实验二__小鼠脾细胞提取及计数

实验二小鼠脾细胞提取及计数

一、介绍本次实验整体情况（8：00－8：05，5分钟）：

本次实验的操作包括三部分：包被和封闭ELISA板、眼球取血、脾细胞的提取及计数。其中包被和封闭ELISA板以及眼球取血是为实验三ELISA实验做准备。

ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）酶联免疫吸附试验具体原理下次课讲解。

二、包被和封闭ELISA板：

备注：提前10分钟到实验室发放包被和封闭ELISA板所用试剂1. 讲解内容(8：05－8：15，10分钟)

包被和封闭ELISA板是为下一次实验酶联免疫吸附试验（ELISA）做准备。

包被就是将已知抗原或抗体吸附于固相载体表面并保持其免疫原性。在ELISA 板上加上抗原以后，因为电荷数与板不同，所以抗原吸附板上，但是吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙；

封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而防止在ELISA其后的步骤中干扰物质的再吸附。

下面介绍如何包被ELISA反应板及微量加样器使用注意事项。

（1）包被ELISA板：

1) 试剂和器材（老师已经在ELISA板上统一标记好）

a. pH9.6的碳酸盐缓冲液 ;

b. 绵羊红细胞抗原－SRBC;（a和b为包被液，实验室老

师已经配好）

c.聚乙烯塑料板，微量加样器

2) 操作方法

a. 包被液：碳酸盐缓冲液1：200 稀释抗原SRBC；

b. 聚乙烯塑料板：8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。

（2）微量加样器使用方法及注意事项(让学生自己操作一下，老师教学生看量程):

1) 量取样品时选择适当量程的加样器，（P20： 0.5～20.0

µl；P200： 20～200 µl； P1000：200～1000 µl）。老师结合不同型号的微量加样器，指导如何读数，白色由左至右读数，黑/蓝色由上至下读数。

2)转动旋钮，调整量取体积。顺时针旋转增加体积，逆时针

减少体积。禁止超出量程范围，否则会损坏加样器。若有

损坏需赔偿。

3)拇指操作加样器芯，其它四指弯曲握住加样器。

4)让学生了解不同量程的枪头（白色P20，黄色P200，蓝色

P1000），如果是无菌要求的实验还得注意无菌操作。

5)向下按加样器芯时会遇到两个阻力点。到达第一个阻力点

时为量取液体的体积。继续按会遇到第二个阻力点，只在

完全排出液体时使用。吸取液体时只需按到第一个阻力点。

6)吸取液体时将加样器芯按到第一阻力点，将枪头尖垂直浸

入液面约2～3mm，注意枪头不全部浸入液面，以免枪体接

触液面腐蚀枪体。注意不要让枪头口碰到容器底。缓慢松

开加样器芯，不能过快，否则倒吸入加样器内。吸入液体

后不能将微量加样器倒置。

7)吸取不同样品时必须更换枪头，加入液体时枪头要沿孔壁

缓慢将液体注入实验孔中。

2. 学生操作(8：15－8：25，10分钟)；注意：8：30前必须完成包被。

学生操作包被反应板，空白处标记，统一以学号做标记，收集一起，温箱2小时（8：25-10：25）。

8孔/2人，每孔加100ul包被液，37度恒温2小时。如果时间紧张，包被后温箱孵育可以缩减到1小时40分

二、眼球取血和脾细胞分离计数：

1. 讲解内容（8：25－8：50，25分钟）：

（1）眼球取血，血清分离（讲解后观看，观看眼球取血和颈椎脱位法处死小鼠以及取脾录像）：讲解前发小鼠至每桌。

1）目的：上次实验课小鼠腹腔抗原（SRBC）免疫后，血清内应产生抗体（抗SRBC抗体），本次实验课经眼球取血，收集血清，保存至下次实验课，待血清内抗体产生的检测。

2）操作：统一使用组号标记微量离心管。4人一组，每组一只小鼠（上次实验课免疫的小鼠）。左手抓住小鼠颈部皮肤（耳后皮毛），轻压在鼠笼上，要有一定的压力，左手食指尽量将小鼠眼周皮肤往颈后压，使眼球突出。用眼科弯镊深入眼球深部，带着结缔组织，慢速夹去眼球，用1.5ml微量离心管接住流出的血液。每次采血量1－2ml。实验台上静置2h（11点左右），离心10000rpm，10-15min，收集血清，-20℃保存待抗体水平检测。（2）脾细胞分离计数：

脾脏是动物体内最大的淋巴器官。深居于左侧肋弓之后，颜色暗红、质地柔软、呈内侧向内凹陷的扁椭圆形或条索状等。脾为表面有被膜覆盖的实体性器官。脾细胞主要成分：淋巴细胞，是执行免疫功能的重要细胞。为进一步了解和检测淋巴细胞的数量和功能，还需要制备脾细胞悬液。

本实验取脾目的：制备脾细胞悬液和测定脾细胞的数量。 1）试剂与器材：a. SRBC免疫一周的小鼠，每组一只小鼠；

b. PBS液(作用是等渗、平衡渗透压、维持离子强度和PH)。

c. 红细胞裂解液

d. 动物解剖器械（介绍器械包括平镊和齿镊）、注射器（5ml）、平皿、EP管、离心管、吸管、盖玻片。注意提醒学生动物解剖器械、注射器应及时清洗。

e. 离心机，细胞计数板，显微镜（使用

前登记）。

2) 实验步骤：

a. 将眼球取血后的小鼠颈椎脱位法处死。

b. 取脾：70%酒精皮毛全部浸湿3-5分

钟，右侧卧位；左手持镊（尖头）提起皮肤，右手持剪刀

于左侧肋骨最低点与髋关节间做一小切口；双手持镊子

与切口垂直方向钝性分离皮肤，暴露腹膜；左手持镊提起

腹膜右手持剪刀于腹膜做一小切口，双手持镊子与切口垂

直方向钝性分离腹膜，充分暴露视野，于左侧肋缘下可见

暗红色条索状脾脏；持平镊轻轻夹住脾脏，尽可能分离结

缔组织和系膜（注意防止脾脏破裂）；将取下的脾脏放入

5mlPBS液的平皿中。

c．制备脾细胞悬液：（学生取脾后讲解） d．脾细胞计数：10倍稀释脾细胞悬液；计数脾细胞；调整细胞浓度至2×l06/ml（C1V1=C2V2）（最后一次离心期间讲解）。

2.学生操作包括取鼠，准备器材，统一使用组号标记微量离心管用以收集眼球血，先眼球取血(四名同学相互合作，以免收集不到足够的血液)，颈椎脱位法处死小鼠，取脾后，让老师看一眼脾脏，将小鼠统一收上来（8：50－9：20，30分钟）。