
2.滴加杀菌剂溶液。
将杀菌剂溶液滴加到琼脂平板上，并用移液管在平板上转动，使杀菌剂均匀地分布在琼脂上。
3.检验杀菌剂效果。
取一定量的细菌培养物，将其在琼脂平板上均匀涂布。
4.培养细菌。
将含有细菌培养物的琼脂平板放入预先恒温箱中，设置合适的温度和培养时间。
5.观察抑菌圈。
在培养一段时间后，取出琼脂平板，用显微镜观察平板上是否出现了抑菌圈。
6.测量抑菌圈直径。
使用直尺或量角器等工具测量抑菌圈的直径，并记录结果。
五、实验注意事项1.操作时要注意无菌技术，以避免细菌污染。
2.滴加杀菌剂溶液时要均匀并轻柔，以保证杀菌剂能充分分散在琼脂平板上。
3.培养细菌时要控制好温度和培养时间，以确保细菌能够充分生长。
4.观察抑菌圈时要注意使用合适的放大倍数，以免错过细小的抑菌圈。
5.测量抑菌圈直径时要使用准确的测量工具，以获得准确的结果。
六、实验结果处理根据实验所得的抑菌圈直径数据，可以通过计算其平均值、标准差等统计指标来评估杀菌剂的生物活性。
较大的抑菌圈直径通常表示杀菌剂具有较强的抑菌效果，反之则表示其抑菌效果较弱。
可以将实验结果与已有的标准值进行比较，以判断杀菌剂的生物活性。
七、实验结果分析根据测得的抑菌圈直径结果，可以对杀菌剂的生物活性进行分析。
中药生物活性测定指导原则
中药生物活性测定指导原则生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，控制药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。
其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。
中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难，此外，中药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效。
为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有对指标成分“含量测定”的基础上增加生物活性测定，以综合评价其质量的可靠性和可控性。
本指导原则的目的是规范中药生物活性测定研究，为该类实验设计、方法学建立等过程和测定方法的适用范围提供指导性的原则要求。
基本原则符合药理学研究基本原则 建立的生物活性测定方法应符合药理学研究的随机、对照、重复的基本原则；具备简单、精确的特点；应有明确的判断标准。
体现中医药特点 鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制，拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。
品种选择合理 拟开展生物活性测定研究的中药材或中成药应功能主治明确，其中，优先考虑治疗适应症明确单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。
方法科学可靠 优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法，待条件成熟后可进一步研究采用生物效价测定法。
基本内容1.实验条件试验系选择 生物活性测定所用的试验系，包括整体动物、离体器官、血清、微生物和组织、细胞、亚细胞器、受体、离子通道和酶等。
试验系的选择与试验原理和测定指标密切相关，应选择背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏和成本低廉的试验系统。
应尽量研究各种因素对试验系的影响，采取必要的措施对影响因素进行控制。
如采用实验动物，尽可能使用大鼠和小鼠等来源多，成本低的实验动物，并说明其种属、品系、性别和年龄。
实验动物的使用，应符合“优化、减少、替代”的“3R”原则。
食品中生物活性肽的鉴定方法研究
食品中生物活性肽的鉴定方法研究引言：食品中的生物活性肽一直是食品科学领域的研究热点之一。
生物活性肽具有一定的生物活性和保健功能，在食品营养研究和功能性食品开发中具有重要价值。
因此，鉴定食品中的生物活性肽成为了食品科学研究中的一个重要课题。
本文将探讨食品中生物活性肽的鉴定方法研究，介绍目前常用的几种鉴定方法，以及各自的优缺点。
一、质谱法质谱法是目前鉴定食品中生物活性肽常用的方法之一。
质谱法可以通过测量肽的质荷比来确定其分子量。
通过质谱法的鉴定，可以快速准确地确定食品中的生物活性肽成分，帮助科研人员了解其结构和功能。
二、色谱法色谱法也是鉴定食品中生物活性肽的重要方法之一。
色谱法可以通过对样品进行分离和纯化，进而得到纯净的肽物质，以便进一步进行鉴定和功能研究。
常用的色谱法包括高效液相色谱、气相色谱和超高效液相色谱等，其中超高效液相色谱是一种新兴的技术，具有分离效果好、分析速度快等优点。
三、酶法酶法是一种常用的生物鉴定方法，通过在特定条件下，使用适当的酶将样品中的生物活性肽分解为较小的肽或氨基酸。
常用的酶包括胰蛋白酶、蛋白酶K等。
酶法鉴定的优点是简便易行，但对样品的处理和酶选择要求较高。
四、免疫学方法免疫学方法是指通过抗体的特异性识别与结合来鉴定食品中的生物活性肽。
例如，可以利用免疫层析法、酶联免疫吸附测定法等方法。
免疫学方法的优点是高度特异，可以检测特定肽的存在，但需要制备特异性抗体，制备成本较高。
五、生物活性测定法生物活性测定法是通过生物学活性来鉴定食品中的生物活性肽。
例如，可以使用细胞实验来检测肽对细胞的生长、分化等影响。
此外，还可以通过动物试验来评估肽对机体的生理效应。
生物活性测定法的优点是直接反映肽的生物功能，但需要相对复杂的实验体系和数据分析。
六、综合方法针对食品中生物活性肽的鉴定，综合多种方法可以提高鉴定的准确性和可靠性。
例如，可以结合质谱法和色谱法进行分析，或者结合酶法和免疫学方法进行鉴定。
生物活性测定法的原理
生物活性测定法的原理
生物活性测定法是一种通过观察或测量生物体对化学物质或其他环境因素的反应来评估其活性的方法。
常用的生物活性测定法包括细胞增殖或生长抑制实验、细胞毒性实验、酶活性实验、抗菌活性实验等。
生物活性测定法的原理主要基于以下几个方面：
1. 细胞反应原理：生物活性测定法常通过观察或测量细胞对化学物质的反应来评估其活性。
例如，通过在培养基中加入待测物质，观察细胞的增殖情况或生物学特征的改变，从而评估其对细胞的生长抑制或促进作用。
2. 酶反应原理：酶在生物体内发挥着极为重要的生物催化作用。
生物活性测定法中常通过测量酶的活性来评估待测物质的生物活性。
例如，通过添加待测物质到含有酶底物的体系中，观察酶反应的速率或生成产物的量来评估待测物质对酶的影响。
3. 细菌抗菌原理：生物活性测定法中常通过测量待测物质对细菌的抑制作用来评估其抗菌活性。
例如，利用平板扩散法或微量稀释法，将待测物质与细菌共同培养，观察细菌的生长情况或测量细菌的最小抑菌浓度，从而评估其抗菌活性。
4. 动物体内反应原理：一些药物或化学物质的生物活性往往需要通过动物体内实验来评估。
常见的方法包括动物行为观察、组织活检、毒性评估等。
通过观察
动物对待测物质的生理、行为或组织结构的变化，来评估其生物活性。
综上所述，生物活性测定法的原理主要是通过观察或测量生物体对待测物质的反应来评估其活性。
具体的原理可以根据不同实验方法和待测物质的性质来确定。
重组人表皮生长因子生物学活性测定法
重组人表皮生长因子生物学活性测定法（细胞增殖法/MTT比色法）本法系依据重组人表皮生长因子对小鼠胚胎成纤维细胞（Balb/c3T3细胞）的生长具有刺激作用，Balb/c3T3细胞的生长状况因重组人表皮生长因子生物学活性的不同而异，以此检测重组人表皮生长因子的生物学活性。
试剂：（1）RPMI 1640培养液：RPMI 1640培养基粉末1袋（规格为1L），加水溶解并稀释到1000ml，加青霉素105U/ml（1ml），链霉素105mg/ml(1ml),再加碳酸氢钠2.1g，溶解后，混匀，除菌过滤，4℃保存。
（2）维持培养液:量取新生牛血清4ml，加RPMI 1640培养液到1000ml。
（3）完全培养液：量取新生牛血清100ml，加RPMI 1640培养液到1000ml。
（4）PBS：量取氯化钠8g、氯化钾0.2g、磷酸氢二钠1.44g、磷酸二氢钾0.24g，加水溶解并稀释到1000ml的溶液，经121℃，15分钟灭菌。
(5) 噻唑蓝（MTT）溶液：取MTT粉末0.10g，加PBS20ml使溶解，经0.22um滤膜过滤除菌。
4℃避光保存。
标准品沉沦的制备：取理组人表皮生长因子标准品按说明书复溶后，用维持培养液稀至每1ml含50 IU。
在96孔细胞培养板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个孔。
以上操作在无菌条件下进行。
供试品溶液的制备：将供试品按标示量复溶后，用维持培养液稀释成每1ml约含50 IU。
在96孔板中，做4倍系列稀释，共8个稀释度，每个浓度做2个孔。
以上操作在无菌条件下进行。
测定方法：Balb/c3T3细胞株用完全培养液于37℃、5%二氧化碳培养，控制细胞浓度为每1ml含1.0 X 105 --5.0 X 106个细胞，传代后24—36 小时用于生物学活性测定。
弃去培养瓶中的培养液，消化和收集细胞用完全培养液配成每1ml含5.0 X 104 --8.0 X 104个细胞的细胞悬液，接种于96孔板中，每孔100ul，于37℃、5%二氧化碳条件下培养。
中药生物活性测定指导原则
中药生物活性测定指导原则生物活性测定法是以药物的生物效应为基础，以生物统计为工具，运用特定的实验设计，控制药物有效性的一种方法，从而达到控制药品质量的作用。
其测定方法包括生物效价测定法和生物活性限值测定法。
中药的药材来源广泛、多变，制备工艺复杂，使得中药制剂的质量控制相对困难，此外，中药往往含有多种活性成分和具有多种药理作用，因此，仅仅控制少数成分不能完全控制其质量和反映临床疗效。
为了使中药的质量标准能更好地保证每批药品的临床使用安全有效，有必要在现有对指标成分“含量测定”的基础上增加生物活性测定，以综合评价其质量的可靠性和可控性。
本指导原则的目的是规范中药生物活性测定研究，为该类实验设计、方法学建立等过程和测定方法的适用范围提供指导性的原则要求。
基本原则符合药理学研究基本原则 建立的生物活性测定方法应符合药理学研究的随机、对照、重复的基本原则；具备简单、精确的特点；应有明确的判断标准。
体现中医药特点 鼓励应用生物活性测定方法探索中药质量控制，拟建立的方法的测定指标应与该中药的“功能与主治”相一致。
品种选择合理 拟开展生物活性测定研究的中药材或中成药应功能主治明确，其中，优先考虑治疗适应症明确单一的中药注射剂品种，对急重症用药、保护品种应重点进行研究。
方法科学可靠 优先选用生物效价测定法，不能建立生物效价测定的品种可考虑采用生物活性限值测定法，待条件成熟后可进一步研究采用生物效价测定法。
基本内容1.实验条件试验系选择 生物活性测定所用的试验系，包括整体动物、离体器官、血清、微生物和组织、细胞、亚细胞器、受体、离子通道和酶等。
试验系的选择与试验原理和测定指标密切相关，应选择背景资料清楚、影响因素少、检测指标灵敏和成本低廉的试验系统。
应尽量研究各种因素对试验系的影响，采取必要的措施对影响因素进行控制。
如采用实验动物，尽可能使用大鼠和小鼠等来源多，成本低的实验动物，并说明其种属、品系、性别和年龄。
实验动物的使用，应符合“优化、减少、替代”的“3R”原则。
生物活性测定法
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
将配制完成的标准品溶液和供试品溶液 移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加 移入接种WISH细胞的培养板中, WISH细胞的培养板中 100ul. 37℃, 入100ul.于37℃,5%二氧化碳条件下 培养18 24小时 18～ 小时. 培养18～24小时.弃去细胞培养板中的 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV (VSV, 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV, 70℃保存 用攻毒培养液稀释至100 保存) -70℃保存)用攻毒培养液稀释至100 每孔100ul 100ul. 37℃, CCID50,每孔100ul.于37℃,5%二氧 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 24小时 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 病变点在lIU/m1) lIU/m1). %病变点在lIU/m1).
重组人白介素重组人白介素-2生物学活性测定法 (CTLL- 细胞/MTT比色法) /MTT比色法 (CTLL-2细胞/MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)的 本法系根据在不同白介素- (IL-2)的 浓度下,其细胞依赖株CTLL CTLL浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活 率不同,以此检测IL 的生物学活性. IL率不同,以此检测IL-2的生物学活性.
试剂 RPMI1640培养液 1640培养 (1) RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养 基粉末1 规格为1L) 1L), 基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至 1000ml,加青霉素10 IU和链霉素 和链霉素10 IU, 1000ml,加青霉素105IU和链霉素105 IU, 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀, 2.1g 过滤,4℃保存 保存. 过滤,4℃保存. 取新生牛血清(FBS) (2) 基础培养液 取新生牛血清(FBS) 10ml, 1640培养液90ml.4℃保存 培养液90ml 保存. 10ml,加 RPMl 1640培养液90ml.4℃保存. (3)完全培养液 取基础培养液100ml 100ml, (3)完全培养液 取基础培养液100ml, 加重组人自介素- 至终浓度400 800IU. 400～ 加重组人自介素-2至终浓度400～800IU. 4℃保存 保存. 4℃保存.
中药药效物质的质量评价与标准
中药药效物质的质量评价与标准中药作为传统医学的重要组成部分，通过其独特的药效物质为人们提供了丰富的治疗和保健选择。
然而，由于中药的复杂性和多样性，如何准确评价和标准化中药药效物质的质量成为一个重要的课题。
本文将探讨中药药效物质的质量评价方法和标准，并提出一些建议。
一、中药药效物质的质量评价方法1. 生物活性测定法生物活性测定法是评价中药药效物质质量的常用方法之一。
通过对中药提取物在生物体内的活性进行测定，可以评估其药效物质的有效性和生物活性水平。
常见的生物活性测定方法包括细胞实验、动物实验和药效学评价等。
2. 化学成分分析法化学成分分析法是评价中药药效物质质量的重要手段之一。
通过对中药提取物中的化学成分进行分析和鉴定，可以明确其中所含的活性成分及其含量，从而评价中药的药效物质质量。
常见的化学成分分析方法包括色谱-质谱联用技术、核磁共振技术等。
3. 毒理学评价法毒理学评价法是评价中药药效物质质量的重要手段之一。
通过对中药提取物的毒理作用进行评估，可以判断中药的安全性和可靠性。
常见的毒理学评价方法包括急性毒性实验、亚急性毒性实验和慢性毒性实验等。
二、中药药效物质的质量标准1. 总体标准中药药效物质的质量标准应包括质量指标、含量测定和限量要求等方面。
质量指标是对中药中的主要化学成分进行定量和定性描述的指标，含量测定是对活性成分在中药中的含量进行定量测定的方法，限量要求是对有害物质或有潜在风险的物质进行限制的要求。
2. 方法标准中药药效物质的质量标准还需要明确相应的测试方法和操作规范，以确保标准可操作性和可重复性。
方法标准应包括样品的取样、制备和测试等环节的具体要求，以及数据的处理和分析方法。
3. 特殊标准对于某些特殊的中药药效物质，还需要制定相应的特殊标准。
例如，对于易氧化的有效成分，应制定氧化物含量的标准；对于容易变质的有效成分，应制定保鲜条件和有效期的标准等。
三、建议1. 加强标准化研究中药药效物质的质量评价和标准制定需要深入研究，应加强对中药药效物质的成分和药理作用的研究，以提高质量评价的准确性和可靠性。
实验二 杀菌剂生物活性测定-生长速率法
实验二杀菌剂生物活性测定-生长速率法一、实验原理将不同浓度的药液与融化的培养基混合，制成带毒培养基平面，在平面上接种病原菌，以病菌生长速度的快慢来判定药剂毒力的大小。
病菌生长速率可用两种方法表示：①一定时间内菌落直径的大小；②菌落达到一定直径所需的时间。
二、实验目的通过本试验要基本掌握杀菌剂室内（离体）活性的生物测定操作技术，掌握杀菌剂毒力回归曲线的制作及LC50的求解。
三、实验材料1．供试药剂：70%甲基托布津2．供试病原菌：苹果炭疽病菌3．马铃薯、葡萄糖、琼脂培养基（PDA）配方：马铃薯200g；葡萄糖20g；琼脂粉10g（或琼脂条18g）；自来水1000 mL；pH自然偏酸（5-6）制作方法：选择质量较好的马铃薯，削皮，去芽眼，切成薄片，称取200g，加自来水1000mL，煮沸后改小火煮30min（直至马铃薯片呈半透明状），然后用4层沾湿纱布过滤，滤液用水补足至1000mL。
再加入琼脂10g，用玻棒搅拌使其溶解（可适当加热）后加入葡萄糖20g，搅匀，再补足水1000 mL，最后分装于试管（用于接斜面）或三角瓶（250mL三角瓶盛约150mL培养基），用无菌封口膜封好灭菌备用。
采用湿热灭菌法，121℃下保持30min。
4、实验器材：φ90cm的培养皿（72个），PDA培养基，1mL移液管（10个），酒精灯，10mL具塞刻度试管（10个），接种针（4个），超净工作台（2台）。
四、方法与步骤1．菌种准备实验室准备有菌源，在生测前一个星期请自行转接。
对菌种的要求：病原菌应容易培养，菌丝生长快速、整齐，产生孢子缓慢；菌丝最好在培养基平面上呈平伏放射状生长（有利于结果的测量）。
在φ90cm的培养皿中，倒入约10-15mL PDA。
从培养皿或者斜面培养基上取一块病菌，放在培养皿中间，于26℃下培养（3-7d）备用。
2．药液准备将供试药剂70%甲基托布津用无菌水分别稀释成800、400、200、100、50、25mg/L 六个浓度的药液。
生物活性物质
生物活性物质生物活性物质,是指来自生物体内的对生命现象具体做法有影响的微量或少量物质。
如: 有些食物含有多种具有生物活性的化合物，当与机体作用后能引起各种生物效应，称为生物活性物质。
它们种类繁多，有糖类、脂类、蛋白质多肽类、甾醇类、生物碱、甙类、挥发油等等。
它们主要存在于植物性食物中，对人有的有利，有的有害。
瑞士哲人和医生Paracelsus认为，植物是人类食物和药物的来源，也是毒物的来源，“所有食物都是毒物，没有无毒性的食物，仅仅是量的多少左右了他们毒性的大小”。
细胞生物活性的化学检测法一、四唑盐（MTT）比色法：检测细胞存活和生长的方法除前面所介绍的方法外，还可用四唑盐比色法试验（MTT）。
此法的原理是：活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性的MTT 还原为难溶性的蓝紫色结晶物，并沉积在细胞中，而细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的蓝紫色结晶物，用酶联免疫检测，以在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反应活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。
●0.25%胰蛋白酶消化细胞使其成为单细胞，用含0.1%胎牛血清的RPMI培养基配成1x10^9个/L的但细胞悬液，将细胞接种于96孔培养板中，每孔100ul。
●将培养板置CO2培养箱中，在37℃、5%CO2条件下，培养3-5天。
●培养3-5天后，每孔加入MTT溶液10ul，继续置培养箱孵育3-6h，终止培养，加10%SDS-HCl 100ul/孔，37℃培养数小时，将细胞内与细胞周围的MTT 颗粒充分溶解。
●用酶联免疫检测仪测定每孔吸光度（OD），选波长490nm。
以时间为横轴，OD值为纵轴绘制细胞生长曲线。
用此法测细胞活力，为保证结果的准确性，最好在试验前测定每种细胞的贴比率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，再确定每孔细胞接种数和培养时间，以保证培养终止时不会过满。
另外，实验时设空白对照，比色时，以空白孔调零。
9生长激素生物活性的测定方法中国药品检验标准操作规范
生长激素生物活性的测定方法一、去垂体大白鼠体重法1 实验材料及用具1.1 天平精度0.01mg 供试品称量用精度1mg 试剂称量用精度0.1g 大鼠称重用1.2 实验用具手术板、注射器（1ml，精度0.01ml）、吸管、移液管、带塞玻璃小瓶、烧杯、玻璃棒、量筒、脱脂棉。
1.3 手术器械手术剪、直镊、眼科剪、眼科直镊、眼科弯剪、牙科钻、钻头、抽滤瓶、真空泵、牙科刮勺、止血钳。
1.4 试剂氯化钠、牛血清白蛋白、乌拉坦。
2 溶液配制2.1 生理盐水称取氯化钠适量，加水配成0.9%的溶液。
2.2 牛血清白蛋白的生理盐水溶液，称取牛血清白蛋白适量，加生理盐水配成0.1%的牛血清白蛋白的生理盐水溶液，简称溶媒。
2.3 乌拉坦溶液称取乌拉坦适量，加生理盐水配成25%的乌拉坦溶液。
2.4 标准品溶液2.4.1 实验当日，取生长激素标准品，放置至室温。
2.4.2 割开安瓶（注意勿使内容物损失）立即按标示效价精确加以定量溶媒将全部内容物洗出，使成1.0IU/ml的标准品溶液；亦可精密加入适量溶媒使溶解，混合均匀，精密吸取适量，用溶媒配制成1.0IU/ml的标准品溶液。
2.5 标准品稀释液2.5.1 按《中国药典》附录生长激素生物检定法的要求，选择标准品高（d S2）、低（d S1）2组剂量及剂距。
2.5.2 计算2组剂量稀释液浓度及大鼠6天内皮下注射的总毫升数，一般高浓度稀释液可配成每1ml中含0.10~0.25IU（随季节、动物品系和来源不同），低浓度稀释液可配成每1ml中含0.025~0.06IU，高、低两浓度比值r=1:0.25，每鼠皮下注射每天0.5ml/次，连续6天，每组至少8只，例如：高浓度稀释液d S2=0.1IU/ml×0.5ml/（天．鼠）×6天×8鼠/组=2.4IU/组，即0.1IU/ml高浓度稀释液24ml低浓度稀释液d S1=0.025IU/ml×0.5ml/（天．鼠）×6天×8鼠/组=0.6IU/组，即0.025IU/ml低浓度稀释液24ml2.5.3 精密量取1.0IU/ml标准品溶液适量，置50ml烧杯中，加入溶媒适量成标准品d S2稀释液（如0.1IU/ml）。
生物活性测定法
EA K3
X
A+ E
有R'
RO
E + PX
有机磷类
K d PX .E K2
PX K3
P+ E
X
PX代表有机磷杀虫剂，X代表侧链部分例如对氧磷中的-O- NO2。E代表 AChE，Kd是解离常数(或者称亲和力常数)，K2是磷酰化反应速率常数有时写作 Kp，K3是脱磷酰基水解速率常数或者称酶致活常数。反应开始时有机磷酸酯先与 酶形成复合体(PX·E)，X分离后形成磷酰化酶(PE)，再经过脱磷酰基使AChE恢复。
淡水发光菌青海弧菌的发现解决了这一问题。
2 用家蝇检测蔬菜中的残留农药
60年代后期，台湾农业试验所采用生物测定方法进行农药残留 检验，其原理是释放高敏感性的家蝇于菜汁中，4～5ｈ后家蝇死亡 率在10%以下即为合格，该方法优点是过程简单无须复杂仪器检测， 缺点是检测时间较长，仅适用于田间未采收的蔬菜，另外该方法只 对部分杀虫剂有反应，无法分辨残留农药的种类，准确性较低。
明亮发光杆菌(Photobacterium phosphoreum)
最小检出浓度为3ｍｇ·Ｌ-1 已用于检测甲胺磷、敌敌畏等常用有机磷农 药。 特点：快速、简便、灵敏、价廉，适合于现 场分析 缺点：农药浓度与发光强度的线性关系不够 准确，只能用于半定量测定。
长期以来使用的发光细菌是海洋发光细菌，但该方法有严重不 足，即必须在检测的样品中加入3%的ＮａＣｌ的细菌才能正常发 光。
AchE及其功能 Ach是一种神经传递介质 , AchE是一个水解酶，底物
是Ach。水解作用的反应式如下：
CH3COOCH2CH2N+(CH3)3 + H2O CH3COOH+HOCH2CH2N+(CH3)3
生物活性物质筛选与活性评价方法
生物活性物质筛选与活性评价方法生物活性物质是指具有一定的生物活性和药理效应的物质，包括药物、天然产物和化学合成产物等。
筛选和评价生物活性物质是药物研发和天然产物利用的重要环节。
本文将探讨生物活性物质的筛选与活性评价方法。
一、生物活性物质筛选方法1. 高通量筛选技术高通量筛选技术是一种同时测试大量样品的方法，通过高通量筛选平台，可以对数千个化合物进行快速筛选。
其中，常用的方法包括酶抑制剂筛选、细胞增殖抑制筛选、酶底物筛选等。
这些方法通过检测样品对生物体系的作用来判断其生物活性。
2. 超高效液相色谱质谱联用技术超高效液相色谱质谱联用技术（UHPLC-MS）是一种结合了高效液相色谱和质谱技术的分析方法。
它可以用于分离和鉴定复杂样品中的化合物。
在筛选生物活性物质方面，UHPLC-MS可以用于快速鉴定样品中的目标成分并评估其生物活性。
3. 表型筛选表型筛选是通过观察生物体系的表现来评估化合物的生物活性。
例如，可以通过观察细胞形态、细胞增殖、细胞凋亡等现象来评价化合物的活性。
表型筛选可以非常直观地评估化合物对生物体系的影响，是药物研发中常用的方法之一。
二、生物活性物质活性评价方法1. 生物测定法生物测定法是一种通过观察生物体系的生物学反应来评价化合物的活性的方法。
常用的生物测定法包括细胞毒性测定、酶活性测定、细胞增殖测定等。
通过这些方法，可以评估化合物对生物体系的毒性、抑制作用、促进作用等。
2. 动物模型法动物模型法是一种通过在动物体内测试化合物的活性来评价其药理效应的方法。
常用的动物模型包括小鼠模型、大鼠模型、猪模型等。
通过观察化合物对动物体内疾病的影响，可以评估其治疗作用和毒性。
3. 结构活性关系分析结构活性关系分析是一种通过分析化合物结构与其生物活性之间的关系来预测和优化化合物的活性的方法。
通过对一系列结构类似但活性不同的化合物进行分析，可以找出结构与活性之间的规律。
这种方法可以为化合物的设计和优化提供方向。
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法摘要：本实验主要研究了七杀菌剂的生物活性测定方法，抑菌圈法。
该方法通过在琼脂平板上播种细菌，再在平板上施加一定浓度的七杀菌剂，观察并测量周围的抑菌圈直径，从而评估七杀菌剂对细菌的抑制作用。
实验结果表明，抑菌圈直径与七杀菌剂浓度呈正相关关系，且抑菌圈直径越大，表示七杀菌剂的抑菌效果越好。
通过该方法可以快速、简便地评估七杀菌剂的生物活性，为进一步研究其抗菌机制和优化配方提供了参考。
关键词：七杀菌剂；抑菌圈法；生物活性；抑菌圈直径一、引言七杀菌剂是一类特殊作用机制的植物杀菌剂，具有广谱杀菌、低滴效、低残留、不发生抗性等优点，被广泛应用于农业防病生产中。
评估七杀菌剂的生物活性是研究抗病机理、筛选优良品种和优化配方的重要手段。
目前，常用的七杀菌剂生物活性测定方法包括最小抑菌浓度法、抑菌圈法和微量滴定法等。
本实验采用抑菌圈法对七杀菌剂的生物活性进行测定，该方法简单易行、时间短，能够客观直观地评估抗菌剂的抑菌效果，被广泛应用于杀菌剂的筛选和评估中。
二、材料与方法2.1实验材料-七杀菌剂：根据实验需要选择合适的七杀菌剂；-革兰氏染色培养基：包括琼脂和所需培养成分；-细菌：根据实验需要选择合适的细菌菌种；- 培养皿：直径90 mm的培养皿；-无菌棉花：消毒后用于吸水；-直尺：用于测量抑菌圈的直径。
2.2实验步骤步骤一：制备琼脂平板1)按照革兰氏染色培养基的配方将琼脂和所需培养成分溶解在适量的蒸馏水中；2)加热溶液，使其均匀溶解；3)微量加热，使溶液达到沸腾状态；4)关火，冷却至50-60°C左右；5)待溶液冷却至室温，但还能滴落时，加入适量的细菌菌液；6)快速均匀摇晃培养皿，使菌液均匀分布；7)等待琼脂凝固，形成琼脂平板。
步骤二：制备七杀菌剂根据使用七杀菌剂的需要，按照使用说明书中的配方调配适量的七杀菌剂浓度。
步骤三：进行抑菌实验1)在琼脂平板表面平均涂布一层细菌菌液；2)在涂布完成后，使用消毒的锥形杯钻按规定距离在琼脂平板上扎孔；3)将七杀菌剂溶液滴入孔内，注意控制滴入的量和浓度；4)将培养皿倾斜，使溶液均匀涂布在琼脂平板上；5)撤去孔内的溶液，用无菌棉花吸干孔内的溶液；6)将培养皿倒置放置于恰当的环境中进行培养；7)培养一定时间后，观察并测量抑菌圈的直径。
生物活性测试的原理与方法
生物活性测试的原理与方法生物活性测试是用来评估物质对生物体的活性的一种实验方法，可以用来研究物质对疾病的治疗作用、毒性作用以及其他生物效应。
其原理和方法主要包括以下几个方面：一、生物活性测试的原理：生物活性测试的基本原理是利用生物体作为测试对象，通过观察生物体的生理反应、药物代谢以及疾病模型的建立，来评估物质对生物体的活性。
生物活性的产生通常是由于物质与生物体的生物分子发生相互作用，进而影响生物体的生理功能。
二、生物活性测试的方法：（一）细胞活性测试：细胞活性测试是一种常用的生物活性测试方法，通过将物质加入到细胞培养基中，观察对细胞的生长、分裂、凋亡等生物学行为的影响。
常用的细胞活性测试包括MTT（3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide）法、CCK-8（Cell Counting Kit-8）法等。
（二）动物活性测试：动物活性测试是一种比较复杂的生物活性测试方法，通过给动物投放物质，观察其对动物的生理反应、生化指标的改变以及对疾病模型的影响，来评估物质的生物活性。
常用的动物活性测试包括急性毒性测试、慢性毒性测试、药效学实验等。
（三）靶标活性测试：靶标活性测试是通过与生物体内相关的蛋白质靶标相互作用，来评估物质对蛋白质功能的影响。
常用的靶标活性测试包括酶活性测定、蛋白质结合实验、分子动力学模拟等。
（四）体外体内活性测试：体外体内活性测试是将物质在体外和体内进行测试，综合评估物质对生物体的活性。
体外活性测试一般包括细胞外药效学实验、体外脏器模型实验等。
体内活性测试则通过给动物或人类实验对象投放药物，观察其对整体生物的生理反应、药代动力学等。
（五）相关指标的测定：在生物活性测试中，还可以通过测定相关的生物标志物来评估物质的生物活性。
如测定病理标记物、生物化学指标以及生物体的组织学改变等。
总结：生物活性测试的原理和方法主要包括细胞活性测试、动物活性测试、靶标活性测试、体外体内活性测试以及相关指标的测定等。
几种常用生物活性测试方法简介
通过使用供体和受体荧光团标记，
TR-FRET 检测将时间分辨 (TR) 和 荧光共振能量转移 (FRET) 原理的 优势结合到了一起。
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET)
镧 系 元 素 （ 铕 Eu 和 铽 Tb ） 半 衰 期 长 (us-ms) ， 将 Eu 纳入立体笼中， 形成稳固复合体， 笼收集光将能量 转移到Eu上。
(如酶活力（Kcat）、酶促反应米氏常数(Km)) 。
可以应用于蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质折叠/去折叠、蛋白质-小分子相互作用、 酶-抑制剂相互作用、酶促反应动力学、药物-DNA/RNA相互作用、RNA折叠、蛋 白质-核酸相互作用、核酸-小分子相互作用、核酸-核酸相互作用、生物分子-细胞 相互作用等方面。
15~40℃
2~80℃
溶剂
非强有机溶剂
无限制
耗材
芯片
试剂
药物筛选
适用
不适用
Time-resolved fluorescence energy transfer (TR-FRET) FRET原理
传统FRET技术容易受样品组分(缓冲液，蛋白， 化学物质及细胞裂解产物等)背景荧光信号的 影响。
时间分辨通过去除寿命较短的背景，分辨目的 荧光。
先将化合物用dmso溶解成10mm储存液并用dmso3倍梯度稀释成10个浓度梯度成1000化合物系列浓度储存液再转移至化合物转移cellcountingkit8cck8bdr4相关化合物抗癌细胞活性体外筛选方法检测方法mtt法xtt法wst1法cck8法甲臢产物的水溶性差需加有机溶剂溶解产品性状粉末2瓶溶液溶液1瓶溶液使用方法配成溶液后使用现配现用即开即用即开即用检测灵敏度很高很高检测时间较长较短较短最短检测波长560600nm420480nm420480nm430490nm细胞毒性高细胞形态完全消失很低细胞形态不变很低细胞形态不变很低细胞形态不变试剂稳定性一般较差一般很好批量样品检测可以非常适合非常适合非常适合便捷程度一般便捷便捷非常便捷细胞水平活性测试方法检测细胞增殖毒性测试方法比较sulforhodaminebsrbsrb即磺酰罗丹明bsulforhodamineb是一种粉红色阴离子染料易溶于水在酸性条件下可特异性地与细胞内组成蛋白质的碱性氨基酸结合
简述测量细胞因子的两种方法和对应原理
简述测量细胞因子的两种方法和对应原理
测量细胞因子的方法主要有两种：生物学活性测定法和免疫测定法。
生物学活性测定法是通过观察细胞因子对特定细胞系的生物学效应来测量其活性水平。
这种方法常用的有：
1. 细胞增殖测定法：通过测量细胞因子对特定细胞系的增殖能力来评估其活性水平。
2. 细胞迁移测定法：通过观察细胞因子对特定细胞的迁移能力来评估其活性水平。
3. 蛋白质合成测定法：通过测量细胞因子对特定细胞合成特定蛋白质的能力来评估其活性水平。
免疫测定法是通过特异性抗体与细胞因子结合，并通过染色、放射性标记或荧光标记等方式来检测抗原-抗体结合的量来测量细胞因子的水平。
这种方法常用的有：
1. ELISA：通过固相酶联免疫吸附实验法，在微孔板上涂覆抗细胞因子的抗体，然后加入细胞因子样品和标记有抗细胞因子抗体的辣根过氧化物酶，最后用底物显色反应来测量细胞因子水平。
2. 免疫印迹（Western Blot）：将细胞因子样品经过电泳分离后，通过蛋白质转印和抗体结合来检测细胞因子的水平。
3. 流式细胞术：将单个细胞或细胞样品与标记有抗细胞因子抗体的荧光染料共同孵育，然后用流式细胞仪来检测细胞因子的水平。
以上两种方法分别基于细胞因子的生物学活性和免疫反应来测
量其水平，具有高灵敏度和特异性，广泛应用于细胞因子的研究和临床诊断。
实验七 杀菌剂生物活性测定方法――抑菌圈法
实验七杀菌剂生物活性测定方法——抑菌圈法一、实验目的学习并掌握杀菌剂的离体活性测定方法——抑菌圈法。
二、实验原理抑菌圈法即水平扩散法基本原理是在已接种供试菌的琼脂培养基上施以少量抗菌性物质或杀菌剂，使之接触培养基和病菌，经定温培养一定时间后，因药剂的渗透扩散作用，施药部位周围因杀死了病菌而抑制了其在培养基上的生长，从而产生了抑菌圈。
在一定范围内，抑菌圈直径的平方或面积与药剂浓度的对数呈直线函数关系，从而可比较供试样品杀菌活性大小。
其最大优点是精确度高，操作简单，能较快得出结果。
但测定结果受药剂溶解性和扩散能力影响很大，具一定局限性。
根据药剂施加在琼脂培养基表面方式不同，又分为管碟法（牛津杯法）、滤纸片法、孔碟法、滴下法等，其中以管碟法和滤纸片法应用最广。
三、实验材料供试药剂：速克灵或扑海因。
供试病原菌：番茄灰霉病菌。
实验器材：无菌水、无菌接种针、灭菌三角瓶、玻璃珠、灭菌双层纱布、75%酒精棉球、消毒摄子、移液管、试剂瓶、吸耳球、超净工作台、胶头滴管、尺子。
四、实验方法采用管碟法。
将供试药剂加于放置在琼脂培养基表面的用不锈钢制成的小圆筒（又称为牛津杯，一般为外径8 mm，内径6 mm，高10 mm）内，定温培养一定时间后测量抑菌圈大小。
1．配制药液：用灭菌蒸馏水将供试药剂配成一系列梯度浓度，一般5-7个浓度。
灭菌蒸馏水为对照。
2．制备一定“浓度”的供试菌悬浮液：如真菌，则宜用孢子悬浮液。
在培养好的菌种上倒入10mL灭菌水，用接种针轻轻刮动平面孢子悬浮，倾于灭菌三角瓶内（事先装数粒玻璃珠）摇动5min，将孢子悬浮液用灭菌双层纱布过滤入另一灭菌三角瓶内。
用低倍（15×20倍）显微镜检查，调节孢子浓度，每视野80-100个孢子为宜；以上操作应在无菌条件下进行，动作要迅速准确。
3．浇制双层培养基：将装在试管内已灭菌的清水琼脂培养基10 mL溶化后，趁热倒入9 cm直径培养皿中，水平冷凝。
将适合供试菌生长发育的100 mL培养基熔化后冷至45-50℃左右后，迅速吸取10 mL菌液加入培养基中，充分混匀后，立即吸取5mL 带菌培养基加在已凝固的清水琼脂培养基上，并使之均匀地铺在底层上。
生物膜微生物活性的测定
生物膜微生物活性的测定(TTC-DHA)法在本课题研究中，生物膜微生物的活性通过氯化三苯基四氮唑(TTC)-脱氢酶活性测定法进行。
利用氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyl tetrazolium chloride ，TTC；Shanghai Reagent Co., Ltd, Shanghai, China)的还原性产物TTC-甲瓒(TF)的量，来表示微生物的活性。
一、生物膜样品的制备取10g载体生物膜，用蒸馏水润洗2次，置于锥形瓶中，用玻璃珠剧烈摇动将生物膜打碎，用生理盐水20mL稀释，用玻棒搅动，使成悬液，备用。
二、主要仪器和试剂氯化三苯基四氮唑( TTC)-葡萄糖标准溶液:TTC分析纯0.1 g与葡萄糖l g共溶于100 mL蒸馏水中，棕色试剂瓶保存；甲苯(分析纯)；三氯甲烷(分析纯)；三羟甲基氨基甲烷(Tris)-HCI缓冲溶液，pH值为8．6；其它：硫化钠。
三、标准曲线的制作在分液漏斗中依次注入l，2，3，4，5，6 mL浓度为l g ·L-1 TTC-葡萄糖标准溶液，2 mL Tris-HCI缓冲溶液及lmL 10％Na2S新配溶液,摇匀；待溶液充分显色后，准确加入甲苯溶液5mL，振摇，完全提取TF。
放置片刻；待溶液分层后，取有机溶液层, 移至lcm比色皿中,稳定2 min用752紫外分光光度计在波长485nm处，测对应的吸光度(A)值，对脱氢酶活性作图，以试剂空白作对照，绘制标准曲线。
四、生物膜脱氢酶活性测定取生物膜制备液2mL于带塞试管中，依次加入Tris-HCl缓冲液、0.1 mol ·L-1葡萄糖液、0.5％TTC各2 mL，置入37±1℃恒温箱中培养6 h后取出，加2滴浓硫酸终止反应，准确加入5 mL甲苯，振摇，在4000 rpm下离心5 min，取有机溶剂层比色。
在上述条件下，将1h产生1µgTF的量为1个酶活力单位。
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生物活性测定法
重组人促红素体内生物学活性测定法 网织红细胞法) (网织红细胞法)
本法系依据人促红素(EPO)可刺激网织红 可刺激网织红 本法系依据人促红素 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射EPO后, 细胞生成的作用,给小鼠皮下注射 后 其网织红细胞数量随 EPO注射剂量的增加 注射剂量的增加 而升高. 而升高.利用网织红细胞数对红细胞数的 比值变化,通过剂量-反应平行线法检测 比值变化,通过剂量 反应平行线法检测 EPO体内生物学活性. 体内生物学活性. 体内生物学活性
按标准品说明书, 标准品溶液的制备 按标准品说明书, 标准品复溶, 将EPO标准品复溶,用稀释液将 标准品复溶 用稀释液将EPO标准 标准 品稀释成高, 个剂量EPO标准溶 品稀释成高,中,低3个剂量 个剂量 标准溶 液. 供试品溶液的制备 用稀释液将供试 品稀释成高, 个剂量与EPO标准 品稀释成高,中,低3个剂量与 个剂量与 标准 溶液单位相近的供试品溶液. 溶液单位相近的供试品溶液.
然后弃去细胞培养板中的上清液, 然后弃去细胞培养板中的上清液,每孔 加染色液50ul 室温放置30分钟后, 50ul, 30分钟后 加染色液50ul,室温放置30分钟后,用 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 流水小心冲去染色液,并吸干残留水分, 每孔加入脱色液100ul 室温放置3 100ul, 每孔加入脱色液100ul,室温放置3～5分 混匀后,用酶标仪以630nm 630nm为参比波 钟.混匀后,用酶标仪以630nm为参比波 在波长570nm处测定吸光度, 570nm处测定吸光度 长,在波长570nm处测定吸光度,记录测 定结果. 定结果. 试验数据采用计算机程序或四参数回归 计算法进行处理. 计算法进行处理.并按下式计算试验结 果:
试剂 (1)MEM或RPMIl640培养液 MEM或 (1)MEM或RPMIl640培养液 取MEM或RPMI 1640培养基粉末 培养基粉末1 规格为1L) 1L), 1640培养基粉末1袋(规格为1L),加水溶解 并稀释至1000ml 加青霉素10 IU和链霉 1000ml, 并稀释至1000ml,加青霉素105 IU和链霉 素105 IU ,再加碳酸氢钠2.1g,溶解后, 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后, 2.1g 混匀,除菌过滤,4℃保存 保存. 混匀,除菌过滤,4℃保存. (2)完全培养液 量取新生牛血清10ml 10ml, (2)完全培养液 量取新生牛血清10ml, MEM或RPMI1640培养液90ml.4℃保存 培养液90ml 保存. 加MEM或RPMI1640培养液90ml.4℃保存. (3)测定培养液 量取新生牛血清7ml 7ml, (3)测定培养液 量取新生牛血清7ml,加 MEM或 1640培养液93ml.4℃保存 培养液93ml 保存. MEM或RPMI 1640培养液93ml.4℃保存.
(4)攻毒培养液 量取新生牛血清3ml 3ml, (4)攻毒培养液 量取新生牛血清3ml, MEM或 1640培养液97ml.4℃保 培养液97ml 加MEM或RPMI 1640培养液97ml.4℃保 存. (5)消化液 取乙二胺四乙酸二钠0.2 (5)消化液 取乙二胺四乙酸二钠0.2 氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 8.0g, 0.2g, g,氯化钠8.0g,氯化钾0.2g,磷酸氢 二钠1.152g 磷酸二氢钾0.2g 1.152g, 0.2g, 二钠1.152g,磷酸二氢钾0.2g,加水溶 解并稀释至1000ml 1000ml, 121℃15分钟灭 解并稀释至1000ml,经121℃15分钟灭 菌. (6)染色液 取结晶50mg 50mg, (6)染色液 取结晶50mg,加无水乙醇 20ml溶解后 加水稀释至100ml 即得. 溶解后, 100ml, 20ml溶解后,加水稀释至100ml,即得.
Ds×Es 供试品生物学活性(IU/m1) 供试品生物学活性(IU/m1) = Pr× Dr×Er
式中:Pr为标准品生物学活性 IU/ml; 为标准品生物学活性, 式中:Pr为标准品生物学活性,IU/ml;
Ds为供试品预稀释倍数; Ds为供试品预稀释倍数; 为供试品预稀释倍数 Dr为标准品预稀释倍数 为标准品预稀释倍数; Dr为标准品预稀释倍数; Es为供试品相当于标准品半效量的稀释 Es为供试品相当于标准品半效量的稀释 倍数; 倍数; Er为标准品半效稀释倍数 为标准品半效稀释倍数. Er为标准品半效稀释倍数.
将配制完成的标准品溶液和供试品溶液 移入接种WISH细胞的培养板中,每孔加 移入接种WISH细胞的培养板中, WISH细胞的培养板中 100ul. 37℃, 入100ul.于37℃,5%二氧化碳条件下 培养18 24小时 18～ 小时. 培养18～24小时.弃去细胞培养板中的 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV (VSV, 上清液.将保存的水泡性口炎病毒(VSV, 70℃保存 用攻毒培养液稀释至100 保存) -70℃保存)用攻毒培养液稀释至100 每孔100ul 100ul. 37℃, CCID50,每孔100ul.于37℃,5%二氧 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 24小时 化碳培养24小时(镜检标准品溶液的50 病变点在lIU/m1) lIU/m1). %病变点在lIU/m1).
干扰素生物学活性测定法 细胞病变抑制法) (细胞病变抑制法)
本法系依据干扰素可以保护人羊膜细 (WISH)免受水泡性口炎病毒 免受水泡性口炎病毒(VSV) 胞(WISH)免受水泡性口炎病毒(VSV) 破坏的作用,用结晶紫对存活的WISH 破坏的作用,用结晶紫对存活的WISH 细胞染色,于波长570nm 570nm处测定其吸 细胞染色,于波长570nm处测定其吸 光度,可得到干扰素对WISH WISH细胞的保 光度,可得到干扰素对WISH细胞的保 护效应曲线, 护效应曲线,以此测定干扰素生物学 活性. 活性.
按低, 测定法 按低,中,高 (如10IU/鼠, 如 / 20IU/鼠,40IU/鼠) 3个剂量组,分别给 个剂量组, / / 个剂量组 近交系6～ 周龄小鼠 雌性BALB/c小鼠 周龄小鼠(雌性 小鼠) 近交系 ～8周龄小鼠 雌性 / 小鼠 小鼠皮下注射EPO标准品及供 或B6D2F1小鼠皮下注射 小鼠皮下注射 标准品及供 试品溶液,每组至少4只 试品溶液,每组至少 只,每鼠注射量为 不大于0.5ml.在注射后的第 天从小鼠眼 不大于 .在注射后的第4天从小鼠眼 眶采血3～ 滴 置于预先加入200ul 眶采血 ～4滴,置于预先加入 EDTA- K2抗凝剂的采血管中. 抗凝剂的采血管中. 抗凝剂的采血管中
试剂 (1) 乙二胺四乙酸二钾抗凝剂 称取乙 二胺四乙酸二钾100mg,加生理氯化钠 二胺四乙酸二钾 , 溶液10ml溶解,混匀,使用时新鲜配制. 溶解, 溶液 溶解 混匀,使用时新鲜配制. (2) 稀释液 取0.1g牛血清白蛋白,加 0.1g牛血清白蛋白 牛血清白蛋白, 生理氯化钠溶液溶解并稀释至100ml, 生理氯化钠溶液溶解并稀释至 , 即得. 即得.
试剂 RPMI1640培养液 1640培养 (1) RPMI1640培养液 取RPMI 1640培养 基粉末1 规格为1L) 1L), 基粉末1袋(规格为1L),加水溶解并稀释至 1000ml,加青霉素10 IU和链霉素 和链霉素10 IU, 1000ml,加青霉素105IU和链霉素105 IU, 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀,除菌 再加碳酸氢钠2.1g,溶解后,混匀, 2.1g 过滤,4℃保存 保存. 过滤,4℃保存. 取新生牛血清(FBS) (2) 基础培养液 取新生牛血清(FBS) 10ml, 1640培养液90ml.4℃保存 培养液90ml 保存. 10ml,加 RPMl 1640培养液90ml.4℃保存. (3)完全培养液 取基础培养液100ml 100ml, (3)完全培养液 取基础培养液100ml, 加重组人自介素- 至终浓度400 800IU. 400～ 加重组人自介素-2至终浓度400～800IU. 4℃保存 保存. 4℃保存.
重组人白介素重组人白介素-2生物学活性测定法 (CTLL- 细胞/MTT比色法) /MTT比色法 (CTLL-2细胞/MTT比色法)
本法系根据在不同白介素-2 (IL-2)的 本法系根据在不同白介素- (IL-2)的 浓度下,其细胞依赖株CTLL CTLL浓度下,其细胞依赖株CTLL-2细胞存活 率不同,以此检测IL 的生物学活性. IL率不同,以此检测IL-2的生物学活性.
(7)脱色液 (7)脱色液 取无水乙醇50ml,乙酸0.1ml, 取无水乙醇50ml,乙酸0.1ml, 50ml 0.1ml 加水稀释至100ml 100ml. 加水稀释至100ml. 取氯化钠8.0g 氯化钾0.20g 8.0g, 0.20g, (8)PBS 取氯化钠8.0g,氯化钾0.20g, 磷酸氢二钠1.44g 磷酸二氢钾0.24g 1.44g, 0.24g, 磷酸氢二钠1.44g,磷酸二氢钾0.24g,加 水溶解并稀释至1000ml 1000ml, 15分钟 水溶解并稀释至1000ml,经121℃ 15分钟 灭菌. 灭菌.
取抗凝血, 取抗凝血,用全自动网织红细胞分析仪 计数每只小鼠血液中的网织红细胞数对 红细胞总数的比值(Ret (Ret% 红细胞总数的比值(Ret%).按注射剂量 (IU)对Ret%的量反应平行线测定法( (IU)对Ret%的量反应平行线测定法(二 部附录XIV)计算供试品体内生物学活性. XIV)计算供试品体内生物学活性 部附录XIV)计算供试品体内生物学活性.
标准品溶液的制备 取人干扰素生物 学活性测定的国家标准品, 学活性测定的国家标准品,按说明书复 溶后,用测定培养液稀释至每lml lml含 溶后,用测定培养液稀释至每lml含 1000IU. 96孔细胞培养板中 孔细胞培养板中, 1000IU.在96孔细胞培养板中,做4倍 系列稀释, 个稀释度, 系列稀释,共8个稀释度,每个稀释度 在无菌条件下操作. 做2孔.在无菌条件下操作. 供试品溶液的制备 将供试品接标示 量溶解后,用测定培养液稀释成每1ml 量溶解后,用测定培养液稀释成每1ml 约含1000IU 1000IU. 96孔细胞培养板中 孔细胞培养板中, 约含1000IU.在96孔细胞培养板中,做 倍系列稀释, 个稀释度, 4倍系列稀释,共8个稀释度,每个稀释 度做2个孔.在无菌条件下操作. 度做2个孔.在无菌条件下操作.